馬國棟，劉艷環(huán)

耐力訓(xùn)練對急性酒精性肝損傷線粒體自噬功能的影響及機(jī)制研究

馬國棟，劉艷環(huán)

目的：研究耐力訓(xùn)練對大鼠急性酒精性肝損傷肝臟線粒體自噬變化規(guī)律及其機(jī)制。方法：以SD大鼠建立急性酒精性肝損傷模型，以12周無負(fù)重游泳為運(yùn)動(dòng)手段，測定血清ALT和AST以及肝臟線粒體活性氧生成、線粒體MDA含量、線粒體順烏頭酸酶活性、線粒體膜電位、線粒體自噬蛋白BNIP3、NIX和HIF－1αmRNA表達(dá)以及HIF－1α蛋白表達(dá)。結(jié)果：急性酒精攝入導(dǎo)致血清ALT和AST顯著升高以及肝臟線粒體活性氧生成顯著升高，線粒體MDA含量顯著升高，線粒體順烏頭酸酶活性顯著降低，線粒體膜電位顯著降低，線粒體自噬蛋白BNIP3、NIX和HIF－1αmRNA以及HIF－1α蛋白表達(dá)顯著升高；耐力訓(xùn)練后急性酒精攝入使血清ALT和AST以及肝臟線粒體活性氧生成，線粒體MDA含量，線粒體順烏頭酸酶活性，線粒體膜電位，線粒體自噬蛋白BNIP3、NIX和HIF－1αmRNA以及HIF－1α蛋白表達(dá)均表現(xiàn)出與未耐力訓(xùn)練急性酒精攝入相同的變化規(guī)律，但變化幅度相對較??；注射HIF－1抑制劑YC－1無論是未耐力訓(xùn)練還是耐力訓(xùn)練大鼠再給予急性酒精攝入時(shí)BNIP3、NIX mRNA表達(dá)均顯著低于未注射抑制劑組，而HIF－1αmRNA表達(dá)未見顯著性差異，但HIF－1α蛋白表達(dá)顯著降低。結(jié)論：急性酒精攝入引起肝臟線粒體自噬加強(qiáng)，其自噬與HIF－1表達(dá)增加有關(guān)，而耐力訓(xùn)練可能通過增強(qiáng)肝臟氧氣供應(yīng)能力，進(jìn)而引起HIF－1表達(dá)降低，導(dǎo)致線粒體自噬功能減弱。

耐力訓(xùn)練；急性酒精性肝損傷；線粒體自噬；鼠；動(dòng)物實(shí)驗(yàn)

1 序言

在日常生活中，常常因?yàn)槟承┰虺霈F(xiàn)短期大量飲酒的現(xiàn)象，短期過量飲酒會(huì)導(dǎo)致急性酒精中毒，造成肝臟的急性損傷。急性酒精性肝損傷與氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)關(guān)系密切。氧化應(yīng)激導(dǎo)致線粒體異常，而異常線粒體的清除程度與急性酒精性肝損傷的程度密切相關(guān)。線粒體的清除與線粒體自噬有關(guān)。線粒體自噬是指通過選擇性地清除線粒體的過程。線粒體自噬發(fā)生與許多因素有關(guān)，有研究發(fā)現(xiàn)，低氧誘導(dǎo)因子－1和活性氧均能引起線粒體自噬加強(qiáng)［20］。急性酒精性肝損傷過程中線粒體自噬變化如何以及引起線粒體自噬的信號通路如何，目前鮮見報(bào)道。筆者前期工作證實(shí)，耐力訓(xùn)練能夠預(yù)防非酒精性脂肪肝，改善線粒體的功能［1］，但耐力訓(xùn)練對急性酒精性肝損傷肝臟線粒體自噬的影響如何，目前罕見報(bào)道。本研究擬在這方面進(jìn)行探討，為更好地了解急性酒精性肝損傷發(fā)病的線粒體機(jī)制提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

2 材料與方法

2.1 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

雄性6周齡SD大鼠72只，體重181±4.10g，購自北京大學(xué)醫(yī)科部實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。每天光照均為12h，自由飲水。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物隨機(jī)分為6組：1）對照組（C，n＝12）；2）12周游泳運(yùn)動(dòng)組（E，n＝12）；3）12周游泳運(yùn)動(dòng)＋5天酒精攝入組（EA，n＝12）；4）12周游泳運(yùn)動(dòng)＋5天酒精攝入＋YC－1組（EAY，n＝12）；5）對照組＋5天酒精攝入組（CA，n＝12）；6）對照組＋5天酒精攝入＋YC－1組（CAY，n＝12）。每一組在實(shí)驗(yàn)結(jié)束，禁食12h處死，取肝臟，用于測定各項(xiàng)指標(biāo)。YC－1為HIF－1α抑制劑3－（5′－h(huán)ydroxymethyl－2′－furyl）－1－benzylindazole（YC－1）。采用腹腔注射的方式，按照10mg／kg，每天1次，共5天，與酒精攝入同步進(jìn)行。

2.2 耐力訓(xùn)練模型

游泳運(yùn)動(dòng)方案：采用無負(fù)重游泳訓(xùn)練，水溫（29±2）℃，第1周每天運(yùn)動(dòng)0.5h，第2周增至1h，從第3周開始增至1.5h，每周5次，共12周。

2.3 急性酒精性肝損傷模型

參照文獻(xiàn)［2］：模型組每次按0.8ml／100g給大鼠灌胃紅星二鍋頭酒（56°），每天2次，中間間隔1h；對照組同模型組的方法相同灌服同體積的生理鹽水。連續(xù)灌胃5天。

2.4 肝臟樣本制備與線粒體提取

斷頭處死迅速取出肝臟約2g，用冷生理鹽水沖洗凈血污、剪碎，加10ml預(yù)冷生理鹽水，電動(dòng)勻漿（B.Braun，Germany）。0℃～4℃離心（Beckman），600g離心10min，棄沉淀，上清于10 000g離心10min。沉淀加入5ml冷生理鹽水混勻。10 000g離心10min。沉淀懸浮在約2ml冷生理鹽水中。懸浮液即為線粒體。

2.5 指標(biāo)測定

2.5.1 血清ALT和AST的測定

分離血清，測定血清及肝臟組織ALT和AST活性，嚴(yán)格按照南京建成生物工程研究所的試劑盒說明書進(jìn)行檢測。

2.5.2 線粒體ROS生成的測定

取已定量的大鼠肝臟線粒體懸液，加入測定介質(zhì)中（pH 7.4）。加入底物蘋果酸0.1mmol／L和谷氨酸1 mmol／L以啟動(dòng)態(tài)4呼吸。最后加入DCFH－DA，終濃度為5μmol／L。反應(yīng)總體系為3ml。避光37℃水浴15min。水浴后立即于熒光分光光度計(jì)（RF－5301PC，日本）下測定5～10min（激發(fā)波長499nm，發(fā)射波長521nm）。測定設(shè)置為：時(shí)間增量1s；積分時(shí)間1s。測試過程保持37℃恒溫。根據(jù)熒光變化情況測定線粒體ROS的生成。

系統(tǒng)工程助推新時(shí)代的強(qiáng)國夢....................................................................................................................................................薛惠鋒（1）

2.5.3 肝臟線粒體順烏頭酸酶活性、MDA含量的測定

按文獻(xiàn)［10］方法，測定順烏頭酸酶活性；根據(jù)過氧化脂質(zhì)降解產(chǎn)物中的丙二醛（MDA）可與硫代巴比妥酸（TBA）縮合，形成紅色產(chǎn)物，在分光光度計(jì)（Cintr10，澳大利亞）532nm處有最大吸收峰，測定MDA含量。

2.5.4 線粒體膜電位的測定

采用熒光分光光度計(jì)（Cary Eclipse，Varian Co.美國），利用熒光探針流動(dòng)透析裝置來定量測定線粒體跨膜電位。0.5ml的反應(yīng)介質(zhì)（基點(diǎn)為O點(diǎn)）先加0.4μmol／L Rh123（Sigma Co.），待掃描平衡后（A點(diǎn)），再加入0.8μmol／L Rh123，再掃描平衡（B點(diǎn)），用作標(biāo)定熒光基準(zhǔn)，然后加入0.5mg的肝臟線粒體，由于存在靜息態(tài)跨膜電位使熒光淬滅（R點(diǎn)），當(dāng)平衡后加入蘋果酸（0.1mmol／L）和谷氨酸（1mmol／L），出現(xiàn)與能化態(tài)跨膜電位差相關(guān)的熒光強(qiáng)度下降，描記到平衡為止（N點(diǎn)）。溫度25℃，激發(fā)波長500 nm，發(fā)射波長525nm，能化態(tài)跨膜電位差按Nernst方程計(jì)算。

2.5.5 RT－PCR擴(kuò)增線粒體自噬蛋白BNIP3、NIX以及低HIF－1αmRNA的表達(dá)

以上述的肝臟組織，用Trizol Reagent試劑盒（Mrcgene產(chǎn)品）與逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（Ferment產(chǎn)品）參照說明書進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，以備用于線粒體自噬蛋白BNIP3和NIX以及低氧誘導(dǎo)因子HIF－1αmRNA的擴(kuò)增。采用PE－9600（PE－Cetus Co，USA）PCR擴(kuò)增儀擴(kuò)增mRNA表達(dá)。自行設(shè)計(jì)引物：

反應(yīng)參數(shù)：95℃預(yù)變性5min，然后進(jìn)行如下5個(gè)循環(huán)：94℃30s，45℃45s72℃45s，然后進(jìn)行25個(gè)循環(huán)，變性溫度與延伸溫度不變，終末延伸72℃7min，退火溫度分別為52.5℃、54.5℃和56℃。

2.5.6 Western blotting測定肝臟HIF－1α蛋白表達(dá)

肝臟組織勻漿，將上樣緩沖液與勻漿液樣品混合煮沸10min，在垂直電泳儀（BIO－RAD，USA）上用相同體積的10μg蛋白質(zhì)樣品經(jīng)15%SDS－PAGE分離后，轉(zhuǎn)移于PVDF膜（Millipore產(chǎn)品）上。1∶1 000兔抗鼠HIF－1α血清4℃孵育過夜，洗滌3次，再以1∶1 000辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔IgG（H＋L）抗體室溫孵育1h，充分洗滌后，使用ECL試劑盒發(fā)光顯影，X光膠片壓片曝光，掃描定量各條帶的與對照組的相對灰度值，對照組定位1。

2.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

3 結(jié)果

3.1 肝臟線粒體ROS、MDA含量以及順烏頭酸酶活性與血清ALT和AST的變化

如表1所示，MDA含量、線粒體ROS生成以及血清ALT和AST表現(xiàn)出相同的變化規(guī)律，E組顯著低于C組，而EA組、EAY組、CA組、CAY組均顯著高于C組，EA組、EAY組、CA組、CAY組均顯著高于E組，EAY組、CA組、CAY組均顯著高于EA組，CAY組顯著高于EAY和CA組，EAY組與CA組未見顯著性差異；順烏頭酸酶活性E組顯著高于C組，而EA組、EAY組、CA組和CAY組均顯著低于C組，而EA組、EAY組、CA組和CAY組均顯著低于E組，EAY組、CA組和CAY組均顯著低于EA組，CAY組顯著低于EAY組和CA組，而EAY組與CA組未見顯著性差異。

3.2 肝臟線粒體膜電位在各組大鼠中的變化

線粒體膜電位EAY組、CA組和CAY組均顯著高于C組、E組和EA組，而EAY組、CA組和CAY組間未見顯著性差異，C組、E組和EA組間也未見顯著性差異（表2）。

表1 本研究各組大鼠肝臟線粒體MDA含量、線粒體ROS產(chǎn)生、順烏頭酸酶活性以及血清ALT和AST的比較一覽表Table 1 The Comparison of Content of MDA，Mitochondrial ROS Production and Activity of Aconitase in Liver Mitochondria and ALT and AST in Serum in Different Group Rats （±S）

表1 本研究各組大鼠肝臟線粒體MDA含量、線粒體ROS產(chǎn)生、順烏頭酸酶活性以及血清ALT和AST的比較一覽表Table 1 The Comparison of Content of MDA，Mitochondrial ROS Production and Activity of Aconitase in Liver Mitochondria and ALT and AST in Serum in Different Group Rats （±S）

注：＊P＜0.05，＊＊P＜0.001與C組比較；△P＜0.01，△△P＜0.001與E組比較；＃P＜0.05，＃＃P＜0.01，與EA組比較；＆P＜0.05，與EAY組比較；＄P＜0.01，與CA組比較。

MDA（nmol／mg·pro） ROS（unit／sec.mg pro） 順烏頭酸酶活性（U／mg） ALT（U／L） AST（U／L）C組 2.61±0.41 7.54±1.20 42.87±4.98 91.25±9.78 146.23±10.25 E組 1.49±0.25＊ 4.92±0.67＊ 53.22±5.68＊ 52.81±6.53＊ 107.54±8.78＊EA組 3.56±0.74＊△ 15.67±2.01＊＊△△ 30.05±3.29＊△ 134.28±10.65＊△△ 180.65±12.37＊△EAY組 4.24±0.74＊＊△△＃ 20.01±2.37＊＊△△＃ 24.21±2.37＊＊△△＃ 150.21±11.24＊＊△△＃ 200.32±13.59＊＊△△＃CA組 4.17±0.68＊＊△△＃ 23.46±2.60＊＊△△＃ 22.17±2.14＊＊△△＃＃ 164.57±12.47＊＊△△＃＆ 221.34±14.56＊＊△△＃＆CAY組 5.39±0.89＊＊△△＃＃＆＄32.58±3.42＊＊△△＃＃＆＄15.49±1.21＊＊△△＃＃＆＄199.56±15.63＊＊△△＃＃＆＄ 265.38±18.32＊＊△△＃＃＆＄

表2 本研究各組大鼠肝臟線粒體膜電位的變化一覽表Table 2 The Change of Mitochondrial Potential in Liver in Different Group Rats （±S）

表2 本研究各組大鼠肝臟線粒體膜電位的變化一覽表Table 2 The Change of Mitochondrial Potential in Liver in Different Group Rats （±S）

注：＊P＜0.05，與C組比較；△P＜0.05，與E組比較；＃P＜0.05，與EA組比較。

C組 E組 EA組 EAY組 CA組 CAY組膜電位（mV）175.20±20.14 181.41±21.03 174.52±22.57 162.43±21.89＊△＃ 165.60±20.16＊△＃ 164.19±21.07＊△＃

3.3 線粒體自噬蛋白BNIP3、NIX以及HIF－1αmRNA在大鼠肝臟中的表達(dá)

HIF－1αmRNA表達(dá)EA組、EAY組、CA組和CAY組均顯著高于C組和E組，CA組和CAY組均顯著高于EA組和EAY組，C組與E組間未見顯著性改變，CA組與CAY組也未見顯著性改變（圖1）；BNIP3mRNA表達(dá)E組顯著低于C組，而EA組、CA組和CAY組均顯著高于C組，EA組、EAY組、CA組和CAY組均顯著高于E組，EAY組和CAY組顯著低于EA組，而CA組顯著高于EA組和EAY組，EAY組與CAY組未見顯著性改變，CAY組顯著低于CA組（圖2）；NIX mRNA表達(dá)EA組、EAY組、CA組和CAY組均顯著高于C組和E組，EA組與EAY組未見顯著性差異，CA組與CAY組均顯著高于EA組和EAY組，CA組與CAY組未見顯著性差異（圖3）。

圖1 低氧誘導(dǎo)因子HIF－1αmRNA在各組大鼠肝臟中表達(dá)的變化示意圖Figure 1. The Change of HIF－1αmRNA in Liver in Different Group Rats

圖2 BNIP3mRNA在各組大鼠肝臟中表達(dá)的變化示意圖Figure 2. The Change of BNIP3mRNA in Liver in Different Group Rats

圖3 NIX mRNA在各組大鼠肝臟中表達(dá)的變化示意圖Figure 3. The Change of NIX mRNA in Liver in Different Group Rats

3.4 大鼠肝臟HIF－1α蛋白表達(dá)在各組中的變化

肝臟組織HIF－1α蛋白EA組與CA組顯著高于C組和E組，CA組顯著高于EAY組和CAY組，而C組、E組、EAY組和CAY組之間未見顯著性差異（圖4）。

4 討論

4.1 急性酒精性肝損傷與線粒體自噬

在日常生活中，由于種種原因，會(huì)出現(xiàn)急性大量酒精攝入的情況。急性酒精攝入會(huì)導(dǎo)致肝臟產(chǎn)生大量的活性氧（ROS）造成氧化損傷和引起急性酒精性肝炎。急性酒精攝入導(dǎo)致氧化應(yīng)激時(shí)，線粒體是最易受到攻擊的對象。常常會(huì)使線粒體膜中不飽和脂肪酸氧化，線粒體DNA缺失等。更為嚴(yán)重地，是急性酒精的攝入不僅導(dǎo)致肝臟線粒體的氧化損傷和線粒體DNA的缺失，而且也會(huì)引起心臟、骨骼肌、大腦以及胰腺等線粒體DNA的缺失與線粒體的氧化損傷［14］。本研究發(fā)現(xiàn)，經(jīng)過急性酒精攝入，血清ALT和AST以及線粒體ROS生成和MDA含量顯著升高，而順烏頭酸酶活性顯著降低（順烏頭酸酶位于線粒體中，其活性的抑制被認(rèn)為是線粒體超氧陰離子產(chǎn)生的可靠標(biāo)記［9］，其活性的高低可以反映線粒體超氧陰離子產(chǎn)生的多少），說明急性酒精性肝損傷導(dǎo)致肝臟出現(xiàn)氧化應(yīng)激現(xiàn)象。

圖4 低氧誘導(dǎo)因子HIF－1α蛋白在各組大鼠肝臟中表達(dá)的變化示意圖Figure 4. The Change of HIF－1αProtein in Liver in Different Group Rats

線粒體作為細(xì)胞內(nèi)重要的細(xì)胞器之一，不僅提供了機(jī)體所需的大部分能量，而且也是活性氧的重要來源，其良好功能的維持是保證細(xì)胞正常運(yùn)行的基礎(chǔ)之一。線粒體是高度動(dòng)態(tài)的細(xì)胞器，這一動(dòng)態(tài)的維持依賴于線粒體的融合／分裂以及線粒體自噬，這一平衡的維持對修復(fù)受損的線粒體和保證線粒體健康至關(guān)重要［18］。線粒體自噬是2005年由Lemasters命名的［13］，界定為“經(jīng)過特殊的、有選擇性的、有目的性地通過自噬清除掉過多的或受損的線粒體”。自從發(fā)現(xiàn)這一過程后，線粒體自噬被認(rèn)為在移除功能異?；蛉O化的線粒體以及產(chǎn)生大量ROS線粒體方面發(fā)揮著重要作用，而這一過程是維持線粒體的健康所必需的［11］。

給予大鼠50%熱量限制1周，然后再恢復(fù)正常膳食1周，肝臟線粒體效率更高，態(tài)3呼吸能力更強(qiáng)，抗氧化能力增強(qiáng)［6］，而在限食過程中，線粒體自噬增強(qiáng)［5］，說明線粒體自噬是一種有效地保護(hù)線粒體的方式。預(yù)先給予心臟缺血－再灌注適應(yīng)，心臟線粒體功能提高，從而保護(hù)心臟。其機(jī)理可能是通過線粒體自噬清除掉受損的線粒體，而受損的線粒體會(huì)產(chǎn)生大量的ROS，ROS會(huì)對健康的線粒體造成氧化損傷，線粒體自噬避免了這一情況的出現(xiàn)，從而保護(hù)心臟免受氧化應(yīng)激的損傷。在酵母［17］和哺乳動(dòng)物細(xì)胞［21］中，線粒體分裂要早于線粒體自噬，長的線粒體被分裂成易于包裹的片斷，然后通過線粒體自噬清除掉受損的線粒體，從而控制線粒體的質(zhì)量（即線粒體質(zhì)量控制）［24］。除了線粒體質(zhì)量控制外，線粒體自噬還可以調(diào)整線粒體數(shù)量以滿足代謝需求［12］，如紅細(xì)胞的分化過程［19］。所有這些均說明線粒體自噬在維持線粒體功能方面所發(fā)揮的重要作用。

在哺乳動(dòng)物中，與線粒體自噬直接相關(guān)的蛋白質(zhì)有BNIP3蛋白、NIX蛋白、parkin和PINK1等。由于BNIP3和NIX與低氧關(guān)系密切，而parkin和PINK1與神經(jīng)系統(tǒng)關(guān)系密切，因此，本研究選擇BNIP3和NIX蛋白作為研究指標(biāo)。BNIP3和NIX是Bcl－2家族蛋白成員，它們均含有一個(gè)BH3結(jié)構(gòu)域，這一結(jié)構(gòu)域是一個(gè)線粒體目標(biāo)序列，它位于線粒體膜上［3，26］。在心肌細(xì)胞中，BNIP3與低氧誘導(dǎo)的線粒體自噬有關(guān)，在這一研究中發(fā)現(xiàn)，增加BNIP3的表達(dá)，直接與降低線粒體DNA分子數(shù)量有關(guān)，而普遍認(rèn)為，線粒體分子數(shù)的減少與線粒體自噬有關(guān)［3］。相反，NIX功能的缺失通過影響線粒體自噬而損害正常網(wǎng)織紅細(xì)胞的發(fā)育［19］，這一結(jié)果表明，在網(wǎng)織紅細(xì)胞發(fā)育過程中，NIX對線粒體與自噬體結(jié)合是必需的，缺少了線粒體自噬，對細(xì)胞是極為有害的。接下來的工作表明，NIX與自噬相關(guān)蛋白LC3和GABARAP結(jié)合，而這兩個(gè)蛋白是形成融酶體所必需的［16］。細(xì)胞應(yīng)激、生長或分化均影響到NIX表達(dá)，NIX使線粒體外膜通透性增加，細(xì)胞色素C從線粒體中釋放出來，引起細(xì)胞調(diào)亡。更為重要的是，NIX缺陷細(xì)胞能夠通過線粒體去極化劑使網(wǎng)織紅細(xì)胞正常發(fā)育，這表明，NIX啟動(dòng)的線粒體自噬是通過線粒體去極化實(shí)現(xiàn)的。

線粒體自噬與帕金森綜合癥關(guān)系密切，目前關(guān)于線粒體自噬與疾病關(guān)系方面的研究主要集中在這一領(lǐng)域［22］。而線粒體自噬與急性酒精性肝損傷關(guān)系如何，目前鮮見報(bào)道。本研究發(fā)現(xiàn)，急性酒精攝入后，線粒體自噬蛋白BNIP3和NIX mRNA表達(dá)顯著升高，而且線粒體膜電位也降低（線粒體去極化是線粒體自噬的前提條件之一［20］），說明急性酒精攝入引起肝臟線粒體自噬。急性酒精性肝損傷過程中，線粒體自噬的意義如何？以往研究認(rèn)為，線粒體自噬可以清除受損的線粒體，保持線粒體的正常功能。而本研究發(fā)現(xiàn)，盡管急性酒精性肝損傷中線粒體自噬能力增強(qiáng)，但卻出現(xiàn)了線粒體ROS生成增多、線粒體MDA含量增高以及血清ALT和AST升高的現(xiàn)象，這似乎與線粒體自噬的功能相互矛盾。但筆者認(rèn)為，這一過程并不矛盾，因?yàn)楸M管急性酒精性肝損傷過程中出現(xiàn)了線粒體自噬，清除掉部分受損的線粒體，但由于急性酒精攝入導(dǎo)致了大量的線粒體損傷，而線粒體自噬清除受損線粒體的能力是有限的，當(dāng)超出其極限時(shí)，大量受損線粒體積累就不可避免了，受損的線粒體產(chǎn)生一系列的變化，如產(chǎn)生更多的ROS，降低線粒體ATP合成等，從而造成了肝線粒體的損傷，進(jìn)而損傷肝細(xì)胞，導(dǎo)致急性酒精性肝損傷。為驗(yàn)證這一假設(shè)，本研究在大鼠中加入了HIF－1抑制劑YC－1。研究表明，急性酒精攝入會(huì)導(dǎo)致肝臟出現(xiàn)缺氧現(xiàn)象［7］，而缺氧會(huì)導(dǎo)致肝臟HIF－1a表達(dá)升高。另有研究表明，在低氧環(huán)境下，可以通過HIF－1a誘導(dǎo)自噬蛋白BINP3表達(dá)升高［25］，進(jìn)而引起線粒體自噬。本研究的結(jié)果顯示，加入HIF－1抑制劑YC－1的急性酒精性肝損傷大鼠肝臟BNIP3和NIX mRNA表達(dá)顯著低于未加入抑制劑的急性酒精性肝損傷大鼠，而且加入抑制劑組血清ALT和AST以及線粒體ROS生成進(jìn)一步增加，線粒體MDA含量進(jìn)一步升高，而順烏頭酸酶活性進(jìn)一步降低。這一方面說明，急性酒精性肝損傷引起的線粒體自噬是通過低氧誘導(dǎo)HIF－1表達(dá)途徑；另一方面說明，急性酒精性肝損傷中線粒體自噬確實(shí)不足以清除受損的線粒體。

本研究還發(fā)現(xiàn)，HIF－1抑制劑YC－1并沒有抑制HIF－1 mRNA的表達(dá)，而抑制其蛋白的表達(dá)，說明YC－1抑制劑作用于HIF－1的翻譯過程。

4.2 耐力訓(xùn)練預(yù)防急性酒精性肝損傷的線粒體自噬機(jī)制

目前，關(guān)于耐力訓(xùn)練對急性酒精性肝損傷以及對線粒體自噬作用的研究鮮見報(bào)道。本研究發(fā)現(xiàn)，經(jīng)過12周的游泳訓(xùn)練對急性酒精性肝損傷具有明顯的預(yù)防作用，其具體表現(xiàn)為線粒體ROS生成減少、線粒體MDA含量降低、順烏頭酸酶活性和線粒體膜電位顯著升高。這些確實(shí)說明，耐力訓(xùn)練具有較好的預(yù)防急性酒精性肝損傷的效果。有趣的是，本研究發(fā)現(xiàn)，經(jīng)過12周耐力訓(xùn)練后，線粒體自噬蛋白BNIP3mRNA顯著低于對照組，NIX mRNA與對照組未見顯著性差異，而給予急性酒精攝入后，BNIP3和NIX表達(dá)又顯著性升高，但顯著性低于未訓(xùn)練急性酒精攝入組。從以上結(jié)果推測：線粒體自噬可能是一種應(yīng)激保護(hù)線粒體的機(jī)制，但這一機(jī)制是否啟動(dòng)以及啟動(dòng)的程度取決于受損線粒體的程度，因此，耐力訓(xùn)練后受損線粒體顯著減少，線粒體自噬功能相應(yīng)降低，但當(dāng)再給予急性酒精攝入時(shí)受損線粒體有出現(xiàn)增多，這一機(jī)制重新被啟動(dòng)放大，發(fā)揮保護(hù)線粒體的作用。在運(yùn)動(dòng)預(yù)防急性酒精性肝損傷過程中，抑制線粒體自噬的機(jī)制如何？運(yùn)動(dòng)對肌肉組織刺激激烈，但對肝臟直接刺激相對較小，因此，有氧運(yùn)動(dòng)可能通過間接的方式對急性酒精性肝損傷發(fā)揮預(yù)防作用。筆者前期工作證實(shí)，有氧運(yùn)動(dòng)能夠預(yù)防非酒精性脂肪肝，改善肝臟線粒體功能，提高線粒體ATP合成能力，而線粒體ATP的合成需要氧氣做基礎(chǔ)［1］，因此，筆者認(rèn)為，運(yùn)動(dòng)調(diào)節(jié)肝臟線粒體自噬可能與改善肝臟氧氣供應(yīng)有關(guān)。許多研究也證實(shí)，有氧運(yùn)動(dòng)可以提高肺通氣及氣體交換機(jī)能［23］，提高心臟的循環(huán)及泵血功能［4］以及促進(jìn)促紅細(xì)胞生成素形成、血紅蛋白含量增加以及提高血氧含量［15］，從而提高機(jī)體的供氧能力。當(dāng)氧氣供應(yīng)相對充足時(shí)，肝臟HIF－1a表達(dá)顯著降低，進(jìn)而使線粒體自噬蛋白BNIP3和NIX表達(dá)降低，線粒體自噬功能減弱。本研究發(fā)現(xiàn)，經(jīng)過12周耐力訓(xùn)練后再給予急性酒精攝入時(shí)，HIF－1amRNA和蛋白均顯著升高，但顯著低于未經(jīng)過耐力訓(xùn)練給予急性酒精攝入大鼠，與之相對應(yīng)，線粒體自噬蛋白BNIP3和NIX mRNA表達(dá)也表現(xiàn)出相同的變化規(guī)律，這有力地支持了筆者上面的假設(shè)。

5 結(jié)論

急性酒精攝入引起肝臟線粒體自噬加強(qiáng)，其自噬與HIF－1表達(dá)有關(guān)，而耐力訓(xùn)練通過增強(qiáng)肝臟氧氣供應(yīng)能力，進(jìn)而引起HIF－1表達(dá)降低，導(dǎo)致線粒體自噬功能減弱。

［1］劉艷環(huán)，馬國棟.耐力訓(xùn)練下調(diào)的HDMCP表達(dá)對非酒精性脂肪肝線粒體活性氧生成的影響［J］.天津體育學(xué)院學(xué)報(bào)［J］，2010，25（2）：154－157.

［2］朱平生，龐亞麗，王宇亮，等.大鼠急性酒精性肝損傷模型的脂質(zhì)過氧化損傷觀察［J］.中華中醫(yī)藥雜志，2006，21（6）：376－377.

［3］BAND M，JOEL A，HERNANDEZ A，et al.2Hypoxia－induced BNIP3expression and mitophagy：in vivo comparison of the rat and the hypoxia－tolerant mole rat，Spalax ehrenbergi［J］.FASEB J，2009，23（7）：2327－2335.

［4］BURTSCHER M，GATTERER H，SZUBSKI C，et al.Effects of interval hypoxia on exercise tolerance：special focus on patients with CAD or COPD［J］.Sleep Breath，2010，14（3）：209－220.

［5］CARREIRA R S，LEE Y，GHOCHANI M，et al.Cyclophilin D is required for mitochondrial removal by autophagy in cardiac cells［J］.Autophagy，2010，6（4）：462－472.

［6］CRESCENZO R，LIONETTI L，MOLLICA M P，et al.Altered skeletal muscle subsarcolemmal mitochondrial compartment during catch－up fat after caloric restriction［J］.Diabetes，2006，55（8）：2286－2293.

［7］FRENCH S W.The role of hypoxia in the pathogenesis of alcoholic liver disease［J］.Hepatol Res，2004，29（2）：69－74.

［8］GOTTLIEB R A，GUSTAFSSON A B.Mitochondrial turnover in the heart［J］.Biochim Biophys Acta，2011，1813（7）：1295－1301.

［9］HAUSLADEN A，F(xiàn)RIDOVICH I.Measuring nitric oxide and superoxide：rate constants for aconitase reactivity［J］.Methods Enzymol，1996，269：37－41.

［10］KESSOVA I G，CEDERBAUM A I.Mitochondrial alterations in livers of Sod1－／－mice fed alcohol［J］.Free Radic Biol Med，2007，42（10）：1470－1480.

［11］KIM I，RODRIGUEZ－ENRIQUEZ S，LEMASTERS J J.Selective degradation of mitochondria by mitophagy［J］.Arch Biochem Biophys，2007，462（2）：245－253.

［12］KISSOVA I，DEFFIEU M，MANON S，et al.Uth1p is involved in the autophagic degradation of mitochondria［J］.J Biol Chem， 2004，279（37）：39068－39074.

［13］LEMASTERS J J.Selective mitochondrial autophagy，or mitophagy，as a targeted defense against oxidative stress，mitochondrial dysfunction，and aging［J］.Rejuvenation Res，2005，8（1）：3－5.

［14］MANSOURI A，DEMEILLIERS C，AMSELLEM S，et al.A－cute ethanol administration oxidatively damages and depletes mitochondrial dna in mouse liver，brain，heart，and skeletal muscles：protective effects of antioxidants［J］.J Pharmacol Exp Ther，2001，298（2）：737－743.

［15］MARTINEZ－BELLO V E，SANCHIS－GOMAR F，NASCIMENTO A L，et al.Living at high altitude in combination with sea－level sprint training increases hematological parameters but does not improve performance in rats［J］.Eur J Appl Physiol，2010，109（8）：1125－1130.

［16］NOVAK I，KIRKIN V，MCEWAN D G，et al.Nix is a selective autophagy receptor for mitochondrial clearance［J］.EMBO Rep，2010，11（1）：45－51.

［17］NOWIKOVSKY K，REIPERT S，DEVENISH R J，et al.Mdm38protein depletion causes loss of mitochondrial K＋／H＋exchange activity，osmotic swelling and mitophagy［J］.Cell Death Differ，2007，14（9）：1647－1656.

［18］ONG S B，HAUSENLOY D J.Mitochondrial morphology and cardiovascular disease［J］.Cardiovasc Res，2010，88（1）：16－29.

［19］SCHWEERS R L，ZHANG J，RANDALL M S，et al.NIX is required for programmed mitochondrial clearance during reticulocyte maturation［J］.Proc Natl Acad Sci U S A，2007，104（49）：19500－19505.

［20］TOLKOVSKY A M.Mitophagy［J］.Biochim Biophys Acta，2009，1793（9）：1508－1515.

［21］TWIG G，ELORZA A，MOLINA A J，et al.Fission and selective fusion govern mitochondrial segregation and elimination by autophagy［J］.EMBO J，2008，27（2）：433－446.

［22］VIVES－BAUZA C，PRZEDBORSKI S.Mitophagy：the latest problem for Parkinson＇s disease［J］.Trends Mol Med，2011，17（3）：158－165.

［23］VOGTEL M，MICHELS A.Role of intermittent hypoxia in the treatment of bronchial asthma and chronic obstructive pulmonary disease［J］.Curr Opin Allergy Clin Immunol，2010，10（3）：206－213.

［24］WESTERMANN B.Mitochondrial fusion and fission in cell life and death［J］.Nat Rev Mol Cell Biol，2010，11（12）：872－884.

［25］ZHANG H，BOSCH－MARCE M，SHIMODA L A，et al.Mitochondrial autophagy is an HIF－1－dependent adaptive metabolic response to hypoxia［J］.J Biol Chem，2008，283（16）：10892－10903.

［26］ZHANG J，NEY P A.Role of BNIP3and NIX in cell death，autophagy，and mitophagy［J］.Cell Death Differ，2009，16（7）：939－946.

The Influence of Endurance Training on the Mitophagy and Its Mechanism in Alcohol－induced Acute Hepatic Injury in Rats

MA Guo－dong，LIU Yan－h(huán)uan

Objective：To investigate the change of endurance training on mitophagy and its mechanism in alcohol－induced acute hepatic injury rats.Methods：It analyzed the expressions of BNIP3，NIX and HIF－1αmRNA and content of HIF－1αprotein，mitochondrial reactive oxygen species production，content of mitochondrial MDA，activity of aconitase，and mitochondrial potential in liver tissue and ALT and AST in serum in alcohol－induced acute hepatic injury rats after 12week unload swimming training.Results：The acute alcohol treatment induces mitochondrial ROS production，increases mitochondrial MDA content，decreases aconitase activity and mitochondrial potential，up－regulates expressions of BNIP3，NIX and HIF－1αmRNA and content of HIF－1αprotein in liver and increases ALT and AST in serum in alcohol－induced acute hepatic injury rats.The parameters of all above indicate the same change in alcohol－induced acute hepatic injury rats after endurance training but the extent is lower.When rats are injected YC－1（inhibitor of HIF－1），the expressions of BNIP3and NIX mRNA are lower than that of no injection of YC－1in trained and untrained rats，however，there is no change of the expression of HIF－1αmRNA but HIF－1αprotein increases significantly.Conclusion：Acute alcohol treatment enhances mitophagy，which related to HIF－1up－regulated expression，but endurance training can increase liver oxygen supply，and that decreases HIF－1expression，which results in the decrease of mitophagy in liver.

endurancetraining；alcohol－inducedacutehepaticinjury；mitophagy；rat；animalexperiment

1000－677X（2011）10－0085－06

2011－07－16；

2011－09－16

馬國棟（1974－），男，山東臨沂人，副教授，博士，研究方向?yàn)檫\(yùn)動(dòng)與健康促進(jìn)，Tel：（0533）2786023，E－mail：mgdtj＠sina.com；劉艷環(huán)（1971－），女，吉林白城人，講師，碩士，研究方向?yàn)檫\(yùn)動(dòng)與健康促進(jìn)，Tel：（0533）2786023，E－mail：mgdtj＠126.com。

山東理工大學(xué)體育學(xué)院，山東淄博255049 School of Physical Education，Shandong University of Technology，Zibo 255049，China.

G804.3

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