吳麗蘋

（汕頭市質(zhì)量計(jì)量監(jiān)督檢測(cè)所，廣東 汕頭 515000）

一、PCR的原理及技術(shù)發(fā)展

聚合酶鏈反應(yīng)技術(shù)是一種體外酶促合成，擴(kuò)增特定DNA片斷的方法。該技術(shù)于1985年由美國(guó)的KaryMullis等人首創(chuàng)并由美國(guó),Cetus公司開發(fā)。其原理是：在存在DNA模板、引物、DNTP、適當(dāng)緩沖液(Mg2+)的反應(yīng)混合物中，在熱穩(wěn)定DNA聚合酶的催化下，對(duì)一對(duì)寡核苷酸引物所界定的DNA片斷進(jìn)行擴(kuò)增。這種擴(kuò)增是通過(guò)模板DNA、引物之間的變性、退火(復(fù)性)、延伸等三步反應(yīng)為一個(gè)周期，循環(huán)進(jìn)行，使目標(biāo)DNA片段得以擴(kuò)增。由于每一周期產(chǎn)生的DNA片斷均能成為下一次循環(huán)的模板，故PCR產(chǎn)物以指數(shù)形式增加。

目前，聚合酶鏈反應(yīng)技術(shù)本身獲得長(zhǎng)足進(jìn)步，可靠性不斷提高，以聚合酶鏈反應(yīng)技術(shù)為基礎(chǔ)的相關(guān)技術(shù)得到了很大的發(fā)展。如反相PCR(lnverse-PCR)、反轉(zhuǎn) PCR(RT-PCR)、隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性 DNA技術(shù) (RAPD)，免疫 PCR(lmmuno-PCR)，不對(duì)稱 PCR(Asymmetric PCR)、多重PCR(MultipleprimerPCR)、固相PCR等。在關(guān)鍵技術(shù)上也有所進(jìn)步，如熱循環(huán)儀在質(zhì)量和技術(shù)上的發(fā)展；引物的設(shè)計(jì)可通過(guò)計(jì)算機(jī)和網(wǎng)絡(luò)來(lái)實(shí)現(xiàn)；已發(fā)展出多種具有各種不同特性的聚合酶體系和酶反應(yīng)體系；目前已開發(fā)出了一系列的DNA聚合酶試劑盒，簡(jiǎn)化了聚合酶鏈反應(yīng)技術(shù)操作，提高了實(shí)驗(yàn)的重現(xiàn)性。

二、聚合酶鏈反應(yīng)技術(shù)檢測(cè)食品中沙門氏菌

1.模板的制備。聚合酶鏈反應(yīng)技術(shù)檢測(cè)方法的可靠性一部分依賴于目標(biāo)模板的純度和足夠的目標(biāo)分子數(shù)量，大多數(shù)聚合酶鏈反應(yīng)檢測(cè)仍要求富集步驟。研究表明，如果細(xì)菌在檢測(cè)前可從食品原樣中分離、濃縮、純化，許多快速分子學(xué)方法的檢測(cè)效果可得以改善。目前，離心、過(guò)濾、陰陽(yáng)離子交換樹脂、固定化凝集素和免疫磁性分離法已報(bào)道用于食品體系中細(xì)菌的濃縮。LisaA Lucore等研究了金屬氫氧化物固定技術(shù)對(duì)乳品中腸炎沙門氏菌細(xì)胞的濃縮。用鋯氫氧化物與細(xì)胞固定后，樣品體積減少50倍，接種的細(xì)菌有78%～96%復(fù)蘇，固定化的細(xì)菌仍保持活力可用標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)法計(jì)數(shù)。用聚合酶鏈反應(yīng)技術(shù)檢測(cè)，限值為101～102cfu/25mLNFDM(復(fù)原無(wú)脂干奶粉)。對(duì)全脂牛奶、冰淇淋檢測(cè)，限值分別為≥102cfu/mL和≥101cfu/mL。該法可很好解決減少樣品體積，有活性細(xì)菌的濃縮，聚合酶鏈反應(yīng)抑制劑的去除等問(wèn)題。KeithALampel則應(yīng)用FTA過(guò)濾來(lái)制備模板。FTA過(guò)濾器是一種滲透有螯合劑和變性劑的纖維狀基質(zhì)，這些物質(zhì)可有效地在與微生物接觸中與之螯合使之解離。作者用來(lái)源于純培養(yǎng)基和人為污染食物中不經(jīng)前增菌和純化的鼠傷寒沙門氏菌進(jìn)行FTA過(guò)濾，濾液直接作為模板來(lái)分析該法的敏感性和可運(yùn)用性。結(jié)果表明，F(xiàn)TA過(guò)濾來(lái)制備聚合酶鏈反應(yīng)模板可減少步驟、時(shí)間，可顯著減少樣品的丟失，防止敏感性下降。。

2.引物設(shè)計(jì)。根據(jù)所選沙門氏菌靶序列的不同，目前常在下面幾種序列內(nèi)進(jìn)行引物設(shè)計(jì)。

（1）沙門氏菌鞭毛蛋白的基因序列在許多細(xì)菌中，鞭毛都是重要的毒力因子，不僅鞭毛所提供的動(dòng)力可能是細(xì)菌侵入細(xì)胞的重要因素，鞭毛可以作為粘附素，決定了細(xì)菌在細(xì)胞表面的吸附，以及其后的侵入和定居過(guò)程。Song等根據(jù)該序列設(shè)計(jì)內(nèi)、外引物進(jìn)行套式聚合酶鏈反應(yīng)，除傷寒沙門氏菌能擴(kuò)增出特異性DNA片斷外，其余沙門氏菌和其它菌群均無(wú)特異性擴(kuò)增，且能與副傷寒沙門氏菌區(qū)別開。

（2）編碼菌毛的fimA基因序列已證明，細(xì)菌表面的附屬器官如菌毛，纖毛介導(dǎo)與上皮表面的特異受體相結(jié)合。鼠傷寒沙門氏菌和其它腸道菌科的其它病原菌產(chǎn)生形態(tài)、抗原相關(guān)的侵襲性I型菌毛。在沙門氏菌株中，I型菌毛表型的表達(dá)由一系列基因編碼，fimA基因編碼主要的菌毛亞單元。Cohen等根據(jù)fimA基因設(shè)計(jì)特異引物，用于牛奶等食品樣品中沙門氏菌的PCR檢測(cè)。

（3）與沙門氏菌質(zhì)粒毒力相關(guān)的,SPV基因序列對(duì)許多有重要醫(yī)學(xué)意義的細(xì)菌來(lái)說(shuō)，質(zhì)粒不僅編碼毒力因子，還編碼某種調(diào)控蛋白，控制毒力因子的產(chǎn)生。含有致病性質(zhì)粒的細(xì)菌是致病性的，丟失了致病性質(zhì)粒的細(xì)菌，對(duì)人或動(dòng)物不再致病，或致病力下降。Mahon等以鼠傷寒沙門氏菌的質(zhì)粒毒力相關(guān)基因,SpvR合成引物進(jìn)行聚合酶鏈反應(yīng)檢測(cè)，結(jié)果含該基因的沙門氏菌株都得到了特異性的擴(kuò)增產(chǎn)物，而不含質(zhì)粒和含質(zhì)粒而無(wú)該毒力基因的菌株無(wú)特異性擴(kuò)增。

（4）編碼吸附和侵襲上皮細(xì)胞表面蛋白的inv基因序列沙門氏菌、志賀氏菌、耶爾森氏菌等許多腸道病原性細(xì)菌具有侵襲宿主上皮細(xì)胞的能力。侵襲是病原菌導(dǎo)致慢性感染的原因之一。inv基因序列是一組基因，包括invA、invB、invC、invD、invE等。Rahn等人根據(jù)invA基因設(shè)計(jì)引物，進(jìn)行PCR檢測(cè)，結(jié)果沙門氏菌屬都得到特異性的DNA片斷，而非沙門氏菌無(wú)特異性擴(kuò)增。

（5）沙門氏菌侵襲基因正調(diào)節(jié)蛋白hilA在沙門氏菌中已發(fā)現(xiàn)了5個(gè)毒力島，分別命名為,SPI1、SPI2、SPI3、SPI4、SPI5。其中,SPI1編碼 III型分泌系統(tǒng)，與沙門氏菌對(duì)腸道上皮細(xì)胞的侵襲力有關(guān)。SPI1存在于所有侵襲性沙門氏菌中。hilA為,SPI1的毒力基因之一，是許多侵襲基因的正轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)蛋白。XuanGuo]用根據(jù)hilA和sirA設(shè)計(jì)的四對(duì)引物以檢測(cè)番茄原料中,SalmonelleMontevido,其中有一對(duì)hilA引物可特異性檢測(cè)沙門氏菌。

（6）編碼沙門氏菌LPSO抗原的rfb基因脂多糖(LPS)作為革蘭氏陰性菌外膜主要成分，其多糖部分(含O-特異性多糖和核心多糖)參與了細(xì)菌對(duì)宿主細(xì)胞的粘附、侵襲和在細(xì)胞間擴(kuò)散的過(guò)程，是細(xì)菌主要的致病因子之一。Luk等根據(jù)rfbJ、rfbS,基因序列分別設(shè)計(jì)引物，可檢測(cè)A、B、C、D組血清型沙門氏菌。

（7）編碼與蛋白質(zhì)結(jié)合的DNA的hns基因Jones.D.D根據(jù)該序列設(shè)計(jì)了上游引物L(fēng)HNS-531和下游引物RHNS-682及一條25個(gè)核苷酸的探針HNS-P，對(duì)牡蠣中污染的沙門氏菌進(jìn)行PCR-基因探針檢測(cè)，該方法可以＜40個(gè)細(xì)胞的敏感性檢測(cè)沙門氏菌屬中的多個(gè)種。

（8）檢測(cè)方法。近年來(lái)，用聚合酶鏈反應(yīng)技術(shù)檢測(cè)沙門氏菌得到了迅速發(fā)展，產(chǎn)生了許多種聚合酶鏈反應(yīng)技術(shù)。如常規(guī)A-B、套式聚合酶鏈反應(yīng)、多重聚合酶鏈反應(yīng)。也可幾種方法結(jié)合使用，如李君文[等將常規(guī)聚合酶鏈反應(yīng)與半套式聚合酶鏈反應(yīng)相結(jié)合，根據(jù)沙門氏菌中保守的6SrRNA基因?yàn)槟０逶O(shè)計(jì)了一對(duì)引物，擴(kuò)增的片段為555bp。經(jīng)過(guò)優(yōu)化設(shè)計(jì)反應(yīng)條件，只對(duì)沙門氏菌產(chǎn)生特異擴(kuò)增，敏感性達(dá)30cfu。為了對(duì)擴(kuò)增結(jié)果進(jìn)行鑒定，又在這兩條引物之間設(shè)計(jì)一條半套式引物。經(jīng)半套式聚合酶鏈反應(yīng)檢測(cè)證明第一次產(chǎn)物是正確的，且靈敏度提高至3cfu。此外，還可將聚合酶鏈反應(yīng)與微孔板檢測(cè)、與WLISA技術(shù)、與探針雜交有機(jī)結(jié)合起來(lái)。

在試圖減少檢測(cè)時(shí)間方面，RFerretti采用在緩沖蛋白胨水(BPW)中非選擇性增菌6h，然后進(jìn)細(xì)胞破碎和聚合酶鏈反應(yīng)，可在接受食品樣品后12h內(nèi)完成檢測(cè)，并可檢測(cè)不同沙門氏菌血清型。試驗(yàn)表明，在BPW8h增菌后，方法的靈敏性不增加，這限定了最佳增菌時(shí)間。增菌后，粗提、聚合酶鏈反應(yīng)、電泳共需5～6h，這樣可在12h內(nèi)完成，相對(duì)其他需更長(zhǎng)增菌時(shí)間的檢測(cè)方法來(lái)說(shuō)縮短了時(shí)間。

結(jié)束語(yǔ)。聚合酶鏈反應(yīng)技術(shù)檢測(cè)沙門氏菌的特異性，取決于所選擇的擴(kuò)增靶序列是否為沙門氏菌高度保守的特異性片斷，能否忠實(shí)地?cái)U(kuò)增靶序列，由人工合成的一對(duì)寡核苷酸引物序列決定。顯然靶序列的選擇和引物的設(shè)計(jì)是試驗(yàn)成功與否的關(guān)鍵。由于其快速、特異、敏感的特點(diǎn)，PCR技術(shù)作為一種檢測(cè)手段仍有巨大的運(yùn)用價(jià)值。而且隨著研究的不斷深入，聚合酶鏈反應(yīng)技術(shù)檢測(cè)方法也會(huì)得以發(fā)展和完善，并將在食品沙門氏菌及其它致病菌的檢測(cè)中得到更多的應(yīng)用。

[1]韓光明，張建瓊.聚合酶鏈反應(yīng)技術(shù)檢測(cè)沙門菌的研究進(jìn)展 [J].國(guó)外醫(yī)學(xué)：微生物學(xué)分冊(cè)，2000，6.

[2]李景鵬，李成梅.應(yīng)用聚合酶鏈反應(yīng)技術(shù)檢測(cè)沙門氏菌[J].中國(guó)獸醫(yī)學(xué)報(bào)，1998，6.