王觀馮 陳文偉* 洪 瑤 黃光榮 包 凱 王 智

（中國計量學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院，杭州 310018）

蝦加工副產(chǎn)物酶解工藝研究*

王觀馮**陳文偉***洪 瑤 黃光榮 包 凱 王 智

（中國計量學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院，杭州 310018）

通過比較不同的水解酶水解蝦加工副產(chǎn)物的效率，確定堿性蛋白酶為水解蝦加工副產(chǎn)物用酶?？疾炝肆弦罕取r間、溫度、起始pH值、酶添加量對蛋白提取率的影響，確定最優(yōu)的酶解工藝條件為：酶添加量為蝦粉質(zhì)量的0.8%、溫度60℃、料液比4 g∶100 mL、起始pH9.0、時間2.0 h、蛋白提取率為65.3%。

酶解；蝦加工副產(chǎn)物；蛋白

我國擁有豐富的海洋漁業(yè)資源，蝦類是重要的海產(chǎn)品，大部分都被用來加工成蝦仁，加工過程中產(chǎn)生了大量的蝦頭、蝦殼等副產(chǎn)物，其中蝦頭中約含蛋白質(zhì)42.1 g/100 g，是蛋白質(zhì)的豐富來源。目前這些副產(chǎn)物，大部分沒有被充分利用，直接廢棄，只有小部分通過壓榨、烘干加工成蝦粉，產(chǎn)品的附加值很低，并且蝦粉加工后產(chǎn)生的廢水和廢棄的下腳料會對環(huán)境造成了嚴(yán)重污染。

以蝦加工副產(chǎn)物為原料，通過外加蛋白酶，在溫和的條件下控制水解進程，可以得到含豐富氨基酸、多肽、蛋白質(zhì)的水解液。目前，各種水解動物蛋白已大量應(yīng)用于方便、休閑、營養(yǎng)和強化食品之中。由于肽類和氨基酸是熱反應(yīng)風(fēng)味的前體物質(zhì)，且其中一些氨基酸也是Maillard羰氨反應(yīng)和Strecker降解反應(yīng)產(chǎn)生特殊風(fēng)味化合物的重要活性中間體，因此該水解液可作為反應(yīng)型調(diào)味料的基料。本試驗從5種蛋白酶中選擇水解效率最高的酶，并對其水解工藝進行研究，為蝦加工副產(chǎn)物中蛋白的回收利用提供依據(jù)。

1 .材料和方法

1.1 試驗材料

蝦副產(chǎn)物，市售的蝦剝?nèi)ノr肉后的蝦頭、蝦殼和蝦腳的混合物；堿性蛋白酶、中性蛋白酶、胰蛋白酶，購于無錫市雪梅酶制劑科技有限公司；風(fēng)味蛋白酶、復(fù)合蛋白酶，購于諾維信公司。

1.2 主要試劑

磷酸二氫鈉、十二水合磷酸氫二鈉、硼砂、鹽酸、酒石酸鉀鈉等均為分析純；福林酚試劑，購于上海荔達生物科技有限公司。

1.3 主要儀器和設(shè)備

ZHWY-110X50型水浴搖床、85-2型恒溫磁力攪拌器、KDY-9820型凱氏定氮儀、UV-1200型紫外-可見分光光度計。

1.4 試驗方法

1.4.1 樣品前處理

蝦頭、蝦殼、蝦腳的混合物置于鼓風(fēng)干燥箱中105℃烘干24 h，冷卻后使用超微粉碎機粉碎，過100目篩，裝于保鮮袋中，避光防潮保存。

1.4.2 酶解液制備

稱取一定量的蝦粉，加入緩沖液和一定量的水解酶，恒溫水浴酶解一定時間后于沸水浴中滅酶10 min，冷卻后離心取上清液。

1.4.3 蛋白提取率的測定

1.4.3.1 酶解液中蛋白含量的測定

酶解液中蛋白含量的測定采用福林酚法，并按標(biāo)準(zhǔn)曲線求出樣品中蛋白濃度。標(biāo)準(zhǔn)曲線的回歸方程為：y=1.645x+0.0 226，R2=0.9 973。

1.4.3.2 蝦粉中總蛋白的測定

稱取4.000 g蝦粉，加入100 mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)4%的NaOH，于95℃下進行脫蛋白反應(yīng)1.0h，離心后取其沉淀加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)4%的NaOH，于相同溫度和時間下進行脫蛋白反應(yīng)，收集兩部分清夜并混合。此清夜中蛋白含量即為總蛋白含量。

總蛋白含量的測定采用凱氏定氮法。

1.4.3.3 蛋白提取率的計算

蛋白提取率（%）=（蝦粉酶解液中蛋白含量/蝦粉中總蛋白含量）×100%。

1.4.4 蝦加工副產(chǎn)物水解酶的選擇

選擇5種蛋白酶分別于其最適條件下水解蝦粉。5種蛋白酶的作用條件見表1。

表1 5種蛋白酶的作用條件

2 結(jié)果與分析

2.1 最適水解酶的確定

在相同的料液比（2 g蝦粉/100 mL緩沖液）、酶添加量（0.4%） 和酶解時間（3 h） 下分別考察不同的水解酶在各自最適條件下提取蛋白的效率。不同酶水解蝦粉的蛋白提取率見圖1。

圖1 不同水解酶的蛋白提取率

由圖1可知，不同種類的水解酶對于蝦粉的水解效率各不相同，但蛋白提取率均明顯高于不添加酶的對照組。其中，以堿性蛋白酶的提取效率最高，中性蛋白酶次之，風(fēng)味蛋白酶的水解效果最差。并且隨著水解的進行，緩沖液的緩沖能力有限，酶解液的pH會逐漸升高，堿性的水解環(huán)境也有利于堿性蛋白酶發(fā)揮其水解作用。因此選擇堿性蛋白酶為蝦副產(chǎn)物的水解酶。

2.2 料液比對蛋白提取率的影響

以緩沖液調(diào)節(jié)pH為7.5，每100 mL緩沖液中的蝦粉質(zhì)量分別為2 g、4 g、8 g、16 g、24 g、32 g，即酶解的料液比為：2g∶100mL、4g∶100mL、8g∶100mL、16g∶100mL、24g∶100mL、32g∶100mL，酶添加量均為蝦粉質(zhì)量的0.4%，在55℃下酶解3 h，分別測定不同料液比條件下蛋白的提取率。料液比對蛋白提取率的影響見圖2。

圖2 料液比對蛋白提取率的影響

由圖2可知，在料液比為4 g∶100 mL時，蛋白的提取率最大，而后，從8 g∶100 mL到32 g∶100 mL，蛋白的提取率逐漸下降。為了能讓底物蝦粉、堿性蛋白酶以及水在反應(yīng)時有充分的接觸面積從而使提取效率最高，因此最佳的料液比為4g∶100 mL。

2.3 酶解時間對蛋白提取率的影響

以緩沖液調(diào)節(jié)pH為7.5，料液比為4g∶100mL，酶添加量為蝦粉質(zhì)量的0.4%，在55℃下進行水解，每隔0.5 h取樣一次，分別測定不同時間點上的酶解液中蛋白含量。酶解時間對蛋白提取率的影響見圖3。

圖3 酶解時間對蛋白提取率的影響

由圖3可知，酶解時間從0 h到2.0 h的過程中，蛋白提取率的升高較為明顯，而后隨著時間的增加，蛋白提取率雖有上升，但趨勢不明顯。這可能是因為隨著酶解的進行，底物量減少，同時酶的活性也逐漸降低的緣故。因此酶解的時間因控制在2 h左右。

2.4 酶解溫度對蛋白提取率的影響

以緩沖液調(diào)節(jié)pH為7.5，料液比為4g∶100mL，酶添加量為蝦粉質(zhì)量的0.4%，分別在40℃、45℃、50℃、55℃、60℃、65℃下水解3 h，測定不同酶解溫度下的蛋白提取率。酶解溫度對蛋白提取率的影響見圖4。

圖4 酶解溫度對蛋白提取率的影響

由圖4可知，從40℃到60℃，蛋白提取率隨著溫度的上升而上升，超過60℃后，蛋白提取率逐漸下降?？梢姡瑝A性蛋白酶水解蝦粉提取蛋白的最適溫度在55℃～65℃之間，超過最適溫度后，雖然反應(yīng)速率隨溫度升高而升高，但酶卻逐漸失活變性，從而使得水解效果降低。綜合考慮，最佳酶解溫度為60℃。

2.5 起始pH值對蛋白提取率的影響

分別以緩沖液調(diào)節(jié)pH值為 6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0、9.6、10.0，以相同的料液比4 g∶100 mL，酶添加量為蝦粉質(zhì)量的0.4%，在55℃下酶解3 h，測定不同起始pH下的蛋白提取率。起始pH值對蛋白提取率的影響見圖5。

圖5 起始pH值對蛋白提取率的影響

由圖5可以看出，起始pH值從6.5到9.0，蛋白提取率逐漸上升，而后，蛋白提取率隨pH的上升而下降?？梢?，最適于堿性蛋白酶水解蝦粉提取蛋白的起始pH值在9.0左右；pH值偏低或過高，會使酶的空間構(gòu)象不穩(wěn)定，均不利于酶催化活性的發(fā)揮。因此，確定最佳的起始pH值為9.0。

2.6 酶添加量對蛋白提取率的影響

以緩沖液調(diào)節(jié)pH為7.5，料液比為4g∶100mL，酶添加量分別為蝦粉質(zhì)量的0.1%、0.2%、0.4%、0.8%、1.6%，在55℃下酶解3 h，測定不同酶添加量下的蛋白提取率。酶添加量對蛋白提取率的影響見圖6。

圖6 酶添加量對蛋白提取率的影響

由圖6可以看出：酶添加量從0.1%到0.8%的增加范圍內(nèi)，蛋白提取率呈上升趨勢，尤其在0.1%到0.4%的范圍內(nèi)，提取率的上升較為明顯。而從0.8%到1.6%的范圍內(nèi)，提取率卻沒有上升的趨勢，這可能是因為底物有限，酶未被底物所飽和，未體現(xiàn)出其最大催化速率的緣故。因此，酶添加量定為蝦粉質(zhì)量的0.8%較合適。

3 結(jié) 論

確定了堿性蛋白酶為水解蝦加工副產(chǎn)物提取蛋白的最適用酶，并在最適pH值9.0下，確定酶解的最佳條件為：酶添加量為蝦粉質(zhì)量的0.8%、溫度60℃、料液比4g∶100mL、時間2.0 h，此條件下蛋白提取率為65.3%。

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Research ofenzymatic hydrolysis technique ofshrimp processing byproduct

WANGGuan-feng**CHENWen-wei***HONGYaoHUANGGuang-rongBAOKaiWANGZhi
（College oflife science，China jilianguniversity，Hangzhou 310018，China）

In this paper，the extraction of protein from shrimp processing byproduct with enzymatic hydrolysis was studied.Comparingwith the different hydrolysis proteinases，the alcalase was found tobe the most suitable one for hydrolysis.It alsostudied the effects ofsolid-liquid ratio，reaction time，temperature，initial pH and enzyme content to the extraction yield ofprotein with alcalase.The result showed that the optimum hydrolysis conditions were∶0.8%alcalase，solid toliquid ratio4∶100，initial pH 9.0，temperature 60 ℃ for 2.0 h.Under such conditions，the extracion yield reached 65.3%.

enzymatic hydrolysis；shrimp processingbyproduct；protein

TS201.2+5

A

1673-6004（2012）02-0034-04

杭州市科技攻關(guān)項目（20101032B43），浙江省大學(xué)生科研創(chuàng)新團隊資助項目

**王觀馮，女，1990年出生，中國計量學(xué)院在讀本科，食品質(zhì)量與安全專業(yè)

***陳文偉，通訊作者，Email：cwwh1@163.com

2012-03-31