張繼平

抑癌基因WWOX和p53在結(jié)直腸癌中的表達(dá)及臨床意義

張繼平

目的：探討WWOX和p53基因在結(jié)直腸癌組織中的表達(dá)情況、與臨床病理參數(shù)的關(guān)系及兩者表達(dá)的相關(guān)性。方法：采用免疫組織化學(xué)染色法(SP法)檢測(cè)對(duì)照組正常結(jié)直腸組織25例、結(jié)直腸癌組織45例中WWOX和P53蛋白的表達(dá)情況，分析兩者的表達(dá)與患者年齡、性別及癌組織的病理參數(shù)包括腫瘤大小、浸潤(rùn)深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的關(guān)系，以及兩者表達(dá)的相關(guān)性。結(jié)果：WWOX蛋白在癌組織中陽(yáng)性表達(dá)明顯降低，與正常組織比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05)，P53(突變型)蛋白在癌組織中較正常結(jié)直腸組織中陽(yáng)性表達(dá)率高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。無(wú)論WWOX，還是P53蛋白的陽(yáng)性表達(dá)率，在不同癌組織學(xué)分化程度、浸潤(rùn)深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況、生存期分類的患者結(jié)直腸癌組織差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05或P<0.01），而在不同性別、年齡、腫瘤大小分類患者差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；WWOX與p53基因的表達(dá)呈負(fù)相關(guān)（r=-0.388，P=0.008）。結(jié)論：WWOX和p53（野生型）同為抑癌基因，檢測(cè)兩者的表達(dá)對(duì)于結(jié)直腸癌的臨床診斷及預(yù)后判斷有重要意義。

結(jié)直腸腫瘤 癌 基因,p53 免疫組織化學(xué) 病理學(xué),臨床 WWOX

結(jié)直腸癌的發(fā)病率居我國(guó)消化道惡性腫瘤前列，且有逐年增高的趨勢(shì)[1]。結(jié)直腸癌的病因尚未完全清楚，其發(fā)生涉及由眾多環(huán)境因素、遺傳因素構(gòu)成的多階段、多因素復(fù)雜的病因鏈，涉及多種癌基因的激活、抑癌基因的失活以及由此引起的細(xì)胞生物學(xué)行為的改變等。各種基因通過(guò)相互作用，共同參與腫瘤的發(fā)生發(fā)展。本研究通過(guò)檢測(cè)結(jié)直腸癌中WWOX、p53的表達(dá)情況，探討其與結(jié)直腸癌發(fā)生發(fā)展的關(guān)系。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取我院2005年3月—2010年12月通過(guò)手術(shù)及內(nèi)鏡活檢結(jié)腸癌組織及癌旁黏膜標(biāo)本共70例。依據(jù)病理檢查結(jié)果分為2組：結(jié)直腸癌組45例，所有患者術(shù)前（或組織活檢前）均未接受放療或化療；正常對(duì)照組25例，正常黏膜組織取自腫瘤切緣≥5 cm處，經(jīng)病理學(xué)檢查取材干凈，無(wú)癌細(xì)胞浸潤(rùn)。結(jié)直腸癌組男33例，女12例，年齡32~83歲，平均年齡（67±2）歲，＞ 60歲者30例，≤60歲者15例；腫瘤直徑<4 cm者28例，＞4 cm者17例；分化程度為高分化6例，中分化19例，低分化腺癌20例；浸潤(rùn)深度為T1期2例，T2期14例，T3期6例，T4期23例，因T1、T3期較少，將T1、T2合并為T1+T2(侵及黏膜、黏膜下或肌層)共16例，T3、T4合并為T3+T4(侵及漿膜層和侵出漿膜層)共29例；有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者24例，無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者21例。生存期監(jiān)測(cè)中為了排除組織學(xué)類型及治療方法不同對(duì)預(yù)后的影響，選取其中同一組織學(xué)類型及相同治療方法并有完整臨床隨訪資料的病例，生存期的計(jì)算是從手術(shù)日期起到隨訪日期或由于復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移而死亡的日期，隨訪主要采用電話、門診獲得，失訪者和非癌死亡者未納入本組病例，本組5年生存率57.7%。

1.2 主要試劑與儀器 主要免疫組化試劑：兔抗人P53單克隆抗體購(gòu)至北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司，兔抗人WWOX多克隆抗體、通用型二步法免疫檢測(cè)試劑盒PV-6000（抗兔）、DAB顯色盒購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司，即用型SABC免疫組化染色試劑盒購(gòu)自武漢博士德生物工程有限公司。主要儀器設(shè)備包括包埋機(jī)、病理切片機(jī)、恒溫水浴箱、顯微鏡及照相裝置等。

1.3 方法

1.3.1 WWOX與P53免疫組織化學(xué)染色 標(biāo)本常規(guī)固定、包埋、切片等，采用免疫組織化學(xué)SP法按試劑盒使用說(shuō)明書(shū)進(jìn)行檢測(cè)，WWOX兔抗人多克隆抗體稀釋濃度為1∶300。用免疫組化方法檢測(cè)的P53蛋白是突變型，P53鼠抗人單克隆抗體稀釋濃度為1∶100。染色步驟嚴(yán)格按照說(shuō)明書(shū)進(jìn)行，以PBS液代替一抗作為陰性對(duì)照。

1.3.2 免疫組化結(jié)果判斷 （1）WWOX蛋白染色以腺體細(xì)胞漿內(nèi)出現(xiàn)黃色顆粒為陽(yáng)性，按照Hao等[2]推薦的方法觀察WWOX在結(jié)直腸癌中的表達(dá)情況及分布，陽(yáng)性強(qiáng)度、缺失強(qiáng)度和陽(yáng)性率。先按染色強(qiáng)度打分，0分為無(wú)色，1分為淡黃色，2分為棕黃色，3分為棕褐色，染色強(qiáng)度需與染色背景相對(duì)比，再按陽(yáng)性細(xì)胞百分比打分，0分為0~5%，1分為6%~25%，2分為26%~50%，3分為51%~75%，4分為75%以上。以上述兩項(xiàng)之積，0~4分為蛋白表達(dá)缺失或降低(陰性)，5~12分為中、高度陽(yáng)性表達(dá)(陽(yáng)性)。（2）P53蛋白陽(yáng)性信號(hào)定位于細(xì)胞核，為黃至棕褐色顆粒，且其著色強(qiáng)度高于背景非特異性染色者判定為陽(yáng)性。判斷結(jié)果參照1996年全國(guó)免疫組織化學(xué)技術(shù)與診斷標(biāo)準(zhǔn)化專題研討會(huì)意見(jiàn)[3]，以連續(xù)觀察10個(gè)高倍視野(×400)，免疫反應(yīng)陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)超過(guò)25%作為組織陽(yáng)性診斷標(biāo)準(zhǔn)。標(biāo)準(zhǔn)定級(jí)為：無(wú)陽(yáng)性著色細(xì)胞為陰性(-)，陽(yáng)性著色細(xì)胞<25%為弱陽(yáng)性(+)，陽(yáng)性著色細(xì)胞25%~50%為陽(yáng)性(++)，陽(yáng)性著色細(xì)胞>50%為強(qiáng)陽(yáng)性(+++)。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件包進(jìn)行處理，計(jì)數(shù)資料的比較采用χ2檢驗(yàn)；WWOX和P53蛋白表達(dá)的相關(guān)性分析用Spearman等級(jí)相關(guān)；以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 免疫組化結(jié)果 （1）WWOX蛋白陽(yáng)性染色主要位于細(xì)胞胞漿中，呈深黃色彌漫性分布，間質(zhì)細(xì)胞亦可見(jiàn)散在部分表達(dá)。WWOX蛋白陽(yáng)性在正常結(jié)直腸黏膜腺體細(xì)胞中染色較強(qiáng)，在癌組織中黏膜腺體細(xì)胞染色較弱。WWOX蛋白在正常對(duì)照組和結(jié)直腸癌組中的陽(yáng)性表達(dá)率分別為76.00%（19/25）和33.33%（15/45），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=11.71，P<0.01）。（2）P53蛋白主要分布在胞核，細(xì)胞胞漿中也有少量表達(dá)，呈棕黃色顆粒者為陽(yáng)性。P53蛋白在正常結(jié)直腸黏膜中低表達(dá)，在結(jié)直腸癌中染色較強(qiáng)。P53蛋白在正常對(duì)照組和結(jié)直腸癌組中的陽(yáng)性表達(dá)率分別為16.00%（4/25）和68.88%（31/45），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=17.98，P<0.01）。

2.2 WWOX和P53蛋白表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系 不同組織分化程度、浸潤(rùn)深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、生存期分類結(jié)直腸癌患者WWOX和P53陽(yáng)性表達(dá)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P<0.05）；不同年齡、性別、腫瘤直徑分類患者WWOX和P53陽(yáng)性表達(dá)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P>0.05），見(jiàn)表1。

Table 1 Comparison of positive expression of WWOX and P53 between different clinical pathological characteristic groups of colorectal cancer表1 不同臨床病理特征結(jié)直腸癌組織WWOX、P53陽(yáng)性表達(dá)情況比較 （例）

2.3 結(jié)直腸癌組織中WWOX和P53蛋白表達(dá)的相關(guān)性 結(jié)直腸癌組織中WWOX和P53表達(dá)呈負(fù)相關(guān)（rs=-0.388，P ＜ 0.05），見(jiàn)表2。

Table 2 Correlation of positive expression of WWOX and P53 in colorectal cancer表2 WWOX和P53在結(jié)直腸癌中陽(yáng)性表達(dá)的相關(guān)性

3 討論

癌基因的激活和抑癌基因的失活是近年來(lái)腫瘤研究中的熱點(diǎn)，其中抑癌基因的失活是重要的致癌因素。WWOX基因是一種候選抑癌基因，定位于人類染色16q23.3-24.1，跨越了整個(gè)常見(jiàn)染色體脆性位點(diǎn)FRA16D，編碼的蛋白質(zhì)包含氨基端的2個(gè)WW結(jié)構(gòu)域和羧基末端的1個(gè)短鏈脫氧/還原酶結(jié)構(gòu)域(SDR)。WWOX編碼的蛋白質(zhì)在腫瘤壞死因子(TNF)誘導(dǎo)的凋亡中是一個(gè)非常重要的中介，并與P53共同調(diào)節(jié)細(xì)胞的凋亡。研究證實(shí)，WWOX在胃癌、食管癌、胰腺癌等癌組織中存在著表達(dá)缺失或低表達(dá)[4-5]。

人類p53基因是一個(gè)非常重要的抑癌基因。p53基因具有進(jìn)化保守性，是細(xì)胞生長(zhǎng)重要的負(fù)調(diào)節(jié)因子。當(dāng)p53基因發(fā)生突變時(shí)，可喪失正?；钚裕种萍?xì)胞凋亡，并且促進(jìn)細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化，侵襲力增強(qiáng)，使p53基因由抑癌基因轉(zhuǎn)為原癌基因。正常細(xì)胞中P53蛋白是無(wú)突變的野生型P53蛋白，具有腫瘤生長(zhǎng)抑制功能，因其半衰期較短，不易被檢測(cè)，用免疫組化方法檢測(cè)的是突變型P53蛋白。目前發(fā)現(xiàn)肝癌、乳腺癌、膀胱癌、胃癌、結(jié)腸癌等多種惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展均與p53基因突變有關(guān)[6-7]。

WWOX蛋白與P53蛋白同為促凋亡蛋白，在介導(dǎo)凋亡中發(fā)揮協(xié)同作用。WWOX基因是P53介導(dǎo)凋亡必不可少的配偶體。在應(yīng)激凋亡中，活化的WWOX蛋白、P53、JNKl常形成異源三聚體而共同發(fā)揮作用。WWOX基因在多種消化道腫瘤如食管癌、胃癌、結(jié)直腸癌等組織中表達(dá)降低或缺失，而p53基因(突變型)的表達(dá)則明顯增高，兩者的表達(dá)呈負(fù)相關(guān)[8]。WWOX發(fā)揮其正常的生物學(xué)行為、抑制腫瘤過(guò)程中均與p53有關(guān)，p53對(duì)大腸癌發(fā)生轉(zhuǎn)移過(guò)程中WWOX起著調(diào)控和（或）協(xié)同作用。本研究結(jié)果顯示W(wǎng)WOX與p53（突變型）基因的表達(dá)呈負(fù)相關(guān)，提示正常p53（野生型）基因的突變與WWOX基因的表達(dá)降低或失活在大腸癌的發(fā)生、浸潤(rùn)和轉(zhuǎn)移中起著協(xié)同作用。

本研究結(jié)果表明，WWOX基因在結(jié)直腸癌組織中陽(yáng)性表達(dá)率明顯低于癌旁正常組織，突變型p53基因在結(jié)直腸癌組織中陽(yáng)性表達(dá)率明顯高于癌旁正常組織，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，提示W(wǎng)WOX和p53（野生型）基因同作為抑癌基因，起到抑制腫瘤生長(zhǎng)的作用，其可能作為一種新型腫瘤標(biāo)志，有助于結(jié)直腸癌的診斷。與其他研究結(jié)果[8]相似，組織分化程度越差、浸潤(rùn)越深、伴有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、生存期短者WWOX蛋白表達(dá)就越低，突變型P53蛋白表達(dá)率越高，反之亦然，提示W(wǎng)WOX和P53表達(dá)情況可能有助于判斷腫瘤的惡性程度、進(jìn)展及術(shù)后生存情況。WWOX和P53蛋白（突變型）表達(dá)呈負(fù)相關(guān)，提示腫瘤的發(fā)生、發(fā)展涉及多基因的改變，WWOX表達(dá)降低或缺失與p53基因的突變?cè)诮Y(jié)直腸癌的發(fā)生、浸潤(rùn)和轉(zhuǎn)移過(guò)程中可能起著協(xié)同或調(diào)控作用，兩者可能存在某種未知的通路。

[1]張維全,雷正龍,李光琳,等.中國(guó)腫瘤登記地區(qū)2006年腫瘤發(fā)病和死亡資料分析[J].中國(guó)腫瘤,2010,19(6):356-365.

[2]Hao XP,Joseph EW,Thomas GP,et al.Loss of fragile histidine triad expression in colorectal carcinomas and premalignant lesions[J].Cancer Res,2000,60(60)：8-21.

[3]中華病理學(xué)雜志編輯委員會(huì).全國(guó)免疫組織化學(xué)技術(shù)與診斷標(biāo)準(zhǔn)化專題研討會(huì)會(huì)議紀(jì)要[J].中華病理學(xué)雜志,1996,25（6）:326-328.

[4]Aqeilan RI,Kuroki T,Pekarsky Y,et al.Loss of WWOX Expression in Gastric Carcinoma[J].Clini Cancer Res,2004,10(9):3053-3058.

[5]Nakayama S,Semba S,Maeda N,et al.Hypermethylation-mediated reduction of WWOX expression in intraductal papillary mucinous neoplasms of the pancreas[J].Br J Cancer,2009,100(9):1438-1443.

[6] Takeba Y,Kumai T,Matsumoto N,et al.Irinotecan activates p53 with its active metabolite,resulting in human hepatocellular carcino?ma apoptosis[J].J Pharmacol Sci,2007,104(3):232-342.

[7]Bau DT,Tsai LH,Lo YL,et a1.Association of p53 and p21(CD?KN1A/WAFl/CRP1)polymorphisms with oral cancer in Taiwan pa?tients[J].Anticancer Res,2007,27(3B):1559-1564.

[8]張?jiān)撇?曲華,王鳳安.WWOX及P53基因在大腸癌中的表達(dá)及與腫瘤浸潤(rùn)的關(guān)系[J].河北醫(yī)藥,2010,32(21):2959-2961.

Expression and Clinical Significance of WWOX and p53 Genes in Colorectal Carcinoma Tissues

ZHANG Jiping

General Hospital of China National Offshore Oil Corporation,Tianjin 300452,China

Objective:To investigate expressions of WWOX and p53 genes in colorectal cancer，and to discuss the cor?relation between WWOX,p53 expressions and clinical pathological parameters．Methods:The expressions of WWOX and p53 were detected by immunohistochemical staining methods in 45 samples of colorectal cancer and 25 samples of normal tis?sues.The relationship between levels of these proteins with age,gender,tumor size，infiltration depth and lymph nodes metas?tasis were analyzed.Results:The positive rate of WWOX proteins was significantly lower in colorectal cancer than that in normal tissue group(P<0.05).While there was a significantly higher positive rate of P53（mutant type）protein in colorectal cancer than that in normal tissue group(P<0.05).The positive rates of WWOX and P53 expression were closely correlated with histological grade，infiltration depth，lymph node metastasis and 5-year survival(P<0.05)．There was no significant dif?ference between age,gender and carcinoma size(P>0.05).The expression of WWOX and p53 genes demonstrated signifi?cantly negative relation(r=-0.388，P=0.008).Conclusion:WWOX and p53(wild type)genes are all tumor suppressor genes.The joint investigation of expression has more important significance in clinical diagnosis and prognosis judgment．

colorectal neoplasms carcinoma genes,p53 immunohistochemistry pathology,clinicalWWOX

10.3969/j.issn.0253-9896.2012.08.011

300452 海洋石油總醫(yī)院消化內(nèi)科

（2011-07-19收稿 2012-02-07修回）

（本文編輯 李國(guó)琪）

短篇與病例報(bào)告