張 樂，鄒 軍，田 風(fēng)，魏 曉，金 鑫

(廈門大學(xué) 醫(yī)學(xué)院，福建 廈門 361005)

油酰乙醇胺對血管緊張素Ⅱ誘導(dǎo)的血管平滑肌細(xì)胞增殖的影響

張 樂，鄒 軍，田 風(fēng)，魏 曉，金 鑫

(廈門大學(xué) 醫(yī)學(xué)院，福建 廈門 361005)

目的 研究油酰乙醇胺(OEA)對血管緊張素Ⅱ(AngⅡ)刺激大鼠主動(dòng)脈血管平滑肌細(xì)胞(VSMCs)增殖的抑制作用以及對p38信號通路的影響。方法 分離大鼠胸主動(dòng)脈，組織貼塊法培養(yǎng)VSMCs，AngⅡ刺激VSMCs建立細(xì)胞增殖模型，不同濃度OEA(5，10，20μmol/L)作用后，用溴脫氧核苷尿嘧啶(BrdU)摻入的方法檢測細(xì)胞增殖活性;流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞周期變化;Western-bolt法檢測對P-p38和p38蛋白表達(dá)的影響。結(jié)果 與AngⅡ組比較，隨著OEA濃度升高，VSMCs的增殖受到抑制、G0/G1比例顯著升高，G2/M比例顯著降低，且P-p38和p38蛋白的表達(dá)量降低并呈濃度依賴關(guān)系。結(jié)論 OEA對VSMCs的增殖有抑制作用，其機(jī)制可能是抑制了p38MAPK信號通路。

油酰乙醇胺;平滑肌細(xì)胞;增殖;p38;血管緊張素Ⅱ

血管平滑肌細(xì)胞(VSMCs)的增殖和遷移是血管再狹窄和動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)展形成過程中的重要部分［1］。過氧化增殖因子活化受體-α(PPAR-α)與動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生發(fā)展緊密相連，不僅是由于它跟脂質(zhì)代謝、糖類代謝密切相關(guān)，而且還由于其抗炎和抗增殖作用［2］。油酰乙醇胺(OEA)是一種天然的脂肪酸乙醇胺，已有研究表明，OEA是PPAR-α的一個(gè)高親和天然配體［3-4］。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，OEA可以通過激活PPAR-α受體從而發(fā)揮血管內(nèi)皮的保護(hù)［5］、腦缺血的保護(hù)［6］和抗炎等多種作用，但是對細(xì)胞增殖方面作用，尚未見報(bào)道。因此本實(shí)驗(yàn)的主要內(nèi)容是對OEA在動(dòng)脈粥樣硬化后期形成過程中主要的抗增殖作用進(jìn)行體外研究。

1 材料

OEA，自制;非諾貝特、血管緊張素Ⅱ(AngⅡ)、胰蛋白酶，美國Sigma公司;二甲亞砜，上海生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司;胎牛血清，新西蘭 Hyclone公司;低糖DMEM培養(yǎng)基，日本GIBCO公司;小鼠抗大鼠α-actin單克隆抗體，武漢博士德生物工程公司;溴脫氧核苷尿嘧啶(BrdU)標(biāo)記及檢測試劑盒，德國Roche公司;兔抗鼠Phospho-p38單克隆抗體、兔抗鼠p38單克隆抗體，美國Cell Signaling公司;鼠抗人β-actin單克隆抗體，美國Santa Cruz公司;羊抗兔二抗、羊抗鼠二抗，美國Muhisciences公司。

雄性SD大鼠，體重(100±5)g，上海斯萊克動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心，許可證號:SCXK(滬)2007-0005。

SpectraMax-M2多功能酶標(biāo)儀，美國 Molecular Devices公司;倒置熒光顯微鏡，日本 Nicon公司;FACSCal ibur型流式細(xì)胞儀，美國BD公司;Kodak IS4000R全自動(dòng)圖像工作站，美國Kodak公司。

2 方法

2.1 大鼠VSMCs的培養(yǎng)和鑒定

大鼠斷頭處死，無菌操作取一段胸主動(dòng)脈，洗去血液，去除外膜纖維脂肪組織，用眼科剪縱行剪開血管，刀片刮血管內(nèi)膜2～3遍，然后將血管切成約1 mm2大小碎片，分裝貼入培養(yǎng)瓶中，加入含10%小牛血清的DMEM培養(yǎng)基，倒置3～4 h后翻轉(zhuǎn)，于37℃，5%CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中靜置3 d，每2天換液。4～7 d平滑肌細(xì)胞從組織塊中爬出，2～3周出現(xiàn)致密細(xì)胞層。待細(xì)胞快融合時(shí)用0.25%胰蛋白酶消化傳代，取3～8代細(xì)胞做實(shí)驗(yàn)。在倒置顯微鏡下觀察及 α-actin單克隆抗體，通過免疫組化法鑒定VSMCs的特異性肌動(dòng)蛋白。

2.2 BrdU-ELISA 法檢測

以細(xì)胞數(shù)10 000/孔接種96孔板培養(yǎng)48 h后，觀察細(xì)胞生長狀態(tài)良好，換無血清培養(yǎng)液，24 h同步化后，加入不同濃度的 OEA(分別為 5，10及20 μmol/L)和非諾貝特100μmol/L，1 h后再加入AngⅡ100 nmol/L，共同培養(yǎng)24 h后，每孔加入BrdU 10 μL標(biāo)記細(xì)胞，37℃孵育2 h，棄培養(yǎng)液。經(jīng)60℃干燥1 h，F(xiàn)ixDenat固定液室溫固定30 min。棄固定液加入Anti-BrdU-POD液室溫放置90 min，吸棄抗體加洗滌工作液洗滌，每孔3次。加底物溶液100 μL，室溫放置30 min。每孔加終止反應(yīng)液(1 mol/L H2SO4)25μL，5 min內(nèi)自動(dòng)酶標(biāo)儀測定，λ(測)=450 nm，λ(參)=690 nm。

2.3 細(xì)胞周期測定

將細(xì)胞接種于6孔培養(yǎng)板，37℃孵育24 h后換無血清培養(yǎng)液，將細(xì)胞阻滯在G0/G1期。48 h后換2%低血清培養(yǎng)液，分為正常組、AngⅡ組、不同濃度的OEA組和非諾貝特組，將細(xì)胞置37℃繼續(xù)培養(yǎng)36 h，經(jīng)碘化丙錠染色后，用流式細(xì)胞儀自動(dòng)計(jì)數(shù)10 000個(gè)細(xì)胞，流式細(xì)胞儀測定細(xì)胞周期構(gòu)成比。

2.4 Western blotting 檢測

取VSMCs細(xì)胞，以細(xì)胞數(shù)1×105個(gè)/mL接種6孔板中，置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。細(xì)胞生長近融合后，棄上清液，以無血清高糖DMEM為空白對照，分別加入含不同濃度的OEA和非諾貝特培養(yǎng)基培養(yǎng)1 h后，AngⅡ刺激5 min，提取蛋白。用改良型RIPA細(xì)胞裂解液，冰浴裂解細(xì)胞30 min，BCA方法測定細(xì)胞總蛋白濃度，按常規(guī)方法進(jìn)行SDSPAGE凝膠電泳，轉(zhuǎn)膜并封閉后，分別加入P-p38、p38、GAPDH 單克隆抗體(1∶1 000)1 mL，4 ℃過夜。再加入二抗(1∶1 000)1 mL，室溫孵 1 h，洗膜、使用Kodak IS4000R全自動(dòng)圖像工作站，檢測、拍照，分析條帶灰度值。

2.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用 Graphpad Prism 5(GraphPad Software Inc，USA)軟件進(jìn)行分析，所有數(shù)據(jù)以(s)表示，兩組間樣本均數(shù)比較采用t檢驗(yàn)。

3 結(jié)果

3.1 OEA對AngⅡ誘導(dǎo)的VSMCs增殖的影響

不同濃度的OEA和非諾貝特作用1 h后，給予AngⅡ刺激，24 h后檢測細(xì)胞增殖，結(jié)果顯示OEA可以劑量依耐性抑制VSMCs增殖，并在20μmol/L濃度作用最好，見表1。

表1 OEA對AngⅡ誘導(dǎo)的VSMCs增殖的影響(n=6s)Tab.1 Effects of OEA on AngⅡ induced rat VSMCs proliferation(n=6s)

表1 OEA對AngⅡ誘導(dǎo)的VSMCs增殖的影響(n=6s)Tab.1 Effects of OEA on AngⅡ induced rat VSMCs proliferation(n=6s)

與 AngⅡ組比較:1P ＜0.05，2 P ＜0.011 P ＜0.05，2 P ＜0.01 vs AngⅡ group

?

3.2 OEA對AngⅡ誘導(dǎo)的VSMCs周期的影響

不同濃度的OEA和非諾貝特與AngⅡ共同作用36 h，可以影響VSMCs細(xì)胞周期分布使G0/G1期細(xì)胞比例增高，S期細(xì)胞比例降低，G2/M期比例降低，特別濃度在20μmol/L的OEA作用效果最好，與陰性對照組相比差異有顯著性(P＜0.05)，結(jié)果見表2。表明 OEA將平滑肌細(xì)胞細(xì)胞周期阻滯于G0/G1期，從而抑制平滑肌細(xì)胞增殖。

表2 OEA對VSMCs周期的影響(n=6s)Tab.2 Effects of OEA on cell cycle of VMSCs(n=6s)

表2 OEA對VSMCs周期的影響(n=6s)Tab.2 Effects of OEA on cell cycle of VMSCs(n=6s)

與 AngⅡ組比較:1 P ＜0.05，2 P ＜0.011 P ＜0.05，2 P ＜0.01 vs AngⅡ group

?

3.3 OEA對AngⅡ誘導(dǎo)的VSMCs P-p38和p38蛋白的影響

與對照組相比，AngⅡ誘導(dǎo)后 P-p38的表達(dá)明顯增加(P＜0.001)，加入 OEA，P-p38的表達(dá)呈一定的劑量依賴性減少，其中20μmol/L OEA對P-p38的下調(diào)作用最明顯，作用好于100μmol/L非諾貝特，見表3和圖1A。同樣，AngⅡ誘導(dǎo)后，p38的表達(dá)增加(P＜0.05)，給予OEA或非諾貝特干預(yù)后，p38的表達(dá)下調(diào)，見圖1B。

表3 OEA對VSMCs P-p38和p38蛋白表達(dá)的影響(n=4±s)Tab.3 Effects of OEA on protein expression of P-p38 and p38 in VMSCs(n=4±s)

表3 OEA對VSMCs P-p38和p38蛋白表達(dá)的影響(n=4±s)Tab.3 Effects of OEA on protein expression of P-p38 and p38 in VMSCs(n=4±s)

與 AngⅡ組比較:1 P ＜0.05，2 P ＜0.01，3 P ＜0.0011 P ＜0.05，2 P ＜0.01，3 P ＜0.001 vs AngⅡ group

?

4 討論

VSMCs異常增殖是許多心血管疾病的共同病理過程，在眾多促生長因子中，AngⅡ已成為當(dāng)前研究的熱點(diǎn)。AngⅡ是腎素-血管緊張素系統(tǒng)的主要活性物質(zhì)，與VSMCs上其1型受體(Angiotensin type 1 recepto r，AT1R)結(jié)合后，可經(jīng)絲裂原激動(dòng)蛋白激酶(mitogen activated protein kinase，MAPK)、核因子-B(NF-κB)等多條信號通路，啟動(dòng)VSMCs的增殖和遷移。其中p38MAPK信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路是MAPK通路一個(gè)重要分支，它在炎癥、應(yīng)激、凋亡、細(xì)胞周期和生長等多種生理和病理過程中發(fā)揮重要作用［7-9］。MKK3與MKK6是公認(rèn)的p38上級激酶，它們通過直接磷酸化絡(luò)氨酸、絲氨酸/蘇氨酸殘基激活p38，作用與 GADD153、c-myc等下游靶基因［10］，控制多種轉(zhuǎn)錄因子的基因表達(dá)活性，如激活作用轉(zhuǎn)錄因子、生長停滯及DNA損傷基因、核因子NF-κB等。

圖1 OEA對VSMCs中P-p38(A)和p38(B)蛋白表達(dá)的影響Fig.1 Effects of OEA on protein expression of P-p38(A)and p38(B)in VSMCs

OEA作為一個(gè)重要的體內(nèi)脂質(zhì)調(diào)節(jié)因子，通過激活PPAR-α起到調(diào)節(jié)脂質(zhì)、糖類代謝的作用。已有研究發(fā)現(xiàn)，PPAR-α可以抑制單核細(xì)胞轉(zhuǎn)化為巨噬細(xì)胞，抑制血管平滑肌細(xì)胞增殖和遷移，抑制泡沫細(xì)胞的形成等［11-12］。PPAR-α的激動(dòng)劑能夠調(diào)節(jié)p38MAPK信號通路上調(diào)PPAR-α表達(dá)，誘導(dǎo)VSMCs凋亡［13］。Gizard 等［14］認(rèn)為，PPAR-α 可以通過誘導(dǎo)細(xì)胞素依賴性激酶抑制子p16，阻斷細(xì)胞周期中G1到S期的轉(zhuǎn)變，抑制 VSMCs的增殖，這可能是PPAR-α影響動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生發(fā)展和再狹窄的進(jìn)程作用之一。本研究中，AngⅡ誘導(dǎo)VSMCs增殖周期從 G0/G1期向 S期、G2/M期轉(zhuǎn)化，刺激VSMCs增殖，同時(shí)增強(qiáng)P-p38和p38蛋白表達(dá)。然而，5～20μmol/L的OEA能夠阻止VSMCs向S期、G2/M期轉(zhuǎn)化，顯著抑制VSMCs增殖，降低P-p38和p38表達(dá)，且具有濃度依耐性。因此推測OEA能使細(xì)胞周期中靜止和分裂前期的細(xì)胞顯著增多，從而抑制VSMCs的增殖，且抗增殖的作用至少部分是由p38MAPK途徑表達(dá)介導(dǎo)，至于OEA參與p38MAPK信號通路表達(dá)的分子機(jī)制尚不清楚，有待進(jìn)一步研究。

綜上所述，OEA至少部分通過調(diào)節(jié)p38 MAPK信號通路，從而抑制AngⅡ誘導(dǎo)的VSMC增殖，發(fā)揮血管保護(hù)作用。本文加深對PPAR-α在動(dòng)脈粥樣硬化中作用的認(rèn)識(shí)，并為該藥的臨床應(yīng)用提供了理論依據(jù)。

［1］Schmidt-Ott K M，Kagiyama S，Phillips M I.The multiple actions of angiotensinⅡ in atherosclerosis［J］.Regul Peptides，2000，93(1-3):65-77.

［2］ Lefebvre P，Chinetti G，Stael B，et al.Sorting out the roles of PPAR-α in energy metabolism and vascular homeostasis［J］.J Clin Invest，2006，116(3):571-579.

［3］Fu J，Oveisi F，Gaetani S，et al.Oleoylethanolamide，an endogenous PPAR-α agonist，lowers body weight and hyperlipidemia in obese rats［J］.Neuropharmacology，2005，48(8):1147-1153.

［4］Guzman M，Lo V J，F(xiàn)u J，et al.Oleoylethanolamide stimulates lipolysis by activating the nuclear receptor peroxisome proliferator-activated receptor alpha(PPAR-alpha)［J］.J Biol Chem，2004，279(27):27849-27854.

［5］秦 文，金 鑫，陳彩霞，等.油酰乙醇胺對人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞血管細(xì)胞黏附分子-表達(dá)的影響［J］.中國生化藥物雜志，2008，29(6):374-377.

［6］楊立朝，楊武雙，周 宇，等.油酰乙醇胺對小鼠局灶性腦缺血的保護(hù)作用［J］.中國藥理學(xué)通報(bào)，2009(9):1219-1223.

［7］Bao X M，W u CF，Lu G P.Atorvastatin attenuates homocysteineinduced apoptosis in human umbilical vein endothelial cells via inhibiting NADPH oxidase-related oxidative stress-triggered p38 MAPK signaling［J］.Acta Pharmacol Sin，2009，30(10):1392-1398.

［8］Ho T C，Chen SL，Yang Y C，et al.Cytosolic phospholipase A2-alpha is an early apoptotic activator in PEDF-induced endothelial cell apoptosis［J］.Am J Physiol Cell Physiol，2009，296(2):C273-284.

［9］Wang X H，Xu B，Liu JT，et al.Effect of beta-escin sodium on endothelial cells pro liferation，migration and apoptosis［J］.Vascul Pharmacol，2008，49(4-6):158-165.

［10］ Enslen H，Raingeaud J，Davis RJ.Selective activation of p38 mitogen-activated protein(MAP)kinase isoforms by the MAP kinase kinases MKK3 and MKK6［J］.J Biol Chem，1998，273(3):1741-1748.

［11］ Zapolska Downal D，Siennicka A，Kaczmarczyk M，et al.Butyrate inhibits cytokine-induced VCAM-1 and ICAM-1 expression in cultured endothelial cells:the role of NF-κB and PPAR-α［J］.J Nutr Biochem，2004，15(4):220-228.

［12］ Wang Y，Wang Y，Yang Q，et al.Effects of bezafibrate on the expression of endothelial nitric oxide synthase gene and its mechanisms in cultured bovine endothelial cells［J］.Atherosclerosis，2006，187(2):265-273.

［13］ Diep Q N，Touyz R M，Schiffrin E L.Docosahexaenoic acid，a peroxisome proliferator-activated receptor-α ligand，induces apoptosis in vascular smooth muscle cells by stimulation of p38 mitogen-activated protein kinase hypertension［J］.2000，36(5):851-855.

［14］ Gizard F，Amant C，Barbier O，et al.PPARα inhibits vascular smooth muscle cell proliferation underlying intimal hyperplasia by inducing the tumor suppressor p16INK4a［J］.J Clin Invest，2005，115(11):3228-3238.

Inhibitory effect of oleoylethanolamide on proliferation of vascular smooth muscle cells induced by angiotensinⅡ

ZHANG Le，ZOU Jun，TIAN Feng，WEI Xiao，JIN Xin
(School of Medicine，Xiamen University，Xiamen 361005，China)

Purpose To investigate the inhibitory effect of oleoylethanolamide on the proliferation of cultured rat vascular smooth muscle cells(VSMCs)induced by angiotensinⅡand the effect on p38 signaling pathway.Methods VSMCs were primary cultured by tissue sticking method.Cell proliferation model was established by stimulation with AngⅡ.After incubation with various concentrations of OEA(5，10，20 μmol/L)for 24 h，the proliferation effect was measured by using the BrdU cell proliferation assay kit.Cell cycle distribution was determined by flow cytometry analysis and the protein expression of P-p38 and p38 was assessed using Western blotting.Results Compared with the AngⅡ group，along with the increased concentration of OEA，the proliferation of VSMCs was obviously inhibited，the cell ratio of G0/G1 phase obviously increased，and the cell ratio of G2/M phase significantly decreased.Besides，the expression of P-p38 and p38 protein decreased in a dose-dependent manner.Conclusion OEA had a inhibition on the proliferation of VSMCs，and might act by down-regulating p38MAPK pathway.

oleoylethanolamide;vascular smooth muscle cells;proliferation;p38;angiotensin Ⅱ

R285.5

A

1005-1678(2012)06-0709-04

2012-03-26

海峽(廈門)中醫(yī)藥科技平臺(tái)項(xiàng)目(3502Z20100006);廈門市科技計(jì)劃資助項(xiàng)目(3502Z20090009)

張 樂，女，碩士研究生;金 鑫，男，通信作者，教授，從事心血管藥理學(xué)研究，Tel:0592-2188676，Email:xinjin@xmu.edu.cn。