摘要：化妝品的皮膚吸收是其成分通過皮膚屏障進(jìn)入體內(nèi)的過程，它既是其營養(yǎng)功能成分發(fā)揮其功效的第一步。同時也是其有害成分產(chǎn)生不良反應(yīng)的開始，化妝品的皮膚吸收不僅取決于其組分和配方的特性，還與皮膚的生理狀態(tài)有關(guān)。定量檢測化妝品及其成份的皮膚吸收過程有助于對產(chǎn)品的安全性和功效性的認(rèn)識，也是危害物質(zhì)暴露評估的需要。
　　
　　皮膚是機(jī)體和外界之間的天然屏障，可防止外界有害物質(zhì)的入侵，也是化妝品經(jīng)皮吸收和發(fā)揮其功效作用的主要途徑。皮膚吸收是指化合物穿透皮膚的過程，化妝品成份的皮膚吸收研究，目的是為了獲得在正常使用情況下，化妝品成份可能進(jìn)入人體系統(tǒng)的定性和／或定量的信息。經(jīng)皮膚吸收是化妝品暴露評估的基礎(chǔ)，特別是對于原料和“活性物質(zhì)”，如著色劑、防腐劑、紫外線過濾劑，以及對使用濃度和使用部位有限制的物質(zhì)。管理部門通常要求企業(yè)必須提交化妝品成份的皮膚吸收資料。對于終產(chǎn)品一般不要求提供皮膚吸收資料，但應(yīng)該考慮到日常使用時可能出現(xiàn)的最壞情況。在過去的50年里，化妝品的體內(nèi)經(jīng)皮吸收試驗(yàn)已較少使用，體外試驗(yàn)技術(shù)逐漸成為主流測試方法。
　　
　　一，皮膚吸收和滲透作用
　　
　　1、皮膚吸收的過程
　　化合物接觸完整皮膚后，通過皮膚吸收進(jìn)入體內(nèi)有3種途徑，第一種是通過皮膚細(xì)胞間隙的途徑，第二種是穿過角質(zhì)層的跨細(xì)胞途徑，第三種是通過毛囊、汗腺管、皮脂腺等皮膚附屬器途徑，或稱旁路途徑。一般來講，由于角質(zhì)層具有低水份和高脂質(zhì)含量的特點(diǎn)，低分子量親脂性的化合物透過皮膚的能力優(yōu)于親水性的或高分子量的物質(zhì)。然而，如果長時間接觸水份而使皮膚變得含水份較高時，皮膚對親水性物質(zhì)的屏障功能自然下降。通常實(shí)驗(yàn)動物皮膚的水合能力高于人皮膚，因而提高了皮膚表面物質(zhì)的吸收速率。通過表皮的擴(kuò)散速率不單受皮膚厚度的影響，而且根據(jù)解剖位置的不同而有差異。在損傷的或病態(tài)的皮膚，屏障功能受損，物質(zhì)可能直接進(jìn)入循環(huán)系統(tǒng)。
　　外源化學(xué)物經(jīng)皮吸收包括兩個時相：穿透相即外源化學(xué)物通過被動擴(kuò)散透過角質(zhì)層，以及整個表皮層的過程；吸收相即外源化學(xué)物通過表皮達(dá)到真皮層透過毛細(xì)血管壁吸收入血的過程。脂／水分配系數(shù)較高的外源化學(xué)物易被皮膚吸收。
　　
　　2、影響皮膚吸收的因素
　eT/Nc4wpefKolPYLqVFc7A==　影響經(jīng)皮吸收的因素，不僅取決于外源化學(xué)物的理化性質(zhì)(如溶解度，分子量和極性)，而且與皮膚的接觸條件密切相關(guān)。首先是接觸部位，通常身體各部位的吸收速度從前額、腋窩、頭皮、背部、腹部、手掌到足掌依次變??；其次是年齡和性別，一般來說，新生兒皮膚滲透性比成人大，女性皮膚滲透性比男性高；第三是皮膚的完整性，損傷部位皮膚的滲透性明顯高于完整部位皮膚，當(dāng)最外層的角質(zhì)層受到損傷時，經(jīng)皮吸收量增加數(shù)百倍。此外，皮膚的溫度、濕度及pH也有影響，溫度高、濕度大的情況下，化合物的皮膚滲透速度增加，接觸面積大，時間長，經(jīng)皮吸收也增多。
　　
　　二、皮膚吸收的體內(nèi)試驗(yàn)
　　
　　化妝品成分的經(jīng)皮膚吸收可用人體體內(nèi)試驗(yàn)進(jìn)行評估，通過測量化合物經(jīng)尿液和排泄物排出體外的量來反映經(jīng)皮吸收量。但是，實(shí)際操作中，體內(nèi)實(shí)驗(yàn)受到許多因素的制約，如檢測方法的敏感性、倫理約束、化合物及其代謝產(chǎn)物的排出速率、個體差異等。因此，對于化妝品成分來說，沒有實(shí)際應(yīng)用價值。同樣，用體內(nèi)動物實(shí)驗(yàn)檢測化妝品的經(jīng)皮吸收也是非常過時的，幾乎所有的化妝品安全評價均采用體外方法。除非在必要時，如用于體內(nèi)與體外方法的對比，特殊活性物質(zhì)皮膚吸收的確認(rèn)，可采用無毛的裸鼠進(jìn)行體內(nèi)研究(執(zhí)行OECD 427)。
　　
　　三、皮膚吸收和滲透的體外試驗(yàn)方法
　　
　　經(jīng)皮吸收的體外方法已廣泛用于化妝品檢測中，如體外擴(kuò)散池法、人工膜滲透法和數(shù)學(xué)模型等，其中擴(kuò)散池試驗(yàn)是評價化合物經(jīng)皮通透性的最好的方法。
　　
　　1、體外試驗(yàn)的原理及考慮因素
　　正常表皮角質(zhì)層構(gòu)成了皮膚抵抗外源物質(zhì)滲透和吸收進(jìn)入機(jī)體的主要屏障，而體外培養(yǎng)的離體皮膚、去真皮表皮層和重建人體皮膚模型，具有與體內(nèi)相似的屏障結(jié)構(gòu)和功能，因此，可用具有屏障功能的離體皮膚、去層皮膚或皮膚替代物進(jìn)行體外實(shí)驗(yàn)。體外評價方法比體內(nèi)測試具有優(yōu)越性，表現(xiàn)在：受試樣品可直接接觸皮膚表面，操作簡單，便于測定；可直接測定化合物透過皮膚的全身吸收速度，避免了尿排泄速度推算法可能帶來的誤差；對于某些劇毒性物質(zhì)只能用體外方法進(jìn)行研究；通過控制實(shí)驗(yàn)條件，可改變影響物質(zhì)通透性的因素，也可模擬體內(nèi)條件，預(yù)測化合物分子經(jīng)過皮膚進(jìn)入體內(nèi)的動力學(xué)過程。
　　但是體外方法也有其不足之處，主要表現(xiàn)在：體外研究中的微循環(huán)是不完善的，因此化合物的再吸收能力并不能被充分地研究。表皮通過連續(xù)的增生、分化和角化過程不斷更新，每天約有一層角化細(xì)胞從表皮脫落。局部應(yīng)用受試物后，外來物質(zhì)可在體外皮膚中，特別是在角質(zhì)層和毛囊皮脂腺單位中檢測到，而在體內(nèi)，外來物質(zhì)可能通過脫屑或皮脂腺分泌而被排出。這些過程在體外皮膚中是不存在的，因此，外來物質(zhì)在體外表皮中的水平可能高于相應(yīng)的體內(nèi)水平。外來化學(xué)物經(jīng)皮吸收的過程包括擴(kuò)散和代謝兩個過程，因此，除了評價物理一化學(xué)過程外，還應(yīng)包括酶的代謝作用。通常離體皮膚僅能代表皮膚中的表皮及真皮上部，不能反映在體皮膚的血管系統(tǒng)、酶系統(tǒng)等對化學(xué)物質(zhì)的通透性及代謝的影響。因此，對于某些物質(zhì)的評價，體外實(shí)驗(yàn)必需與體內(nèi)實(shí)驗(yàn)相結(jié)合。
　　綜合以上考慮，體外皮膚吸收研究的方案包括以下內(nèi)容：選擇合適的標(biāo)準(zhǔn)化的皮膚進(jìn)行研究，選用非標(biāo)準(zhǔn)化的皮膚應(yīng)當(dāng)說明其合理性；試驗(yàn)結(jié)束后，應(yīng)進(jìn)行總質(zhì)量平衡；應(yīng)當(dāng)考慮到受試物在體內(nèi)可能發(fā)生的經(jīng)皮膚代謝。有時受試物可能會與表皮發(fā)生不可逆結(jié)合，隨后經(jīng)體內(nèi)皮膚表面的脫屑作用排出體外，如推測存在這一機(jī)制，必須另外的試驗(yàn)加以證明。
　　
　　2、體外皮膚模型
　　選擇人體皮膚研究化合物的體外經(jīng)皮吸收作用效果最好，缺點(diǎn)是皮膚來源困難，且存在通透性的個體差異。故更多的實(shí)驗(yàn)中選擇動物皮膚代替人體皮膚，皮膚來源包括小鼠、大鼠、兔、狗、豬、猴以及豚鼠等。小鼠、大鼠和兔缺少汗腺但毛囊比人類要多，在這些動物中，化合物經(jīng)皮吸收的毛囊路徑很可能起到重要作用。在不同物種間，常用的幾種哺乳類實(shí)驗(yàn)動物的角質(zhì)層脂質(zhì)在總的類型上沒有明顯差異，主要組成為神經(jīng)酰胺，膽固醇(包括膽固醇脂)和游離脂肪酸酯，但在脂質(zhì)數(shù)量上種屬間有些不同。人們發(fā)現(xiàn)大動物比小動物擁有更多的人類所具有的解剖學(xué)和生理學(xué)特性，對皮膚也如此。因此通常而言，預(yù)測人體皮膚通透性時，豬和恒河猴將比無毛小鼠等小動物更為合適。理想情況下，不同種屬皮膚通透順序按如下排列：小鼠>大鼠>豚鼠>家兔>猴>狗>山羊>綿羊>豬>牛>人。特別是小型豬，它是皮膚毒理學(xué)研究的良好動物模型，其皮膚的屏障結(jié)構(gòu)和功能均與人近似。
　　除了離體皮膚外，還可用體外重建的人體皮膚模型研究皮膚的吸收，這些皮膚模型通常采用人來源的角質(zhì)細(xì)胞，經(jīng)體外氣一液培養(yǎng)，形成具有與人皮膚類似的角質(zhì)層和屏障結(jié)構(gòu)，皮膚模型可為表皮模型，也可為全層皮膚模型(含真皮層)。目前已有數(shù)種商業(yè)化的模型供檢測使用，如Episkin、EpiDerm等。
　　
　　3、體外皮膚吸收的擴(kuò)散池法
　　體外皮膚吸收最常用的是Franz擴(kuò)散池，簡單講就是將離體動物皮膚固定于供給池和擴(kuò)散池之間，將測試樣品置于完整的含角質(zhì)層的皮片表面，皮膚底面與接受池中液體接觸，擴(kuò)散池可設(shè)計(jì)為靜態(tài)池也可為流通池。測試樣品停留在皮膚表面一定時間，暴露時間或者移除受試物的時間視試驗(yàn)設(shè)計(jì)目的而定。試驗(yàn)結(jié)束后或在試驗(yàn)過程中定時提取接收液，分析透過皮膚的受試物的量，方法分析可采用閃爍計(jì)數(shù)、高效液相色譜HPLC和氣相色譜GC等方法?；瘜W(xué)物的被動擴(kuò)散受溫度影響，因此擴(kuò)散池和皮膚溫度應(yīng)維持在接近正常皮膚溫度的范圍內(nèi)(32±1℃)，相對濕度在30～70％。
　　皮膚屏障功能的完整性是體外試驗(yàn)的關(guān)鍵，試驗(yàn)前應(yīng)檢查皮膚的完整性，可用跨表皮水份丟失(TEWL)或跨皮膚電阻等物理方法測定，體外培養(yǎng)的皮片，電阻值變化維持在35～42kΩ/m²之間，滲透系數(shù)<0.8×10⁸cm/s。根據(jù)試驗(yàn)?zāi)康牡牟煌茉囄锟蔀槿芤海部蔀楣腆w產(chǎn)品，應(yīng)使皮膚與受試物保持良好的接觸以模擬預(yù)期使用情況。對于固體受試物，可以用水濕潤，某些情況下也可以選用人工汗液。對于化妝品檢測，受試物的劑量應(yīng)盡量與產(chǎn)品的預(yù)期使用量相近或略高，以獲得極端使用情況下(如評價可以預(yù)見的誤用)的數(shù)據(jù)。
　　受試物劑量與皮膚通透性的關(guān)系還存在爭議，歐洲香化協(xié)會(COLIPA)建議液體為5ul／Cm²，半固體為2mg／cm²(如與液體比較時使用5mg／cm²)。oECD試驗(yàn)指南(TG428)建議固體為1～5mg／Cm²，液體可達(dá)10ul／cm²。也有例外，氧化型染發(fā)劑通常給予20mg／cm²和持續(xù)30min。擴(kuò)散池實(shí)驗(yàn)一般采用的持續(xù)時間為24小時，對于皮膚滲透緩慢的物質(zhì)可適當(dāng)延長時間。對于未知其通透性的化合物，取樣間隔以2小時為宜。實(shí)驗(yàn)初期的取樣(1～4小時)對于識別皮膚膜是否滲漏具有重要意義。試驗(yàn)結(jié)束后，應(yīng)測定沖洗液、皮膚膜內(nèi)和擴(kuò)散池清洗液中剩余的未滲透的受試物的量，受試物總的回收率至少應(yīng)在100±15％范圍內(nèi)。如果回收率比較低，應(yīng)分析原因，可能包括蛋白結(jié)合、滲入池壁或管壁、揮發(fā)或反應(yīng)損失。
　　經(jīng)皮膚吸收試驗(yàn)中通常會得到以下幾個實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，反映了皮膚吸收的過程：角質(zhì)層吸收量表示皮膚擴(kuò)散試驗(yàn)停止后(暴露時間可能很短)，角質(zhì)層中貯留的受試物的量，這一數(shù)值不能認(rèn)為是系統(tǒng)吸收量。真皮吸收量表示皮膚擴(kuò)散試驗(yàn)停止后，表皮(角質(zhì)層除外)和真皮中發(fā)現(xiàn)的受試物的量，這一數(shù)值可認(rèn)為是系統(tǒng)吸收量。經(jīng)皮滲透量表示皮膚擴(kuò)散試驗(yàn)停止后，接受池中檢測到的受試物的量，這一數(shù)值可認(rèn)為是系統(tǒng)吸收量。
　　
　　4、人工膜和數(shù)學(xué)模型
　　采用無細(xì)胞的人工合成膜也可用于化妝品組份的皮膚吸收，人工膜穩(wěn)定性好，批間均勻度高，使用方便，具有較高的應(yīng)用價值。合成纖維素薄膜已有比較廣泛的應(yīng)用。多孔薄膜的屏障性功能主要受分子大小、形狀、靜電作用等制約。相反，無孔薄膜對通透有一定的限速作用，因而更接近于生物組織中的擴(kuò)散。通常纖維素膜的通透性比生物膜和無孔合成膜高，與擴(kuò)散分子的性質(zhì)關(guān)系不大。
　　皮膚可以認(rèn)為是一種具有屏障功能的生物膜，通透性是生物膜的一種基本性質(zhì)，它反映了分子、離子通過膜的能力。它可以用每種物質(zhì)在每秒內(nèi)通過每平方厘米膜的物質(zhì)的量，即跨膜通量(mol／·cm²)來表示?；衔镔|(zhì)跨膜通量的大小，除了取決于它們在膜兩側(cè)的濃度差外，還受這些化合物的脂溶性、溫度等其他因素的影響。因此，可以用數(shù)學(xué)模擬的方法預(yù)測，最常用的是定量構(gòu)效關(guān)系(QSAR)模型。QSAR模型是試圖將化合物的經(jīng)皮穿透性和它們的結(jié)構(gòu)或物理化學(xué)參數(shù)用統(tǒng)計(jì)學(xué)的方法聯(lián)系進(jìn)來的方法?？蓮幕衔锏慕Y(jié)構(gòu)定量預(yù)測其經(jīng)皮吸收的情況，在一定的條件下可對化合物能否吸收進(jìn)行定性預(yù)測，用于建立模型的特征性參數(shù)包括如下方面：分子量、原子電荷數(shù)、電子密度、范德華力、分子體積、辛醇一水分配系數(shù)(10gP)、水合作用的能量等?；衔锓弦韵聴l件中任意兩點(diǎn)，表明其有較差的吸收特性：①相對分子質(zhì)量>500。②log P>5.0⑧氫鍵供體>5。④氫鍵受體>10。
　　
　　結(jié)語
　　
　　人類志愿者的皮膚吸收研究只能用于低毒性化妝品原料和成品的檢驗(yàn)，但通常此類資料非常缺乏。按照OECD指南428，體外試驗(yàn)更適宜用離體動物(嚙齒類動物或豬)皮膚或人體皮膚進(jìn)行，這些資料是可接受的，但人體皮膚來源困難，使用受限；小型豬皮膚是個不錯的選擇，但需要積累皮膚吸收的比較生物學(xué)資料和化學(xué)物檢測資料；嚙齒類動物皮膚吸收資料與人相關(guān)性稍差，但卻是使用最多和最經(jīng)濟(jì)方便的材料來源。對于體外吸收研究中采用體外重建皮膚模型，需要進(jìn)一步研究以體現(xiàn)其應(yīng)用前景。皮膚角質(zhì)層是影響皮膚擴(kuò)散的主要屏障，因此在試驗(yàn)前必須對角質(zhì)的完整性進(jìn)行逐個檢查和控制。但是皮膚的代謝活性對于滲透試驗(yàn)并不是必備條件，因?yàn)闈B透過程主要是被動擴(kuò)散，而主動運(yùn)輸并不明顯。因此，對特殊性質(zhì)的物質(zhì)，在必要時應(yīng)進(jìn)行體內(nèi)動物試驗(yàn)。
　　
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