徐 暉，閆志華，郭曉希

（華中師范大學 化學學院 農(nóng)藥與化學生物學教育部重點實驗室，武漢 430079）

整體柱毛細管電泳與質(zhì)譜聯(lián)用檢測肺癌患者尿液中的己醛和庚醛

徐 暉＊，閆志華，郭曉希

（華中師范大學 化學學院 農(nóng)藥與化學生物學教育部重點實驗室，武漢 430079）

采用外補充鞘流液的接口形式，實現(xiàn)毛細管電泳與質(zhì)譜的聯(lián)用，在石英毛細管（100μm i.d.）內(nèi)原位合成3mm長的聚甲基丙烯酸－乙二醇二甲基丙烯酸酯［poly（MAA－co－EDMA）］整體柱，進行樣品的在線衍生化、在線預富集以及分離檢測.建立了醛類物質(zhì)的毛細管電泳－質(zhì)譜聯(lián)用分析方法，并應用于肺癌患者尿樣中己醛和庚醛的檢測.對緩沖液濃度，分離電壓等條件進行了優(yōu)化，方法的相對標準偏差為6.7%～13.9%，檢測限在0.15～0.18mol·L－1范圍內(nèi).該方法分析速度快，靈敏度高，為CE／MS的聯(lián)用提供了一種新的裝置設(shè)計思路.

毛細管電泳／質(zhì)譜；整體柱；醛類化合物；肺癌代謝標志物；尿液分析

毛細管電泳（capillary electropho－resis，CE）和質(zhì)譜（Mass spectrometry，MS）分析技術(shù)的聯(lián)用是一種具有優(yōu)良應用前景的分析工具，因為這種方法既具有CE的低樣品消耗量、高分離效率的優(yōu)勢，又兼?zhèn)銶S的快速、定性鑒定、高靈敏度的優(yōu)勢，二者的結(jié)合使該方法成為復雜樣品中低含量組分分析的有力工具.CE／MS被廣泛地應用于各個領(lǐng)域，包括基因組學［1-2］，蛋白質(zhì)組學［3-5］，藥物分析［6-7］，代謝物鑒定［8-9］，生物標記物的發(fā) 現(xiàn)［10］，食品科學［11］.CE／MS聯(lián)用技術(shù)及其應用已有綜述報道［12］.

電噴霧離子化（Electro－spray ionization，ESI）是最適合于 CE／MS聯(lián)用的離子化方式［13-14］.其原因有兩個：一是此方式可以檢測多種不同質(zhì)量數(shù)的荷電分子；二是經(jīng)過CE分離過的樣品可直接進入質(zhì)譜進行分析.但是，ESI的電噴霧口需要在CE的末端帶電，這比高效液相色譜／質(zhì)譜聯(lián)用（Highperformance liquid chromatrography／mass spectrometry，HPLC／MS）的接口要難得多.由于分離毛細管的內(nèi)徑很小，要使末端帶電，這就成為了一個物理學的挑戰(zhàn).再者，毛細管電泳的流速很低（納升級），不利于得到穩(wěn)定的電噴霧流.解決這個問題的方式之一就是補充鞘流液，這個方法不僅可以得到了穩(wěn)定的電噴霧流，而且使在電噴霧口處施加高電壓更為便利［15-17］.但是，鞘流會稀釋樣品溶液使分析靈敏度降低［17］，Chen課題組采用了一個錐形的噴霧口以降低這種稀釋作用［18］.

無鞘流接口可降低鞘流在噴霧口的稀釋作用，但在CE／MS的噴霧口施加分離電壓仍然是一個問題.為解決這個問題可在毛細管末端的外緣粘上一個電極或可導電的聚合物，但這種接口的壽命很短.最好的解決方法是制造一個裝置將CE和MS相連，無鞘 流補充［9，19-20］，這種方法的缺點也是壽命短.另一種無鞘流補充的方法是將CE的出口和電噴霧的出口合二為一，但制作難度很大［21-23］.

本實驗采用外補充鞘流液的接口形式，實現(xiàn)了毛細管電泳與質(zhì)譜的聯(lián)用，并在毛細管中制備了poly（MAA－co－EDMA）整體柱，進行樣品的在線預處理，建立了醛類肺癌代謝標志物的毛細管電泳－質(zhì)譜聯(lián)用的分析新方法.優(yōu)化了一系列實驗條件，并將此方法應用于肺癌患者尿樣中己醛和庚醛的檢測.為CE／MS的聯(lián)用，提供了一種新的裝置設(shè)計思路.

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

乙二醇二甲基丙烯酸酯（EDMA）購自Sigma－Aldrich公司（Milwaukee，WJ）；醋酸銨，甲基丙烯酸（MAA），十二醇和甲苯購自上海國藥集團（Shanghai，P.R.China）；2，4－二硝基苯肼（DNPH）購自CHEM SERVICE公司（West Chester，PA，USA）；乙腈和甲醇為色譜純試劑，均購自TEDIA 公 司（Tedia Company，Inc.，F(xiàn)airfield，OH，USA）；己醛（98%），庚醛（97%）均購自 ABCR GmbH公司（Germany）.實驗用水為高純蒸餾水（Millipore Simplicity 185，Billerica，MA，USA）.彈性熔融石英毛細管（100μm i.d.）購自河北永年光纖廠.

1.2 標準溶液的配置

己醛、庚醛的標準儲備液（5mmol／L）配于甲醇中，于4℃下保存，不同濃度的標準溶液由磷酸鹽緩沖溶液（PBS，25mmol／L，pH 2.2）逐級稀釋而成.DNPH在乙腈∶水＝1∶5的溶液中進行重結(jié)晶純化，干燥后以乙腈為溶劑，配成10mmol／L的儲備液，于4 ℃下保存.125μmol／L的標準溶液由PBS（25mmol／L，pH 2.2）稀釋而成.

1.3 Poly（MAA－co－EDMA）整體柱毛細管的制備

1.3.1 毛細管的活化 將毛細管（ID：100μm，長25cm）依次以1mol·L－1NaOH和1mol·L－1HCl活化后，用二次蒸餾水洗至呈中性，再在160℃下通N2活化10h.

1.3.2 毛細管內(nèi)壁修飾 將3－（三乙氧基硅丙基）甲基丙烯酸酯的甲醇溶液（50%，V∶V）注入毛細管中，兩端以硅橡膠封口后于40℃下反應10h，再將溶液排出后以甲醇徹底清洗，并用N2吹干.

1.3.3 Poly（MAA－co－EDMA）整體柱毛細管的制備 取單體 MAA，交聯(lián)劑EDMA，光引發(fā)劑Irgacgure 184，致孔劑甲苯和十二醇按一定比例混合，通N2除氧后將混合液注入毛細管中.毛細管兩端立即以硅橡膠封口，刮去石英毛細管一側(cè)（距端口2至3cm）的聚酰亞胺涂層，長約3mm，在紫外光下聚合3min.聚合完成后，以甲醇充分清洗毛細管，除去未反應的功能單體、交聯(lián)劑和致孔劑.

1.4 儀器設(shè)備

Waters e2695ACQUITYTM型Waters液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀，NJUASI－100芯片電泳程控高壓電源，LSP02－1B型注射泵（Langer pump Co.，LTD，Bao Ding，China），紫外交聯(lián)儀（420W 高壓汞燈），KQ－100DE型數(shù)控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司），0.2mL PCR管，1mL微量進樣器.

質(zhì)譜儀器的方法條件：

1）離子源：ESI；2）掃描方式：負離子掃描；3）檢測方式：多反應監(jiān)測；4）電噴霧電壓：2.98kV；5）霧化氣壓力：599L·h－1；6）氣簾氣壓力：49L·h－1；7）輔助加熱氣：350 ℃；8）離子源溫度：119℃；9）檢測離子對，碰撞氣能量和去簇電壓見下表1.

表1 檢測離子對，碰撞氣能量和去簇電壓Tab.1 Experimental parameters of ion pair，energy of collision gas and cluster voltage

1.5 尿樣制備

5份肺癌病人尿樣取自湖北省腫瘤醫(yī)院，4份正常人尿樣取自健康自愿者.尿樣在4℃下經(jīng)過12 000r／min，轉(zhuǎn)離心3min后保存在4℃下的冰箱中，測定時，取上層清液.

1.6 操作方法

CE－MS聯(lián)用裝置由本實驗室自行搭建，如圖1所示.在毛細管后端原位光引發(fā)合成一段3mm長的聚合物整體柱，以此為分離毛細管.由三通將毛細管和質(zhì)譜連接起來，用微量注射泵恒速推動毛細管中的樣品溶液進入三通，液－質(zhì)聯(lián)用儀的液相色譜泵驅(qū)動鞘流液，在三通中與毛細管中的樣品溶液會合形成同軸液流，進入質(zhì)譜的ESI離子源.同軸鞘流液能夠保證穩(wěn)定的液流，提高進樣溶液在ESI噴口處的離子化效率.同時，以泵針和三通為電極，施加2 000V電泳分離電壓.為了減少在三通交匯處的死體積以及樣品在此處的稀釋效應，采用了內(nèi)徑為65μm的三通，且對其進行了改造，提高了方法的靈敏度.

實驗的具體操作方法如下：

a）用注射器吸取0.2mL的甲醇清洗、活化萃取柱.用0.2mL樣品基質(zhì)即PBS平衡柱子.泵速度為10μL·min－1；

圖1 毛細管電泳與質(zhì)譜聯(lián)接裝置圖Fig.1 Installation diagram of the connection of capillary electrophoresis－mass spectrometry

b）取20μL的DNPH（125μmol·L－1，PBS）通過萃取柱，吸附DNPH；

c）20μL的醛混合溶液（10μmol·L－1，PBS）上樣，衍生富集；

d）用0.1mL醋酸銨溶液（20mmol·L－1）清洗未反應的試劑；

e）用0.5mL醋酸銨（20mmol·L－1）∶乙腈＝1∶1為解析液，外加泵驅(qū)動解析液輔助解吸，泵的流速為10μL·min－1，并在毛細管兩端施加2000V的電壓，補充鞘流液為甲醇∶水∶甲酸＝50∶50∶1，流速為10μL·min－1，通過三通混合后進入ESI質(zhì)譜分析.

2 實驗結(jié)果討論

2.1 運行液濃度的選擇

選擇揮發(fā)性有機鹽醋酸銨作為毛細管電泳運行液，因其具有一定的離子強度和緩沖能力，且不會對質(zhì)譜造成嚴重的污染.另外，由于醛類和DNPH的衍生化反應在酸性條件下的反應速率更高［24］，因此pH 2.2被選作運行液的pH 值；除此之外，運行液的濃度會直接影響離子強度及電滲流，濃度高則電滲流速度大，濃度低則電滲流速度小.本實驗在5～25mmol·L－1范圍內(nèi)優(yōu)化了醋酸銨的濃度，最后選擇20mmol·L－1醋酸銨（pH 2.2）為最佳鞘流液.

2.2 泵的流速的選擇

由于電滲流的速度通常在幾納升到幾十納升之間，而實驗所用質(zhì)譜的離子源是常規(guī)的微升級離子源.因此，我們采取了外部輔助加速電泳溶液流速的方法提供穩(wěn)定的噴霧流.另外，由此增加的背壓有利于抵消離子源內(nèi)高氮氣壓力，有利于毛細管電泳溶液順利進入質(zhì)譜.本實驗研究泵流速在4～12μL·min－1范圍內(nèi)變化對目標分析物信噪比的影響，如下圖2所示.隨著泵流速的增加，分析物的信噪比也隨之增加，這是由于泵的流速太慢造成進樣溶液進入質(zhì)譜的速度過慢，解析所需要的時間延長，峰展寬嚴重；但是，泵流速過快又使ESI噴口處流速增加，致使離子化效率降低.另外，過高的鞘流液速度對分析物的稀釋作用增強，信號顯著降低.因此最后選擇10μL·min－1作為泵的流速.

圖2 泵的流速對信噪比的影響Fig.2 Effect of flow rate of pump on S／N

2.3 毛細管電泳電壓的選擇

毛細管電泳的分離電壓也是影響電泳分離的重要因素之一.它既能影響己醛和庚醛衍生化產(chǎn)物的分離效率，同時又能改變毛細管的電滲流.但是，由于有泵輔助推動毛細管中液體的流動，因此，分離電壓對衍生化產(chǎn)物的分離效率影響甚微，對電滲速度有一定影響.本實驗研究了分離電壓從1 000V到5 000V的變化，對衍生化產(chǎn)物信噪比的影響，如圖3所示.最后選擇2 000V為最佳分離電壓.

圖3 分離電壓對信噪比的影響Fig.3 Effect of separation voltage on S／N

2.4 解析液比例的優(yōu)化

選擇醋酸銨和乙腈的混合溶液作為解析液，其中，醋酸銨溶液作為毛細管電泳的運行液，乙腈作為整體柱的解析液，洗脫整體柱上富集的目標分析物，這二者比例的選擇要兼顧毛細管電泳和解析效率兩個方面.本實驗研究了醋酸銨與乙腈的比例從6∶4改變至2∶8對分析信號的影響，如圖4所示，選擇了5∶5的比例為醋酸銨和乙腈的最佳比例.

圖4 解析液的比例對信噪比的影響Fig.4 Effect of ratio of desorption solution on S／N

2.5 標準曲線及檢出限

在最優(yōu)的實驗條件下，配置一系列己醛和庚醛的標準工作溶液，濃度范圍在0.5～10μmol·L－1之間，進行CE／MS檢測，以分析物濃度對離子強度做標準曲線，獲得良好的線性，檢出限（LOD）按照S／N＝3計算，結(jié)果見表2.

表2 線性方程和檢出限Tab.2 Linear equation and limit of detection

考察了本方法的日間和日內(nèi)重現(xiàn)性，對0.5μmol·L－1和10μmol·L－1兩組不同濃度的醛類標準溶液分別平行測定6次，結(jié)果見表3.測得的相對標準偏差（RSD）在6.7%～13.9%之間，表明此方法的重現(xiàn)性較好.

表3 重現(xiàn)性和回收率Tab.3 Reproducibility and recovery

2.6 富集效果

在同樣條件下，我們做了醛衍生物直接CE／MS分析和采用本實驗構(gòu)建的在線預衍生富集／CE／MS系統(tǒng)分析的對比實驗.如圖5a所示，該圖為己醛和庚醛的混合溶液（2（μmol·L－1）與衍生化試劑DNPH（125μmol·L－1）在室溫下進行衍生化反應后，直接使用空毛細管與三通聯(lián)接進質(zhì)譜檢測得到的多反應監(jiān)測總離子流圖.

圖5 醛衍生物在不同方法下的MRM圖（a：CE／MS，b：在線衍生富集／CE／MS）Fig.5 The MRM chromatogram of aldehyde derivatives in（a）CE／MS and（b）online derivatization－preconcentration／CE／MS

圖6 空白和加標病人尿樣的在線衍生富集／CE／MS的MRM圖Fig.6 The MRM chromatogram of blank（a）and spiked urine（b）of lung cancer patients

圖5b為在線衍生預富集／CE／MS系統(tǒng)分析的TIC圖.具體條件如下，先在整體柱上富集20μL的衍生化試劑DNPH（125μmol·L－1）；再將20μL的己醛、庚醛混合液（10μmol·L－1，PBS）上樣，進入毛細管整體柱進行在線衍生反應和在線預富集；最后以醋酸銨和乙腈的混合溶液為運行緩沖溶液進行毛細管電泳質(zhì)譜分析.分析物的響應信號大大增強，富集倍數(shù)是直接進樣的123倍，可見，這種方法有一定的研究價值和擴展空間.

2.7 實際樣品

用建立的方法檢測了5份癌癥患者和4份正常人尿樣中的己醛和庚醛的含量.其中正常對照組中沒有醛類分析物檢出，而肺癌患者尿樣中能檢出己醛和庚醛，它們的含量范圍分別是0.604～0.709μmol·L－1，0.926～1.01μmol·L－1.由此可見，肺癌患者尿樣中兩種醛的含量明顯高于健康對照組.此外，還在實際樣品中進行了加標回收實驗.圖6a，6b分別為癌癥患者尿樣和加標2μmol·L－1尿樣的MRM圖，方法的加標回收率為44.7%～54.5%，穩(wěn)定的回收率表明此方法在實際樣品的檢測方面具有一定的應用價值.

3 結(jié)論

以poly（MAA－co－EDMA）整體柱為萃取介質(zhì)，利用在線衍生化、在線預富集方法，并結(jié)合毛細管電泳與質(zhì)譜在線聯(lián)用技術(shù)，建立了尿樣中癌癥代謝標記物己醛和庚醛的分析方法.實驗結(jié)果表明，這種方法具有很好的富集效果，分析速度快，靈敏度較高，具有一定的研究前景.

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Determination of hexanal and heptanal in urine samples of lung cancer patients by monolithic columns capillary electrophoresis－mass spectrometry

XU Hui，YAN Zhihua，GUO Xiaoxi
（College of Chemistry，Huazhong Normal University，Wuhan 430079）

In this work，capillary electrophoresis was hyphenated with ESI mass spectrometer（CE／MS）with the assistant of external supplement of sheath liquid.A 3mm poly（metharylic acid－co－ethlyene dimethacrylate）monolith was in－situ synthesized inside a fused－silica capillary（100μm i.d.）for online derivatization and online preconcentration.An analysis method of CE／MS was established for the determination of hexanal and heptanal in the human urine samples.The condition parameters，including concentration of running buffer solution and separation voltage were optimized.The quantitative results showed that the limit of detection of aldehydes ranged from 0.15to 0.18μmol·L－1with the relative standard deviation of 6.7%～13.9%.The new method is simple，sensitive and efficient.It provides an alternative device strategy for the combination of CE with ESI／MS.

capillary electrophoresis／mass spectrometry；monolith；hexanal and heptanal；lung cancer biomarkers；urine analysis

O657.8

A

1000－1190（2012）01－0049－06

2011－10－07.

國家自然科學基金項目（20805017，21175052）；武漢市晨光計劃（201050231025）.

＊E－mail：huixu＠m(xù)ail.ccnu.edu.cn.