王慧琛，王麗琴

(天津市藥品檢驗所，天津 300070)

熊果苷的應(yīng)用及檢測研究進展*

王慧琛，王麗琴

(天津市藥品檢驗所，天津 300070)

熊果苷(arbutin)屬氫醌苷化合物，有兩種差向異構(gòu)體，即α和β型熊果苷。熊果苷具有抗炎、抑菌、鎮(zhèn)咳、祛痰、平喘作用，并具有天然美白活性，在臨床應(yīng)用廣泛。含熊果苷的藥物常用于治療氣管炎、感染性泌尿系統(tǒng)疾病、皮膚病、過敏及炎癥性疾病。熊果苷能有效地抑制皮膚中的生物酪氨酸酶(tyrosinase)活性，阻斷黑色素的形成，通過自身與酪氨酶直接結(jié)合，加速黑色素的分解與排泄，從而減少皮膚色素沉積，祛除色斑和雀斑，常被作為祛斑藥物和美白、美容護膚品的添加物，特別是α－熊果苷因效果突出和安全性高，尤受青睞。近年來，熊果苷因其在藥物中的治療作用和在化妝品中美白、祛斑效果突出和綠色安全而日益受到醫(yī)療界及愛美人士的青睞。熊果苷在國內(nèi)外的應(yīng)用日趨廣闊，在藥物和化妝品中的應(yīng)用和檢測有了迅速的發(fā)展。本文對熊果苷在藥物和化妝品中的應(yīng)用及檢測研究進展做一綜述。

熊果苷，黑素，酪氨酸酶，化妝品，檢測

熊果苷(arbutin，Arb)，又名熊果素、熊果葉苷、熊果酚苷，其化學(xué)名稱為對－羥基苯－β－D－吡喃葡萄糖苷，是一種白色針狀結(jié)晶物質(zhì)，易溶于熱水、甲醇、乙醇及丙二醇、丙三醇的水溶液，不溶于乙醚、氯仿、石油醚等。熊果苷最初是從植物中提取的天然活性物質(zhì)，1930年有報道在厚葉巖白菜的葉中含有熊果苷，以后相繼在烏飯樹、越橘、熊果和梨的樹葉中發(fā)現(xiàn)熊果苷。

1 熊果苷的去斑去色素作用機理

黑素是深色素類物質(zhì)的一種，能引起皮膚的著色，是在黑素細胞melanocyte中由苯丙氨酸或酪氨酸經(jīng)氧化等一系列生化反應(yīng)生成的。在黑色素的形成過程中，酪氨酸為形成黑色素的原料，酪氨酸酶是酪氨酸轉(zhuǎn)化為黑色素的主要限速酶，其活力的大小決定了形成黑色素的數(shù)量。體內(nèi)酪氨酸酶的活力越高，含量越多，越容易形成黑色素。酪氨酸酶兼具酪氨酸羥化酶活性(催化酪氨酸→多巴)和多巴氧化酶活性(催化多巴→多巴醌)，是黑素細胞合成黑素的關(guān)鍵因素。

氫醌(1，4－對苯二酚)等傳統(tǒng)美白劑對皮膚具有脫色素作用，外用表現(xiàn)刺激反應(yīng)，引起皮膚紅斑、脫屑、瘙癢、刺痛、過敏，甚至引起永久性損害，臨床應(yīng)用受到限制，在歐洲被禁用。熊果苷(4－羥基苯－α－D－吡喃葡萄糖苷)及其衍生物結(jié)構(gòu)類似氫醌，但細胞毒性較小，相對比較安全;其體外、體內(nèi)均能有效地抑制黑素細胞酪氨酸酶活性，阻斷黑色素的形成，并可通過自身與酪氨酸酶直接結(jié)合，加速黑色素的分解與排泄，從而減少皮膚色素沉積［1，2］。熊果苷作為美白劑已在化妝品中廣泛應(yīng)用，臨床也用于黃褐斑的治療［3］。

熊果苷能迅速滲入肌膚，在不影響細胞增殖濃度的同時，能有效抑制皮膚中酪氨酸酶的活性，阻斷黑色素的生成。它通過自身與酪氨酸酶直接結(jié)合，競爭多巴的結(jié)合位點，加速黑色素的分解與排泄，從而減少皮膚色素沉積。用250 mg劑量的熊果苷作用人的皮膚模型發(fā)現(xiàn)，細胞的分化生長沒有變化，但黑色素的生成比對照組減少60%。

熊果苷對酪氨酸羥化酶活性亦有競爭性抑制作用，但不減少體外培養(yǎng)的黑素細胞中酪氨酸酶的蛋白含量及其mRNA水平。熊果苷對黑素細胞酪氨酸酶家族的3種酶——酪氨酸酶、酪氨酸酶相關(guān)蛋白－1和酪氨酸酶相關(guān)蛋白－2的含量及分子大小均無影響，認為熊果苷是在轉(zhuǎn)錄后階段抑制酪氨酸酶的活性。

在抑制酪氨酸酶活性和黑素生成的濃度下，對細胞活力和增殖力影響很小。Funayama等比較β－熊果苷與其差向異構(gòu)體(α－熊果苷)對來自蘑菇及小鼠黑素瘤酪氨酸酶活性的影響，結(jié)果表明，β－熊果苷抑制來自蘑菇及小鼠黑素瘤的酪氨酸酶。α－熊果苷僅抑制小鼠黑素瘤的酪氨酸酶，其機理推測為混合型抑制，而β－熊果苷的機制是非競爭性的。α－熊果苷抑制強度為β－熊果苷的10倍。在β－熊果苷與α－熊果苷對黑素合成的抑制作用的研究中，用培養(yǎng)的B16黑色素瘤細胞研究兩個化合物對黑色素合成的抑制作用，發(fā)現(xiàn)熊果苷和β－熊果苷對酪氨酸酶抑制作用水平相等，但濃度為1 mmol/L的α－熊果苷未見抑制細胞的生長，而β－熊果苷在同樣濃度則出現(xiàn)有效的抑制。顯然，α－熊果苷比β－熊果苷具有更高的安全性。以上結(jié)果表明，熊果苷抑制了酪氨酸酶活性，但不影響酪氨酸酶的表達和合成，是一種理想的脫色素藥物［4］。

2 熊果苷的抗炎作用

王佩等［5］研究熊果苷抗炎作用及其作用機理，Arb對福氏全佐劑誘發(fā)的大鼠原發(fā)性及繼發(fā)性足腫脹具有抑制作用;對口惡唑酮引起的小鼠兩耳腫脹有抑制作用且使血中CD4+T細胞明顯降低;可減少炎癥組織PGE2水平及抑制大鼠腹腔巨噬細胞釋放ILB4，證明熊果苷的抗炎效果可能與抑制炎癥介質(zhì)PGE2及ILB4釋放有關(guān)。

王佩等［6］研究熊果苷與甘草酸(glycyrrhizin，GL)合用對免疫性炎癥的治療作用，Arb與GL合用對福氏全佐劑誘發(fā)的大鼠原發(fā)性及繼發(fā)性足腫脹具有抑制作用;Arb和GL合用組對口惡唑酮引起的小鼠兩耳腫脹有抑制作用，且合用組小鼠血中CD4+T細胞明顯降低;GL(400 mg/kg)組及合用組PGE2相對含量顯著低于模型組，合用組PGE2相對含量與GL(400 mg/kg)組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義;兩藥合用可抑制大鼠腹腔巨噬細胞釋放LTB4，表明Arb與GL對免疫性炎癥具有協(xié)同治療作用。

3 熊果苷的應(yīng)用研究

3.1 熊果苷的來源和制備 熊果苷屬氫醌苷化合物，有兩種差向異構(gòu)體，即α和β型。β－熊果苷可以通過植物提取、植物細胞培養(yǎng)和人工合成3種方法來制備。早在1930年人們就已從植物中提取出了熊果苷，但從植物中提取單一有效成分技術(shù)復(fù)雜，成本很高。與植物提取相比，用植物組織培養(yǎng)獲得熊果苷其效率要高得多。1991年，Inomate等在長春花植物細胞懸浮液中加入對苯二酚，制得高含量熊果苷;其后，Yokoyama等采用換新鮮培養(yǎng)劑方法提高熊果苷產(chǎn)率，還采用添加抗氧化劑方法增加熊果苷產(chǎn)率。熊果苷可用對苯二酚和葡萄糖在β－糖苷酶催化下獲得。植物組織培養(yǎng)及酶法所用原料更簡單，生產(chǎn)無污染，雖然還不成熟，但前景光明。用化學(xué)方法亦可合成熊果苷。熊果苷易溶于水和極性溶劑，不溶于非極性溶劑，采用非極性及極性溶劑進行純化，能有效地除去雜質(zhì)，從天然介質(zhì)中獲得了高品質(zhì)的熊果苷結(jié)晶，提高了產(chǎn)品的質(zhì)量和安全性。目前來看，有機合成乃是首選途徑。而α－熊果苷一般只能通過不同的微生物的酶進行糖轉(zhuǎn)移反應(yīng)，讓一分子的葡萄糖和一分子的氫醌結(jié)合形成單一的α－熊果苷。日本江琦糖業(yè)公司采用微生物酶進行糖基轉(zhuǎn)移反應(yīng)方式能大量生產(chǎn)α－熊果苷，使工業(yè)化生產(chǎn)更容易。

3.2 熊果苷在祛斑藥物和化妝品中應(yīng)用的安全性熊果苷是繼L－半胱氨酸和曲酸等美白劑后又一個新美白劑，用于祛斑藥物的成分和化妝品的添加劑。其不僅對皮膚的雀斑、老人斑、黃褐斑有消退作用，而且對皮膚滋潤、皮膚灼傷的愈合和粉刺等也頗有療效。要達到好的療效，熊果苷用量3%為宜，少于這個用量對皮膚中酪氨酸酶的催化活性的抑制作用顯得不足，大于3%可能會引起類似對苯二酚對皮膚損傷的弊病，因為對苯二酚是合成熊果苷所用原料之一，難免有殘留的游離酚存在。將熊果苷、維生素C、維生素C衍生物、氫醌、曲酸等5種美白活性物質(zhì)對酪氨酸酶活性的體外抑制作用及細胞毒性進行研究得出結(jié)論，在5種美白劑中，熊果苷最為安全有效。熊果苷對皮膚黑素細胞的生物學(xué)效應(yīng)，亦表明β－熊果苷有破壞黑素細胞增殖的功能，抑制細胞的生長，提示細胞毒性不容忽視。熊果苷屬氫醌苷化合物，有兩種差向異構(gòu)體，即α和β型，是目前國內(nèi)外常用于美白化妝品中的主要原料［7］。兩種熊果苷異構(gòu)體的美白效果和安全性有所差異，據(jù)報道，α－熊果苷抑制黑色素生成的效果比來源于烏飯樹提取物的β－熊果苷要強10倍，并強于目前已知的其他美白活性成分［8］。β－熊果苷可損傷培養(yǎng)細胞的細胞膜，因此β－熊果苷的用量與其安全性有一定關(guān)系。目前β－熊果苷在化妝品中添加用量約為3%，小于此量對皮膚中酪氨酸酶的催化活性的抑制作用較弱，增白作用不明顯，大于此含量能明顯抑制或損傷細胞生長，從而產(chǎn)生細胞毒性。α－熊果苷在較高濃度下對細胞的生長也不產(chǎn)生影響，因此有效性和安全性均比β－熊果苷高。

房軍等［9］研究β－熊果苷在化妝品使用過程中轉(zhuǎn)化為氫醌的可能性和條件，以及促進轉(zhuǎn)化的因素。結(jié)果β－熊果苷在酸性條件下室溫靜置72 h未分解為氫醌;β－熊果苷可被人表皮微生物和β－葡萄糖苷酶水解為氫醌，且酸性環(huán)境和人工汗液可促進β－葡萄糖苷酶對β－熊果苷的水解，并以人工汗液促進作用更強。因此認為化妝品在正?？深A(yù)見的使用條件下，其所含β－熊果苷可水解為氫醌被人體吸收，β－熊果苷是目前化妝品中常用的祛斑功效原料，用量最高可達10%，盡管以往認為β－熊果苷本身用于化妝品中是安全的，但考慮到其可能在使用過程中轉(zhuǎn)變?yōu)闅漉?，有必要重新對其安全性進行評估。

3.3 熊果苷與其他祛斑、美白劑的比較 熊果苷與其他祛斑、美白劑比較具有許多優(yōu)點，與其他皮膚脫色劑的比較:壬二酸、曲酸及其衍生物、氫醌等通過競爭和(或)非競爭機制抑制酪氨酸酶活性，減少黑素生成;維生素C及其衍生物、α－硫辛酸、α－生育酚等則通過抗氧化作用干擾黑素合成;維A酸阻止黑素向角膜細胞的轉(zhuǎn)運，導(dǎo)致色素減退;不飽和脂肪酸可刺激細胞更新，促進含黑素顆粒的角質(zhì)形成細胞脫落，因而產(chǎn)生脫色作用;部分中藥單體或方劑通過不同途徑發(fā)揮脫色劑作用。其中維生素C針劑與氫醌對酪氨酸酶活性的抑制率最高，且達到半數(shù)抑制的濃度最低，所以美白效果最好。但在實際應(yīng)用中，由于氫醌有較強的細胞毒性，會造成皮膚永久脫色 ，已經(jīng)被逐漸淘汰。而維生素C的美白效果，跟其本身的結(jié)構(gòu)和狀態(tài)有很大的關(guān)系，通常只有左旋維生素C才有美白效果。維生素C是水溶性的，不易滲透到皮膚角質(zhì)層，本身易氧化而且不穩(wěn)定，故其應(yīng)用受到限制。通常與金屬(如鈉、鈣)結(jié)合，以維持其穩(wěn)定性，或以維生素C衍生物的形式應(yīng)用于化妝品中。熊果苷祛斑、美白效果較好，細胞毒性相對小，性質(zhì)穩(wěn)定，所以是目前應(yīng)用最為廣泛的祛斑藥物和美白劑。使用熊果苷制劑可有效減輕黃褐斑的著色程度和縮小皮損面積。

4 熊果苷的檢測研究進展

4.1 熊果苷在藥物中的檢測 唐新雯等［10］采用薄層掃描法測定毛大丁草中熊果苷含量，毛大丁草為菊科毛大丁草屬植物毛大丁草(Cerbera piloselloides Cass)的全草，具有利水止咳、活血行氣的功效，主要有效成分熊果苷具有鎮(zhèn)咳、抗炎作用。測定波長λs=420 nm，λR=700 nm。展開劑為乙酸乙酯－丁酮－甲酸－水(10∶1∶1∶1)。結(jié)果熊果苷點樣量在1.005～8.040 μg范圍內(nèi)與斑點峰面積線性關(guān)系良好，平均加樣回收率為 102.5%，RSD 為 1.93%(n=5)。

林彩等［11］采用高效液相色譜(HPLC)法對復(fù)方維生素E霜中維生素E和熊果苷的含量進行了測定，熊果苷的含量測定采用正相高效液相色譜法，維生素E的含量測定采用反相高效液相色譜法，結(jié)果熊果苷質(zhì)量濃度在14.78～25.48 μg/ml范圍內(nèi)與峰面積線性關(guān)系良好(r=0.999 8)，平均加樣回收率為100.50%，RSD為2.06%(n=9);維生素E質(zhì)量濃度在14.42～26.78 μg/ml范圍內(nèi)與峰面積線性關(guān)系良好(r=0.999 7)，平均加樣回收率為97.21%，RSD 為2.64%(n=9)。

趙潔等［12］建立高效液相色譜法測定梨樹葉中熊果苷的含量，高效液相色譜分析時用Inertsil ODS－3色譜柱分離，甲醇－水(1∶9)洗脫，282 nm檢測。高效液相色譜法定量分析時線性關(guān)系良好，熊果苷的回收率 ＞93%，RSD ＜2.1%。

張海豐［13］等建立HPLC測定紫景天中熊果苷含量的方法，采用Agilent XDB－C18色譜柱(4.6 mm×150 mm，5 μm)，以甲醇 －水(20∶80)為流動相，流速:0.8 ml/min，柱溫為室溫，檢測波長為282 nm。結(jié)果熊果苷進樣量在5～160 μg范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，r=0.999 8，平均加樣回收率為 101.67%，RSD 為 3.06%(n=6)。

4.2 熊果苷在化妝品中的檢測 熊果苷在美白護膚化妝品中應(yīng)用日趨廣泛，雖然目前尚未建立化妝品標準規(guī)范方法，但此方面的研究已引起人們廣泛的興趣。近年來也取得了一定進展。采用傅立葉紅外光譜法在氮氣保護下測定熊果苷的濃度，測量精度和穩(wěn)定性較好。

劉心同［7］等采用溶出伏安法測定了化妝品中的熊果苷，并對萃取溶劑、萃取時間、共存物質(zhì)的影響進行了討論，研究表明用氯仿作為萃取溶劑，萃取時間為10 min時，試驗結(jié)果最佳，且樣品中共存物質(zhì)L－谷氨酸、L－精氨酸、L－白氨酸、L－絲氨酸、谷氨酰氨、L－半胱氨酸、纈氨酸、L－色氨酸、L－酪氨酸、檸檬酸、葡萄糖、Mn2+、Ca2+、Co2+、Cu2+、Ni2+、Al3+、Mg2+、Ba2+、Fe3+、Pb2+不干擾熊果苷的測定。

程鵬等［14］建立了美白類化妝品中熊果苷的兩種光學(xué)異構(gòu)體α－熊果苷和β－熊果苷及煙酰胺的高效液相色譜檢測方法。樣品用氯化鈉水溶液－氯仿(2∶1)進行萃取。固定相為依利特ODS－BP柱(200 mm × 4.6 mm，5 μm) ，流動相為甲醇 － 水(10∶ 90)，柱溫為 25℃，檢測波長為 220 nm，流速為 0.5 ml/min，進樣量為20 μl。在上述條件下α－熊果苷、β－熊果苷和煙酰胺的質(zhì)量濃度依次在0.07～50、0.06～50、0.05～50 mg/L時與色譜峰面積之間的線性關(guān)系良好，相對標準偏差(n=7)分別為1.65%、1.73%和1.33%。將該方法用于化妝品的檢測，回收率為91.7% ～109.6%。

周烽等［15］探討了高效液相色譜法同時測定美白化妝品中熊果苷和氫醌含量的方法，先對樣品進行預(yù)處理，處理液為氯仿－飽和氯化鈉溶液(2∶1)，再選用Apollo C18柱，以甲醇 －磷酸緩沖液 －冰醋酸(25∶475∶1)混合液為流動相，紫外檢測，波長為254 nm。實驗結(jié)果表明，該方法在0.01～0.2 g/L時具有良好的線性;平均回收率范圍為97% ～98.5%。

5 展望

熊果苷目前在祛斑藥物和化妝品美白護膚領(lǐng)域得到廣泛應(yīng)用，研究表明α－熊果苷比β－熊果苷效果更為穩(wěn)定和安全，能夠更方便地加入到各種美白亮膚化妝品中。國內(nèi)外美容專家指出，21世紀國際美白護膚品的市場將是熊果苷市場，同時，應(yīng)進一步開展熊果苷應(yīng)用于祛斑藥物和化妝品的安全性研究，特別是β－熊果苷安全性研究。

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