鄭兆銀，陳延晶，賀 蕾

(天津市靜?？h藥品檢驗(yàn)所，天津 301600)

實(shí)驗(yàn)研究

胃安顆粒微生物限度檢查方法的驗(yàn)證*

鄭兆銀，陳延晶，賀 蕾

(天津市靜?？h藥品檢驗(yàn)所，天津 301600)

目的:建立胃安顆粒微生物限度檢查方法。方法:按《中國藥典》2010年版一部附錄微生物限度檢查法及應(yīng)用指導(dǎo)原則［1］，考察確定胃安顆粒微生物限度的檢查方法。用常規(guī)法進(jìn)行預(yù)試驗(yàn)，初步考察該樣品對(duì)試驗(yàn)菌檢測的影響，根據(jù)結(jié)果，用培養(yǎng)基稀釋法進(jìn)行再試驗(yàn)。結(jié)果:常規(guī)法試驗(yàn)，大腸埃希菌、白色念珠菌、黑曲霉的回收率均大于70%，而金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌的回收率均小于70%，控制菌檢查采用常規(guī)法。采用培養(yǎng)基稀釋法試驗(yàn)時(shí)，可以有效消除抑菌作用，使金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌的回收率大于70%。結(jié)論:采用培養(yǎng)基稀釋法可以有效消除抑菌作用，簡便、準(zhǔn)確。

微生物限度檢查，驗(yàn)證試驗(yàn)，培養(yǎng)基稀釋法

胃安顆粒是一復(fù)方中成藥制劑，由丹參、馬鞭草、蠶砂、石斛、太子參、白術(shù)、連翹、豆蔻、砂仁、蜂房、甘松、梅花和拳參組成，臨床上健脾益胃、化瘀行滯，用于萎縮性胃炎或不典型增生及殘胃炎。《中國藥典》2010年版規(guī)定［1］，在進(jìn)行藥品微生物限度檢查時(shí)，應(yīng)對(duì)所用方法進(jìn)行驗(yàn)證，以確認(rèn)所采用的方法適合于該藥品的微生物限度檢查。

1 試驗(yàn)材料與儀器

1.1 樣品 胃安顆粒(某醫(yī)院制劑;批號(hào)20110916;規(guī)格:5 gx10袋/盒)。

1.2 儀器 GZX－9240MBE型數(shù)顯鼓風(fēng)干燥箱(上海博迅實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠)、DHP－9162型電熱恒溫培養(yǎng)箱(上海一恒科技有限公司)、MJ－250BS－II型霉菌培養(yǎng)箱(上海新苗醫(yī)療器械制造有限公司)、SPX－250B生化培養(yǎng)箱(天津市華北實(shí)驗(yàn)儀器有限公司)、RS－1型渦旋儀(北京昊諾斯科技有限公司)、LDZX－50FBS型蒸汽滅菌鍋(上海申安醫(yī)療器械廠)等。

1.3 菌種 金黃色葡萄球菌［CMCC(B)26003］;大腸埃希菌［CMCC(B)44102］;枯草芽孢桿菌;［CMCC(B)63501］白色念珠菌［CMCC(F)98001］;黑曲霉［CMCC(F)98003］;乙型副傷寒沙門菌［CMCC(B)50094］均來源于中國食品藥品檢定研究院。

1.4 培養(yǎng)基及稀釋劑 營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基;玫瑰紅鈉瓊脂培養(yǎng)基;膽鹽乳糖培養(yǎng)基;營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基;改良馬丁培養(yǎng)基;pH 7.0無菌氯化鈉－蛋白胨緩沖液、0.9%無菌氯化鈉溶液、MUG培養(yǎng)基;膽鹽乳糖發(fā)酵培養(yǎng)基;四硫磺酸亮綠培養(yǎng)基;麥康凱瓊脂培養(yǎng)基;膽鹽硫乳瓊脂培養(yǎng)基;三糖鐵瓊脂培養(yǎng)基;改良馬丁瓊脂培養(yǎng)基。

2 驗(yàn)證條件

無菌室環(huán)境潔凈度為100 00級(jí)，局部潔凈度為100級(jí)，凈化消毒30 min以上，供試品及滅菌的器具等經(jīng)傳遞窗紫外殺菌燈照射30 min置無菌室內(nèi)，試驗(yàn)人員手消毒后穿無菌服進(jìn)入操作間。

3 驗(yàn)證試驗(yàn)

3.1 試驗(yàn)菌液的制備 取金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌、枯草芽孢桿菌、乙型副傷寒沙門菌的新鮮培養(yǎng)物至營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中，置30～35℃培養(yǎng)18～24 h;取白色念珠菌的新鮮培養(yǎng)物，接種至改良馬丁培養(yǎng)基中，23～28℃培養(yǎng)24～48 h，上述培養(yǎng)物用0.9%無菌氯化鈉溶液制成每1 ml含菌數(shù)約為50～100 cfu的菌懸液。取黑曲霉的新鮮斜面培養(yǎng)物至改良馬丁瓊脂斜面培養(yǎng)基，25℃培養(yǎng)5～7 d，加入3～5 ml含0.05%聚山梨酯80的0.9%無菌氯化鈉溶液溶液，將孢子洗下脫。然后采用適宜的方法吸出孢子懸液至無菌試管內(nèi)，用含0.05%聚山梨酯80的0.9%無菌氯化鈉溶液制成每1 ml含孢子數(shù)50～100 cfu的孢子懸液。

3.2 供試品溶液的制備 稱取樣品10 g，加pH 7.0無菌氯化鈉－蛋白胨緩沖液至100 ml，振搖使分散均勻，制成1∶10的供試液。

3.3 細(xì)菌數(shù)、霉菌及酵母菌數(shù)計(jì)數(shù)方法的驗(yàn)證

3.3.1 常規(guī)法 ①試驗(yàn)組:分別吸取1∶10供試液1 ml和含菌數(shù)為50－100 cfu的試驗(yàn)菌液1 ml置同一個(gè)無菌平皿中。②菌液組:吸取含菌數(shù)為50～100 cfu的試驗(yàn)菌液1 ml置無菌平皿中。③供試品對(duì)照組:吸取1∶10供試液1 ml置無菌平皿中。每組平行制備2個(gè)平板，分別立即傾注不超過45℃的營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基15～20 ml，在30～35℃培養(yǎng)48 h，或分別傾注不超過45℃的玫瑰紅鈉瓊脂培養(yǎng)基15～20 ml，在23～28℃培養(yǎng)72 h，點(diǎn)計(jì)菌落數(shù)，分別計(jì)算各試驗(yàn)菌每次試驗(yàn)的菌回收率。試驗(yàn)組菌回收率計(jì)算:菌回收率(%)=(試驗(yàn)組平均菌落數(shù)－供試品對(duì)照組平均菌落數(shù))∕菌液組平均菌落數(shù)。結(jié)果見表1。

由表1可知，常規(guī)法3次試驗(yàn)中，大腸埃希菌、白色念珠菌、黑曲霉在供試液中回收率均大于70%;金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌在供試液中回收率均小于70%。說明常規(guī)法適合于該品種的霉菌及酵母菌計(jì)數(shù)，但不適合于本品的細(xì)菌計(jì)數(shù)。根據(jù)上述情況，采用培養(yǎng)基稀釋法進(jìn)行再試驗(yàn)

3.3.2 培養(yǎng)基稀釋法 取1∶10供試液1 ml分別加入5個(gè)無菌平皿中(每皿0.2 ml)，其他同于常規(guī)法。試驗(yàn)組菌回收率計(jì)算:菌回收率(%)=(試驗(yàn)組平均菌落數(shù)-供試品對(duì)照組平均菌落數(shù))∕菌液組平均菌落數(shù)。結(jié)果見表2。

表1 常規(guī)法測定胃安顆粒的細(xì)菌數(shù)、霉菌及酵母菌數(shù)回收率結(jié)果

表2 培養(yǎng)基稀釋法測定胃安顆粒菌回收率結(jié)果

由表2可知，采用培養(yǎng)基稀釋法后，可消除供試液對(duì)金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌的抑菌作用，使菌回收率大于70%。說明培養(yǎng)基稀釋法(每皿0.2 ml)適合于該品種的菌落計(jì)數(shù)。

3.4 控制菌檢查方法的驗(yàn)證

3.4.1 驗(yàn)證方法

3.4.1.1 試驗(yàn)組 取規(guī)定量1∶10供試液及含菌數(shù)為10～100 cfu試驗(yàn)菌液1 ml加入增菌培養(yǎng)基中。

3.4.1.2 陰性菌對(duì)照組 取規(guī)定量供試液及含菌數(shù)為10～100 cfu金黃色葡萄球菌菌液1 ml加入增菌培養(yǎng)基中。

3.4.1.3 陽性對(duì)照組 取含菌數(shù)為10～100 cfu的試驗(yàn)菌液1 ml加入增菌培養(yǎng)基中。

3.4.1.4 供試品對(duì)照組 取1∶10供試液，加入到增菌培養(yǎng)基中。

3.4.2 大腸埃希菌檢查方法的驗(yàn)證 取1∶10供試液10 ml接種至100 ml膽鹽乳糖培養(yǎng)基，置30～35℃培養(yǎng)18～24 h。吸取上述培養(yǎng)物0.2 ml，接種至含5 ml MUG培養(yǎng)基的試管內(nèi)，培養(yǎng)。于5和24 h在366 nm紫外線下觀察，同時(shí)用未接種的MUG培養(yǎng)基作本底對(duì)照。若管內(nèi)培養(yǎng)物呈現(xiàn)熒光，為MUG陽性;不呈現(xiàn)熒光，為MUG陰性。觀察后，沿培養(yǎng)管的管壁加入數(shù)滴靛基質(zhì)試液，液面呈玫瑰紅色，為靛基質(zhì)陽性;呈試劑本色，為靛基質(zhì)陰性。本底對(duì)照應(yīng)為MUG陰性和靛基質(zhì)陰性。如MUG陽性，靛基質(zhì)陽性，判供試品檢出大腸埃希菌;如MUG陰性，靛基質(zhì)陰性，判供試品未檢出大腸埃希菌。結(jié)果見表3。

表3 大腸埃希菌檢查方法驗(yàn)證結(jié)果

由表3可知，陰性菌對(duì)照組未檢出大腸埃希菌，試驗(yàn)組與陽性對(duì)照組均檢出大腸埃希菌，大腸埃希菌檢查可用常規(guī)法檢查。

3.4.3 大腸菌群檢查方法的驗(yàn)證 取1∶10、1∶100和1∶1 000的供試液各1 ml分別加入含10 ml膽鹽乳糖發(fā)酵培養(yǎng)基的管中，30～35℃培養(yǎng)18～24 h。若不產(chǎn)氣產(chǎn)酸，判未檢出大腸菌群。若產(chǎn)氣產(chǎn)酸，將發(fā)酵管中的培養(yǎng)物分別劃線接種于麥康凱瓊脂培養(yǎng)基平板上，培養(yǎng)18～24 h。從分離平板上挑選4～5個(gè)疑似菌落，分別接種于乳糖發(fā)酵管中，培養(yǎng)24～48 h，若產(chǎn)氣產(chǎn)酸判檢出大腸菌群。結(jié)果見表4。

表4 大腸菌群檢查方法驗(yàn)證結(jié)果

由表4可知，陰性菌對(duì)照組未檢出大腸菌群，試驗(yàn)組與陽性對(duì)照組均檢出大腸菌群，大腸菌群檢查可用常規(guī)法檢查。

3.4.4 沙門菌檢查方法的驗(yàn)證 取供試品10 g，接種至200 ml營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中，振搖混合，30～35℃培養(yǎng)18～24 h。取上述培養(yǎng)物1 ml，接種于10 ml四硫磺酸鈉亮綠培養(yǎng)基中，培養(yǎng)18～24 h后，分別劃線接種于膽硫乳瓊脂培養(yǎng)基和麥康凱瓊脂培養(yǎng)基平板上，培養(yǎng)18～24 h，若平板上無菌落生長或無疑似菌落生長，判供試品未檢出沙門菌。否則，用接種針挑選2～3個(gè)疑似菌落分別于三糖鐵瓊脂培養(yǎng)基高層斜面上進(jìn)行斜面和高層穿刺接種，培養(yǎng)18～24 h。斜面見紅色，底層見黃色，或斜面黃色、底層黑色判檢出沙門菌。結(jié)果見表5。

表5 沙門菌檢查方法驗(yàn)證結(jié)果

由表5可知，陰性菌對(duì)照組未檢出沙門菌，試驗(yàn)組與陽性對(duì)照組均檢出沙門菌，沙門菌檢查可用常規(guī)法檢查。

4 討論

采用常規(guī)法試驗(yàn)時(shí)，該樣品對(duì)大腸埃希菌、白色念珠菌、黑曲霉的加菌回收率均大于70%，證明其對(duì)上述3種供試菌無抑菌作用。該樣品對(duì)金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌有抑菌作用，其加菌回收率小于70%，低于《中國藥典》2010年版規(guī)定的回收率不得低于70%才視為無抑菌作用的要求。結(jié)合該樣品的物理特性和常規(guī)法試驗(yàn)結(jié)果，采用培養(yǎng)基稀釋法進(jìn)行試驗(yàn)后，金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌的加菌回收率可大于70%。故胃安顆粒的細(xì)菌數(shù)檢查可采用培養(yǎng)基稀釋法(0.2 ml)，霉菌及酵母菌數(shù)的檢查采用常規(guī)法。

由控制菌檢查方法的驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果表明，采用常規(guī)法試驗(yàn)時(shí)，該樣品對(duì)大腸埃希菌、大腸菌群和沙門菌的檢查無干擾，故胃安顆粒的控制菌檢查可采用常規(guī)法。

1 中國藥典.一部.2010:附錄79，138

Weian granules in verification of microbial limit test method

Zheng Zhaoyin，Chen Yanjing，He Lei
(The Insititute for Drug Control of Jinghai，Tianjin 301600)

Objective:to establish microbial Weian granules limit inspection Methods.Methods:according to the China Pharmacopeia(2010 edition a microbial limits inspection and application appendix guiding principle)，the investigation to determine the microbial limits stomach Ann particle inspection Methods.With conventional method on the test，a preliminary study samples of the experimental fungus effect on detecting，according to the results，with culture medium diluted method to test.Results:the normal method of test，escherichia coli，candida albicans，aspergillus are larger than the recovery rate of 70% ，and staphylococcus aureus and bacillus subtilis were less than the recovery rate of 70%，the conventional method check control bacteria.The culture medium diluted method test，can effectively eliminate the bacteriostatic action，make staphylococcus aureus，bacillus subtilis recovery rate of more than 70%.Conclusion:the culture medium diluted method can effectively eliminate the bacteriostatic action，is simple and accurate.

microbial limit inspection，validation test，culture medium diluted method

R927.11

A

1006-5687(2012)04-0001-03

2012-01-05