閻小青，董偉林

(1.天津市天津醫(yī)院，天津 300211; 2.天津醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，天津 300070)

HPLC法測(cè)定人血漿中奧沙普秦濃度*

閻小青1，董偉林2

(1.天津市天津醫(yī)院，天津 300211; 2.天津醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，天津 300070)

目的:建立固相萃取高效液相色法測(cè)定人血漿中奧沙普秦濃度的方法，并應(yīng)用于人體血漿藥物濃度測(cè)定。方法:固相萃取凈化和富集血漿樣品。色譜柱為Kromasil C18柱，流動(dòng)相為0.02 mol/L磷酸二氫鉀緩沖液(pH 5.0)－甲醇(85∶15)，流速為1.0 ml/min，紫外檢測(cè)波長(zhǎng)285 nm。血漿中內(nèi)源性物質(zhì)對(duì)樣品測(cè)定無(wú)干擾。結(jié)果:本方法奧沙普秦線(xiàn)性范圍為 0.1 ～100 μg/ml(r=0.999 2)，最低定量濃度為 0.1 μg/ml，回收率為99.39%，日內(nèi)、日間 RSD 均小于2%。結(jié)論:本法簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確，適用于奧沙普秦臨床藥物濃度測(cè)定。

奧沙普秦，HPLC，血漿藥物濃度

奧沙普秦腸溶片 (oxaprozin enteric－coated tablets，商品名諾松)是臨床常用的丙酸類(lèi)非甾體抗炎藥。具有抗炎、鎮(zhèn)痛、解熱作用。其通過(guò)抑制環(huán)氧化酶，進(jìn)而抑制前列腺素等的合成和釋放，起到鎮(zhèn)痛作用，療效肯定，副作用小，臨床用于風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、骨關(guān)節(jié)炎、強(qiáng)直性脊椎炎、肩關(guān)節(jié)周?chē)准巴鈧褪中g(shù)后消炎鎮(zhèn)痛等。本文在參考文獻(xiàn)［1－3］的基礎(chǔ)上，采用固相萃取凈化和富集血漿樣品HPLC法測(cè)定血漿中奧沙普秦濃度，本方法操作簡(jiǎn)便、靈敏、快速，并已應(yīng)用于口服奧沙普秦腸溶片的臨床藥物濃度測(cè)定。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 美國(guó)科美特高效液相色譜儀(包括:6000LDI精密恒流泵，6000PVW 紫外/可見(jiàn)檢測(cè)器，Rheodyne7725i型進(jìn)樣閥，Anastar色譜工作站);Kromasil C18柱(150 mm ×4.6 mm，5 μm，天津市琛航科學(xué)儀器有限公司);固相萃取小柱(C18/500 mg);BFX5－320型臺(tái)式離心機(jī)(河北省安新縣白洋離心機(jī)廠);MSB010.CX2.5型臺(tái)式高速離心機(jī)(SANYO);三環(huán)牌YKH－1型液體快速混合器(江西醫(yī)療器械廠);PB153－S型電子分析天平(瑞典梅特勒－托利多);C－9860A超聲波清洗器(天津市科貝爾光電技術(shù)有限責(zé)任公司);HGC－12A氮吹儀(天津市恒奧科技發(fā)展有限公司);PHS－3C型精密pH計(jì)(上海精密科學(xué)儀器有限公司);Millipore－Q超純水裝置;20～200 μl微量加樣器(上海大龍醫(yī)療有限公司);100 μl微量進(jìn)樣器(上海高鴿工貿(mào)有限公司)。

1.2 試藥 奧沙普秦對(duì)照品(中國(guó)藥品生物制品檢定所，批號(hào)100353－200301);奧沙普秦腸溶片(湖北百科亨迪藥業(yè)有限公司，規(guī)格:200 mg/片，批號(hào)100203)。甲醇、乙腈為色譜純;磷酸二氫鉀等為分析純;水為超純水。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件 色譜柱:Kromasil C18柱(150 mm×4.6 mm，5 μm);流動(dòng)相:0.02 mol/L 磷酸二氫鉀緩沖液(pH 5.0)甲醇(85∶15);流速:1.0 ml/min;紫外檢測(cè)波長(zhǎng):285 nm;進(jìn)樣量:20 μl。

2.2 固相萃取條件 取血漿樣品200 μl，加入經(jīng)活化處理后的固相萃取小柱中，加入沖洗液(甲醇 －1 mmol/L鹽酸10∶90)1.0 ml，棄去沖洗液，加入甲醇2 ml沖洗固相萃取小柱，收集甲醇，吹干。殘留物加入200 μl流動(dòng)相旋渦混合 3 min，16 000 r/min離心 5 min，取上清液 20 μl進(jìn)樣分析。

2.3 對(duì)照品溶液的制備 精密稱(chēng)取奧沙普秦對(duì)照品10 mg，置10 ml量瓶中，用甲醇溶解并定容，配制成奧沙普秦濃度為1.0 mg/ml的儲(chǔ)備液。將該儲(chǔ)備液用甲醇稀釋成 0.1、0.5、1.0、5.0、10.0、50.0 和 100.0 μg/ml的系列溶液，備用。

2.4 血漿樣品處理 按照生物樣品采集和固相萃取條件操作，對(duì)血漿樣品血藥濃度進(jìn)行測(cè)定。

2.5 方法專(zhuān)屬性 取空白血漿200 μl，按“2.2”項(xiàng)下方法操作，得色譜圖1－a;取空白血漿200 μl，加入50 μg/ml對(duì)照品溶液10 μl，按“2.2”項(xiàng)下自“加入固相萃取小柱”操作，得色譜圖1－b;取受試者用藥后的血漿樣品200 μl，按“2.2”項(xiàng)下作，得色譜圖 1 － c。結(jié)果表明，空白血漿中內(nèi)源物質(zhì)不干擾奧沙普秦的測(cè)定，奧沙普秦保留時(shí)間約為9.0 min。

圖1 空白血漿(A)空白血漿加入奧沙普秦(B)服藥2 h小時(shí)后血漿(C)HPLC色譜圖

2.6 標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)制備 取空白血漿200 μl，加入奧沙普秦對(duì)照品系列溶液適量，配制成奧沙普秦濃度為0.1、0.5、1.0、5.0、10.0、50.0 和 100.0 μg/ml的含藥血漿樣品，自“加入固相萃取小柱”始，按“2.2”項(xiàng)下方法操作。以?shī)W沙普秦濃度(X)為橫坐標(biāo)，奧沙普秦的峰面積(Y)為縱坐標(biāo)，進(jìn)行線(xiàn)性回歸，得回歸方程為:Y=4 039.4 X+14 907(r=0.999 2)。結(jié)果表明，血漿中奧沙普秦濃度在0.1～100 μg/ml范圍內(nèi)線(xiàn)性良好。血漿中奧沙普秦的最低定量濃度為0.1 μg/ml。

2.7 精密度與方法回收率 取空白血漿200 μl，配制3個(gè)濃度(分別為 0.5、10 和 100 μg/ml)的血漿樣品，按“2.2”項(xiàng)下方法處理后進(jìn)樣，每個(gè)濃度3份，重復(fù)3 d測(cè)定，并與標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)同時(shí)進(jìn)行，計(jì)算測(cè)得濃度，與理論濃度對(duì)照，采用單因素方差分析法求得本法的精密度，用RSD表示。方法回收率用測(cè)定濃度的平均值與理論濃度比值的百分?jǐn)?shù)表示，結(jié)果日內(nèi)RSD＜1.21%，日間RSD＜1.48%，方法回收率平均為99.39%(n=3)，滿(mǎn)足生物樣品分析方法的要求。

2.8 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取空白血漿200 μl，配制3個(gè)濃度(分別為 0.5、10、100 μg/ml)的血漿樣品，每個(gè)濃度2份，分別考查其在室溫、凍融循環(huán)、－20℃保存以及處理后在室溫條件下的穩(wěn)定性，以當(dāng)日隨行標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)計(jì)算血漿樣品中奧沙普秦的濃度，將測(cè)定濃度的平均值與理論濃度對(duì)照，結(jié)果RE＜±2.5%，表明血漿樣品在室溫放置24 h、凍融3次、－20℃保存3周以及處理后在室溫放置24 h的條件下都是穩(wěn)定的。

2.9 樣品測(cè)定 臨床15名男性受試者，受試當(dāng)日清晨8時(shí)空腹口服奧沙普秦腸溶片400 mg，用250 ml溫開(kāi)水送服。于服藥前及服藥3 h后分別從肘靜脈取血2 ml，置肝素管中放置1 h，3 000 r/min離心10 min分離血漿，置－20℃下凍存?zhèn)溆谩Ｓ帽痉y(cè)定受試者服藥后血漿中奧沙普秦的濃度，15名受試者口服奧沙普秦腸溶片400 mg后的平均血藥濃度見(jiàn)表1。結(jié)果表明，所服藥物吸收后3 h內(nèi)血藥濃度即達(dá)峰值。

表1 15名受試者單劑量口服奧沙普秦腸溶片(400 mg)3 h后的平均血藥濃度

3 討論

本文采用固相萃取凈化和富集血漿樣品，HPLC法紫外檢測(cè)器測(cè)定人血漿中奧沙普秦，每一樣品的測(cè)定可在15.0 min內(nèi)完成，且此法具有良好的精密度和準(zhǔn)確度，為奧沙普秦的血藥濃度及藥代動(dòng)力學(xué)研究提供了可靠的方法。

3.1 樣品的預(yù)處理 文獻(xiàn)采用液－液萃取法提取血樣中奧沙普秦［1，2］，操作煩瑣;而用甲醇沉淀蛋白［3］，對(duì)樣品稀釋度較大，達(dá)不到本研究分析檢測(cè)限的要求。本研究采用固相萃取凈化和富集血漿樣品，操作簡(jiǎn)便、快速，與文獻(xiàn)相比大大縮短了樣品處理時(shí)間，且采用固相萃取凈化和富集血漿樣品，可使樣品濃度高、干擾較少。

3.2 流動(dòng)相的選擇 曾采用0.02 mol/L乙酸銨溶液作為流動(dòng)相，奧沙普秦的色譜峰拖尾嚴(yán)重，水相改用0.02 mol/L磷酸二氫鉀溶液(用磷酸調(diào)至pH 4.5)－甲醇(85∶15)，可使峰形明顯改善;且所用試劑價(jià)廉低毒，簡(jiǎn)單易得。通過(guò)考查流動(dòng)相組分對(duì)測(cè)定結(jié)果的影響，確定流動(dòng)相為0.02 mol/L磷酸二氫鉀溶液(用磷酸調(diào)至pH 4.5)－甲醇(85∶15)，在此條件下奧沙普秦峰形對(duì)稱(chēng)、保留時(shí)間適中。

1 許長(zhǎng)江，江志強(qiáng)，楊香嬡，等.奧沙普秦腸溶膠囊與片在中國(guó)健康者的藥物動(dòng)力學(xué)及其相對(duì)生物利用度.中國(guó)新藥與臨床雜志，2000，19(2):90

2 陳鷹，盛利，李海萍，等.奧沙普秦分散的人體相對(duì)生物利用度.中國(guó)臨床藥學(xué)雜志，2001，10(2):96

3 夏春華，徐文煒，熊玉卿，等.奧沙普秦腸溶片HPLC測(cè)定法及其人體生物等效性研究.中國(guó)藥理學(xué)通報(bào)，2006，2(3):366

HPLC with solid phase extraction assay for determ ination of oxaprozin in human plasma

Yan Xiaoqing1，Dong Weilin2
(1.The Tianjin Hospital of Tianjin，Tianjin 300070)

Objective:To establish an HPLC me thod by solid－phase extraction in order to determine of Oxaprozin in human plasma and for human drug plasma concentration determine.Methods:Proteins in plasma samples were precipitated by solid －phase extraction.Kromasil C18was used with the mobile phase of 0.02 mol/L NaH2PO4solution(pH 5.0) － methanol(85∶15)at a flow rate of 1.0 ml/min.The detection wavelength was at 285nm.The endogenous substance in plasma did not interfere with the determination of the samples.Results:The linear range was 0.1 ～100 μg/ml(r=0.999 2)，and the limit of quantitation was 0.1 μg/ml.The method recovery was 99.39%.Both within － day RSD and between － day RSD were less than 2%.Conclusion:The method is simple and accurate.It is suitable for the drug plasma concentration of oxaprozin.

oxaprozin，HPLC，drug plasma concentration

R27.2

A

1006-5687(2012)04-0017-03

2012-05-09