程速遠，王超眾，李 晶，梁成罡，楊昭鵬，王鳳山

(1.山東大學藥學院 生化與生物技術(shù)藥物研究所，山東 濟南 250012;2.中國食品藥品檢定研究院，北京 100050;3.齊齊哈爾市藥品檢驗所，黑龍江 齊齊哈爾 161006;4.沈陽藥科大學，遼寧 沈陽 110016)

注射用尖吻蝮蛇血凝酶含量測定方法研究

程速遠1，2，王超眾3，4，李 晶2，梁成罡2，楊昭鵬2，王鳳山1

(1.山東大學藥學院 生化與生物技術(shù)藥物研究所，山東 濟南 250012;2.中國食品藥品檢定研究院，北京 100050;3.齊齊哈爾市藥品檢驗所，黑龍江 齊齊哈爾 161006;4.沈陽藥科大學，遼寧 沈陽 110016)

目的 建立能夠準確反映注射用尖吻蝮蛇血凝酶蛋白質(zhì)含量的測定方法。方法 采用Lowry法、Bradford法、RP-HPLC法及AQC柱前衍生HPLC法四種方法測定注射用尖吻蝮蛇血凝酶蛋白質(zhì)含量并進行比較。結(jié)果Lowry法的測定結(jié)果明顯高于Bradford法，Bradford法測定結(jié)果與兩種液相色譜方法相當。結(jié)論 Lowry法由于賦形劑的干擾，測定結(jié)果偏高，不宜采用;柱前衍生HPLC法雖然靈敏度更高，但操作較繁瑣;Bradford法和RP-HPLC法可作為注射用尖吻蝮蛇血凝酶蛋白質(zhì)含量的測定方法。

注射用尖吻蝮蛇血凝酶;蛋白質(zhì);含量測定

尖吻蝮蛇血凝酶(Heamocoagulase Agkistrodon，HCA)是一種從我國特有蛇種尖吻蝮蛇(Deinagkistrodon acutus)毒液中提取分離出的蛇毒類凝血酶，由兩個亞基組成，含252個氨基酸殘基，分子質(zhì)量為29 kD［1-2］。注射用尖吻蝮蛇血凝酶(商品名:蘇靈)是第一個蛇毒類血凝酶類國家一類新藥，目前多項研究表明HCA具有較好的促進全血凝固和止血作用［3-4］。已經(jīng)完成臨床前和臨床Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ期試驗，正在進行Ⅳ期臨床研究［5-7］。

HCA具有很高的比活，臨床應(yīng)用中每次給藥劑量僅為1～2 u，僅相當于微克級的HCA，HCA制劑中含有大量(毫克級)與HCA分子質(zhì)量相近的低分子右旋糖酐作為保護劑和賦形劑，而HCA本身的含量很低(微克級)，因此，研究建立準確靈敏、操作簡便、專屬性和重現(xiàn)性好的效價或含量測定方法非常必要。目前，尚未見到注射用尖吻蝮蛇血凝酶中主藥含量的文獻報道，其質(zhì)量標準只對效價進行了規(guī)定。本文采用Lowry法、Bradford法、RP-HPLC法和6-氨基喹啉-N-羥基琥珀酰亞胺基甲酸酯(AQC)柱前衍生熒光檢測HPLC法對其蛋白質(zhì)含量測定進行了研究，為評價和控制制劑的質(zhì)量提供實驗依據(jù)。

1 儀器和試藥

島津2401型紫外可見分光光度計;Shimadzu LC-20AT系列高效液相色譜系統(tǒng)，配SPD-20A可調(diào)波長紫外可見分光光度檢測器;Shimadzu LC-10Atvp系列高效液相色譜系統(tǒng)，配RF-10AXL熒光檢測器;Kratos Axima-CFR Plus基質(zhì)輔助激光解吸飛行時間質(zhì)譜儀及 LAUNCHPAD系統(tǒng)工作站;Thermo RVT4104冷凍干燥機;Eppendorf centrifuge 5415D臺式離心機。

某企業(yè)生產(chǎn)的注射用尖吻蝮蛇血凝酶，1 u/支;尖吻蝮蛇血凝酶對照品(批號:140751-200601)，中國藥品生物制品檢定所;Folin酚試劑(Sigma公司，F(xiàn)-9252);考馬斯亮藍G-250，國藥集團化學試劑有限公司進口分裝;牛血清白蛋白(BSA)，北京欣經(jīng)科生物技術(shù)有限公司;右旋糖酐20，國藥集團化學試劑有限公司;乙腈為色譜純，其他試劑均為分析純，水為超純水。

2 方法

2.1 Lowry 法

2.1.1 標準曲線繪制 稱取BSA 20 mg，置100 mL量瓶中，加水溶解并稀釋至刻度，制得200μg/mL的BSA儲備液。分別取 BSA儲備液 0，0.025，0.05，0.10，0.15，0.20，0.40，0.60，0.80 和 1.0 mL，向其中分別加入水 1.0，0.975，0.95，0.90，0.85，0.80，0.60，0.40，0.20 和0 mL ，混勻，向 10 種不同濃度的的BSA溶液中各加入堿性銅試液1.0 mL，搖勻，各加入Folin酚試液 4 mL，依法測定［8］，繪制標準曲線。

2.1.2 注射用尖吻蝮蛇血凝酶蛋白質(zhì)含量測定取供試品1支，加水1 mL，使溶，依法測定。

2.2 Bradford 法

2.2.1 標準曲線繪制 稱取 BSA 100 mg，置100 mL量瓶中，加水溶解并稀釋至刻度，得到1 mg/mL的 BSA 儲備液。分別取 BSA 儲備液 0，1，2，4，6，8，10，20，40，60，80 和100 μL，向其中分別加入水100，99，98，96，94，92，90，80，60，40，20 和 0 μL，混勻。向12種不同濃度的BSA水溶液中各加入酸性染色液 5 mL，混勻，依法測定［8］，繪制標準曲線。

2.2.2 注射用尖吻蝮蛇血凝酶蛋白質(zhì)含量測定取樣品1支，加水100μL，使溶，加入酸性染色液5 mL，混勻，依法測定。

2.3 RP-HPLC 法

2.3.1 色譜條件 Vydac 208TP54-C8(5 μm，4.6 mm×250 mm)色譜柱，流動相 A為0.1%三氟乙酸，流動相 B 為乙腈-水(90∶10，含 0.1% 三氟乙酸);采用梯度洗脫:0～5 min流動相B 40%、5～30 min流動相B 40% ～100%、30～40 min流動相 B 100%、40 ～40.01 min流動相B 100% ～40%、40.01～55 min流動相B 40%;流速0.8 mL/min;柱溫:45℃;檢測波長:214 nm;進樣量:200μL。

2.3.2 對照品溶液 稱取對照品適量，加水溶解使?jié)舛葹? mg/mL，作為對照品儲備液，其他不同濃度的對照品溶液由儲備液稀釋得到。

2.3.3 供試品溶液 取注射用尖吻蝮蛇血凝酶6支，每支分別加適量水溶解，合并，混勻即得。

2.3.4 空白輔料溶液 稱取右旋糖酐1.0 g，置100 mL量瓶中，加水溶解并稀釋至刻度，即得。

2.4 AQC柱前衍生HPLC法

2.4.1 色譜條件 色譜柱為 Phenomenex Jupiter C18柱(250 mm × 4.6 mm，5 μm)。溶液 A:乙酸鈉16.4 g，四乙基氯化銨(TEA)1.72 g ，乙二胺四乙酸鈉(EDTA)1.0 mg，溶于1 000 mL水中，以磷酸調(diào)節(jié)pH至4.95。溶液B為溶液 A-乙腈(60∶40)。流動相為溶液 A-溶液 B(88∶12);流速:1.0 mL/min;柱溫:30℃，進樣量:20μL;檢測器為熒光檢測器(FD)，激發(fā)波長為250 nm，檢測波長為395 nm。每測定一個樣品后，須以溶液B沖洗10 min，再以流動相平衡15 min。

通過系統(tǒng)的行為養(yǎng)成，員工規(guī)范操作意識得到增強，文明規(guī)范的操作行為廣為普及，在全公司范圍內(nèi)形成人人遵守安全規(guī)則、人人執(zhí)行安全操作規(guī)程、人人養(yǎng)成規(guī)范的安全作業(yè)行為的氛圍。

2.4.2 對照品溶液 精密吸取 HCA對照品溶液(1.0 mg/mL)1 mL，置500 mL量瓶中，加水至刻度，為對照品儲備液(2μg/mL)。精密吸取儲備液5 mL，置50 mL量瓶中，加水至刻度，作為對照品溶液(200 ng/mL)。

2.4.3 供試品溶液 取注射用尖吻蝮蛇血凝酶(1 u)1支，用水溶解，并稀釋至10 mL。

2.4.4 空白輔料溶液 配制方法同2.3.4。

2.4.5 衍生化方法 取樣品溶液40μL置于1.5 mL樣品管中，加入0.1 mol/L SDS溶液10μL，95℃加熱10 min，取出冷至室溫后，加入標記反應(yīng)緩沖液(0.2 mol/L 硼酸緩沖液，pH 8.8)110 μL，混勻，再加入10μmol/L AQC乙腈溶液40μL，密塞，渦旋振蕩30 s，室溫放置2 min，55℃加熱10 min，取出冷卻至室溫，供測定用。

2.4.6 MALDI-TOF-MS測定 N2激光源;發(fā)射波長337 nm;飛行管長1.2 m;操作模式:為正離子線性模式;加速電壓20 kV;時間延遲98 ns。吸取脫鹽后的樣品0.5μL與SA基質(zhì)溶液0.5μL混合后，滴加到不銹鋼靶板上，室溫下晾干后即可進行測定。

3 結(jié)果和討論

3.1 蛋白質(zhì)含量測定結(jié)果

Lowry法、Bradford法、RP-HPLC法和AQC柱前衍生HPLC法四種方法測定注射用尖吻蝮蛇血凝酶的線性回歸方程、線性范圍以及測定結(jié)果見表1。從表1可以看出，Lowry法測得的結(jié)果遠遠高于其他三種方法，因為Lowry法的測定原理是蛋白質(zhì)與堿性硫酸銅作用形成銅-肽鍵絡(luò)合物，后者與色氨酸和酪氨酸共同作用使酚試劑中的磷鉬酸和磷鎢酸還原生成藍色化合物。但是此法干擾物質(zhì)較多，還原物質(zhì)、酚類、甘露醇、糖類、甘油等均有干擾作用。因為HCA制劑中含有大量的右旋糖酐，大大干擾Lowry法的測定，使得測定結(jié)果顯著偏高。

表1 Lowry法、Bradford法、RP-HPLC法及AQC柱前衍生HPLC法對注射用尖吻蝮蛇血凝酶蛋白含量測定結(jié)果(n=3)Tab.1 The values of protein content of Haemocoagulase Agkistrodon for injection determined by Lowry s，Bradford s，RP-HPLC and AQC pre-column derivatization HPLC(n=3)

3.2 RP-HPLC法色譜條件的優(yōu)化

在波長200～400 nm范圍內(nèi)對尖吻蝮蛇血凝酶對照品溶液進行掃描，可以看到其在214和280 nm處有最大吸收，前者是因肽鍵存在引起的最大吸收，而后者是因蛋白質(zhì)含色氨酸殘基和酪氨酸殘基，其分子內(nèi)部存在著共軛雙鍵引起的最大吸收。同時分別考察了214及280 nm處對照品濃度從2.5～100 μg/mL的線性關(guān)系。214 nm處的響應(yīng)值約為280 nm處的5倍，214 nm處的線性范圍為2.5～30μg/mL，30μg/mL以上的濃度在線性回歸曲線上呈拋物線;280 nm處的線性范圍為2.5～100μg/mL，線性范圍更寬。綜合考慮靈敏度和線性范圍，選取214 nm作為測定波長。

因為尖吻蝮蛇血凝酶制劑中HCA本身的含量很低，所以測定時將6支復溶后合并，并且為了提高其靈敏度還加大了進樣體積，進樣量為200μL。

同時比較了不同色譜柱(C18柱、C8柱和C4柱)對注射用尖吻蝮蛇血凝酶的分離效果。C18柱色譜峰形不正常，C4柱分離效果沒有C8柱好，主峰與降解雜質(zhì)的分離度不能達到1.2，而C8柱卻能將主峰與降解雜質(zhì)很好的分離，分離度大于1.5。根據(jù)尖吻蝮蛇血凝酶的相對分子質(zhì)量(Mr)大小和性質(zhì)，最終選用C8柱進行測定。色譜圖見圖1。

圖1 RP-HPLC法HCA對照品色譜圖Fig.1 RP-HPLCchromatograms of HCA STD

3.3 AQC柱前衍生HPLC法衍生條件的優(yōu)化

AQC是一種性能優(yōu)良的熒光衍生化試，能與伯氨基和仲氨基反應(yīng)，迅速生成發(fā)射熒光的高穩(wěn)定性的脲，該衍生物在室溫一周內(nèi)基本穩(wěn)定。HCA分子中具有20個可能的衍生化位點，包括一個N端氨基和19個賴氨殘基的氨基。為使所有的位點都能夠與AQC反應(yīng)，在進行衍生化之前需用SDS處理樣品以使HCA分子的空間結(jié)構(gòu)打開，衍生化位點得以暴露，以方便其與AQC接觸反應(yīng)。

此外，參照文獻報道的AQC的衍生化條件，以相同濃度的HCA樣品在不同衍生化條件下反應(yīng)后，HPLC分析的色譜峰面積為判斷指標，對AQC衍生化HCA的條件(包括AQC濃度和反應(yīng)的pH值)進行了優(yōu)化，結(jié)果表明，反應(yīng)在 pH 8.0的0.2 mol/L硼酸鹽緩沖液中進行，AQC濃度為2 mmol/L時可獲得最佳反應(yīng)產(chǎn)率。

為確認是否20個衍生化位點全部發(fā)生衍生化反應(yīng)，對衍生前后的HCA進行了 MALDI-TOF-MS測定Mr。結(jié)果表明，衍生前 Mr為29 202，衍生后Mr為32 603，相差3 401，分子中增加了一個AQC的Mr(170)，故3 401/170=20.0，與理論推測一致，所以在上述衍生化條件下，HCA的20個位點得到了充分衍生。色譜圖見圖2。

圖2 AQC柱前衍生HPLC法HCA對照品色譜圖Fig.2 AQC pre-column derivatization HPLC chromatograms of HCA STD

4 結(jié)論

本文采用了四種方法測定注射用尖吻蝮蛇血凝酶的含量，除Lowry法由于賦形劑干擾太大，測定結(jié)果大大偏高，其余三種方法結(jié)果相近，AQC柱前衍生HPLC法雖然靈敏度更高，但操作較繁瑣。因此，考慮到操作方便性及方法的成熟性，Bradford法和RP-HPLC法可選擇一種作為含量測定方法。若無相應(yīng)對照品，則采用Bradford法，但在有國家對照品的情況下建議采用RP-HPLC方法，因為與BSA相比，HCA國家對照品與制劑中的HCA具有同質(zhì)性，測定結(jié)果更為準確可靠。

本文通過此四種方法的比較，建立了注射用尖吻蝮蛇血凝酶含量測定的方法，為含量與活性的相關(guān)研究以及臨床使用劑量的有效控制提供了實驗依據(jù)。本文同時對于其它的蛇毒類血凝酶在蛋白質(zhì)含量測定方法選擇時具有一定的參考價值。

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［8］中國藥典［M］.二部.2010:附錄54.

Study on the method for the content determination of Haemocoagulase Agkistrodon for injection

CHENG Su-yuan1，2，WANG Chao-zhong3，4，LI Jing2，LIANG Cheng-gang2，YANG Zhao-peng2，WANG Feng-shan1
(1.Institute of Biochemical and Biological Drugs，School of Pharmaceutical Sciences，Shandong University，Jinan 250012，China;2.National Institute for Food and Drug Control，Beijing 100050，China;3.Qiqihaer Institute for Drug Control，Qiqihaer 161006，China;4.Shenyang Pharmaceutica University，Shenyang 110016，China)

Purpose To select a suitable method for the determination of protein content in Haemocoagulase Agkistrodon for injection.Methods Four methods including Lowry's，Bradford's，RP-HPLC and 6-aminoquinolyl-N-hydroxysuccinimidyl carbamate(AQC)pre-column derivatization HPLC were compared in determining the protein content of Haemocoagulase Agkistrodon for injection.Results The values of proteins content in Haemocoagulase Agkistrodon for injection by Lowry's method were significantly higher than those by Bradford's method，while the results of the two HPLC methods were almost equal to Bradford's method.Conclusion Because of the interference of excipients，the results were much higher when using Lowry's method.Although the AQCpre-column derivatization HPLC method was much more sensitive，but the operation is relatively complex.Both Bradford's method and RP-HPLC method can be selected as the protein content determination method of Haemocoagulase Agkistrodon for injection.

Haemocoagulase Agkistrodon for injection;protein;determination

R927.2

A

1005-1678(2012)06-0750-04

2012-02-15

中國食品藥品檢定研究院中青年基金項目資助(No.2010A)

程速遠，女，博士研究生，研究方向:生化藥品及基因工程藥物分析;楊昭鵬，男，通信作者，研究員，E-mail:yangzp@nifdc.org.cn; 王鳳山，男，通信作者，教授，E-mail:fswang@sdu.edu.cn。