姚興存，蔣棟磊，盤(pán)賽昆，舒留泉

(淮海工學(xué)院江蘇省海洋生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇連云港，222005)

條斑紫菜蛋白酶解物降血壓活性

姚興存，蔣棟磊，盤(pán)賽昆，舒留泉

(淮海工學(xué)院江蘇省海洋生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇連云港，222005)

研究了以條斑紫菜為原料，采用木瓜蛋白酶制備紫菜蛋白活性寡肽，以ACE抑制率為評(píng)價(jià)指標(biāo)，研究不同水解條件下酶解液的降血壓活性，優(yōu)化酶解工藝條件并測(cè)定酶解物的分子量。優(yōu)化后的木瓜蛋白酶酶解工藝條件為pH7.5，溫度50℃，底物濃度30 mg/mL，酶添加量600 U/g，在此條件下，水解4 h的酶解產(chǎn)物抑制活性達(dá)30%以上，ACE抑制肽的半抑制濃度IC50值為4.48 mg/mL。將制備的酶解液進(jìn)行層析分析，測(cè)得具有降血壓活性的紫菜蛋白酶解產(chǎn)物是相對(duì)分子質(zhì)量小于2 000的活性肽。

條斑紫菜，ACE抑制活性，木瓜蛋白酶

條斑紫菜(Porphyra yezoensis)為海洋食用藻類(lèi)，大量人工養(yǎng)殖于長(zhǎng)江以北的江蘇沿海，主要成分為碳水化合物和約30%的蛋白質(zhì)［1］，此外還含有維生素、礦物質(zhì)及生物活性物質(zhì)等，對(duì)預(yù)防高血壓、冠心病等有較好功效［2］。近年來(lái)，紫菜的深加工研究取得了一定進(jìn)展，利用復(fù)合酶水解得到的水解混合物，已證明具有降血脂、防止動(dòng)脈粥樣硬化的功能［3］。王茵等［4］研究了壇紫菜的6種蛋白酶水解物的降血壓活性，優(yōu)化了AS1398中性蛋白酶的酶解工藝;何榮海等［5－7］研究了超聲波輔助酶提取、酶與膜分離耦合、混合酶法等制備紫菜降壓肽的方法及條件。本研究以連云港產(chǎn)條斑紫菜為原料，使用作用條件溫和、對(duì)植物蛋白質(zhì)有較好水解效果的木瓜蛋白酶水解紫菜蛋白質(zhì)，研究紫菜蛋白酶解物的降血壓活性及其分子量分布，為開(kāi)發(fā)新一代海洋功能性食品，提升紫菜深加工的技術(shù)水平提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

條斑紫菜為2010年3月連云港西墅物產(chǎn)有限公司生產(chǎn)的紫菜干品。50℃烘干至恒重，粉碎機(jī)粉碎，100目過(guò)篩后超臨界CO2流體萃取除去脂肪，儲(chǔ)于廣口瓶中干燥保存。

血管緊張素轉(zhuǎn)化酶(ACE)、馬尿酰組胺酰亮氨酸(HHL)、輔酶 I(NAD)、短桿菌肽(Bacit racin zinc)、藍(lán)色葡聚糖2000(Dextran blue 2000)等購(gòu)于美國(guó)Sigma公司;Sephadex G-15為Pharmacia公司產(chǎn)品;木瓜蛋白酶(酶活力為30 000 U/g)、乙酸乙酯等購(gòu)于上海生工有限公司;馬尿酸、酪氨酸等購(gòu)于國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司;其它試劑皆為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2 主要儀器

T6新世紀(jì)紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)，北京普析通用儀器有限責(zé)任公司;Duo Flow層析系統(tǒng)，美國(guó)Bio-Rad公司;Primo R多用途臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)，美國(guó)熱電公司;PHS-3C精密pH計(jì)，上海精密科學(xué)儀器有限公司;FW-100高速萬(wàn)能粉碎機(jī)，天津市泰斯特儀器有限公司;KS-300超聲波粉碎機(jī)，寧波科生儀器廠;RE-501旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，南京金正科教儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 酶解液的制備

精確稱(chēng)取一定量紫菜干粉放入燒杯中，加100 mL水混合均勻，超聲輔助提取15 min，倒入離心杯中4 000 r/min離心10 min，取上清液定容到100 mL。將提取液倒入三角瓶中，調(diào)節(jié)pH，加入木瓜蛋白酶，充分均勻后于50～60℃水浴中酶解，每間隔20 min振蕩1次，4h后取出，100℃滅酶10 min，自然冷卻后8 000 r/min離心15 min，收集上清液冷藏備用。

1.3.2 酶解物降血壓活性測(cè)定

體外降血壓活性用血管緊張素轉(zhuǎn)換酶(ACE)的抑制率來(lái)表示，抑制活性的測(cè)定采用紫外比色法［8］并對(duì)部分試劑用量進(jìn)行適當(dāng)調(diào)整。在反應(yīng)試管內(nèi)，依次加入75μL 8.3 mmol/L HHL底物液、25μL抑制劑(酶解液)混合均勻，(37±0.5)℃恒溫水浴預(yù)熱3－5 min，然后加入10 μL 0.05 U/mL ACE液充分混合，在(37±0.5)℃水浴中反應(yīng)1 h，反應(yīng)結(jié)束后立即加入150 μL 1 mol/L HC1以終止反應(yīng)(空白組需提前加入HC1)。然后于各試管中加入1.7 mL乙酸乙酯，旋渦混合后4 000 r/min離心10 min;吸取1.4 mL乙酸乙酯層移于另1支小試管中，放入80℃烘箱中揮發(fā)溶劑3h，取出冷卻后加入超純水3 mL(50～60℃水浴預(yù)熱)，旋渦混合30 s后在228 nm下測(cè)定吸光度，計(jì)算公式如下:

式中:Ab:樣品b的吸光度，樣品b在反應(yīng)中不加抑制劑，反應(yīng)結(jié)束后添加抑制劑以維持整個(gè)反應(yīng)體系平衡，是ACE與HHL完全反應(yīng)的對(duì)照;Aa:樣品a的吸光度，樣品a在反應(yīng)中加抑制劑，是ACE與HHL同時(shí)反應(yīng)的樣品;Ac:樣品c的吸光度，樣品c在反應(yīng)前先失活A(yù)CE，再加抑制劑，是ACE與HHL反應(yīng)的空白。

1.3.3 酶解物相對(duì)分子質(zhì)量分布測(cè)定

采用凝膠層析法測(cè)定［9－10］，由 SephadexG-15 柱(φ1 cm×49.6 cm)分析檢測(cè)。以5 mmol/L磷酸緩沖液(pH7.0)為洗脫液，流速為0.4 mL/min，上樣量為2 mL，QuadTecTM檢測(cè)器檢測(cè)，檢測(cè)波長(zhǎng)280 nm。標(biāo)準(zhǔn)樣分別為L(zhǎng)-酪氨酸(Mr=181.19)，AMP(Mr=347.2)，輔酶 I(NAD，Mr=681.44)，短桿菌肽(Mr=1486.2)，用緩沖液配成5mg/mL的溶液備用，用藍(lán)色葡聚糖2000測(cè)定柱外水體積Vo，然后由標(biāo)準(zhǔn)樣的保留時(shí)間計(jì)算出相應(yīng)的洗脫體積Ve，以相對(duì)分子質(zhì)量的對(duì)數(shù)值(logMr)為橫坐標(biāo)，Kav［即(Ve－Vo)/(Vt－Vo)］為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。樣品的相對(duì)分子質(zhì)量根據(jù)其洗脫體積由標(biāo)準(zhǔn)曲線求得。

2 結(jié)果與分析

2.1 酶解工藝條件的優(yōu)化

為進(jìn)一步確定木瓜蛋白酶水解紫菜制備降血壓肽的最優(yōu)工藝條件，在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，采用L9(34)正交試驗(yàn)，研究因素間的交互作用。每組正交試驗(yàn)重復(fù)處理3次，結(jié)果取平均值，應(yīng)用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)分析軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理。試驗(yàn)因素和水平設(shè)計(jì)見(jiàn)表1，正交試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表2，正交試驗(yàn)結(jié)果方差分析見(jiàn)表3。

表1 L9(34)正交試驗(yàn)因素水平表

表2 正交試驗(yàn)結(jié)果

表3 正交試驗(yàn)結(jié)果方差分析

由表2的極差分析和表3的方差分析可以看出，每個(gè)因素對(duì)抑制率的影響是不同的，因素對(duì)木瓜蛋白酶水解紫菜蛋白的影響主次順序是A＞C＞D＞B，即pH和酶解溫度對(duì)紫菜蛋白的水解度影響極其顯著，其次是底物濃度，加酶量的影響不顯著。由此，確定各因素的最優(yōu)水平組合為A3B3C1D3，即最佳水解條件為:酶解pH值7.5，酶添加量為600 U/g，溫度為50℃，底物濃度為30 mg/mL。在此條件下，進(jìn)行3次驗(yàn)證試驗(yàn)，測(cè)得紫菜蛋白酶解液ACE抑制率平均值為34.2%，說(shuō)明最佳工藝條件的酶解物具有最大抑制率。

2.2 酶解液降血壓活性的量效關(guān)系

在優(yōu)化的酶解條件下，即酶解pH值7.5，加酶量600 U/g，溫度為50℃，底物濃度為30 mg/mL制備酶解液。將制備的酶解液濃縮5倍后，分別稀釋至原液的5、4.5、4、3.5、3、2.5、2、1.5、1、0.5 倍，得到 10 組濃度不同的酶解液，分別進(jìn)行ACE抑制活性測(cè)定試驗(yàn)，結(jié)果如圖1所示。

圖1 不同濃度酶解液的ACE抑制率

由圖1可見(jiàn)，紫菜木瓜蛋白酶解液隨著樣品濃度的升高，ACE抑制率明顯增加，且抑制率與劑量(濃度)之間存在良好的對(duì)數(shù)回歸關(guān)系，由方程計(jì)算木瓜蛋白酶酶解的紫菜蛋白水解產(chǎn)物對(duì)ACE的半抑制濃度IC50值為4.48 mg/mL，表明紫菜木瓜蛋白酶解液具有較強(qiáng)的降血壓活性。

2.3 酶解物相對(duì)分子質(zhì)量分布的測(cè)定

試驗(yàn)測(cè)得SephadexG-15柱的Vo為17.95 mL，Vt為38.96 mL，由各標(biāo)準(zhǔn)物的保留時(shí)間計(jì)算出相應(yīng)的Ve，進(jìn)而計(jì)算出有效分配系數(shù)Kav，制作標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖2，圖3為木瓜蛋白酶紫菜蛋白酶解產(chǎn)物的層析色譜圖。

圖2 用SephadexG-15凝膠層析測(cè)定分子量標(biāo)準(zhǔn)曲線圖

圖3 木瓜蛋白酶解液層析色譜圖

圖3 顯示，具有較高ACE抑制活性的紫菜蛋白產(chǎn)物活性峰主要分布在保留時(shí)間為60.91 min處，其次為保留時(shí)間121.92 min和45.55 min處。通過(guò)將以上3峰的保留時(shí)間計(jì)算后代入圖2的標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算得出第1峰的相對(duì)分子質(zhì)量為1 995，第2峰的相對(duì)分子質(zhì)量為1 259，第3峰的相對(duì)分子質(zhì)量為170。因此，具有降血壓效果的紫菜蛋白酶解產(chǎn)物主要是相對(duì)分子量小于2 000的活性肽。

3 結(jié)論

以木瓜蛋白酶水解條斑紫菜制備具有生物活性的小分子肽，其ACE抑制肽的IC50為4.48 mg/mL;將最佳酶解條件下制備的酶解液進(jìn)行層析分析得到具有降血壓效果的紫菜蛋白酶解產(chǎn)物的相對(duì)分子質(zhì)量分布在2 000以下;以ACE抑制率為評(píng)價(jià)指標(biāo)，通過(guò)正交試驗(yàn)進(jìn)一步優(yōu)化了酶解條件，木瓜蛋白酶制備紫菜降血壓肽的最佳工藝條件是pH7.5，溫度50℃，底物濃度30 mg/mL，酶用量600 U/g，水解時(shí)間4 h。

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Study on Antihypertensive Activity of Bioactive Oligopeptide from Porphyra yezoensis Proteins

Yao Xing-cun，Jiang Dong-lei，Pan Sai-kun，Shu Liu-quan
(Jiangsu Key Laboratory of Marine Biotechnology，Huaihai Institute of Technology，Lianyungang 222005，China)

In the paper，the preparation of bioactive oligopeptides from Porphyra yezoensis proteins in the presence of papain was studied.The ACE inhibitory activity was used as response to optimize the enzymatic conditions.The molecular weight distribution of the hydrolysates was determined by gel filtration chromatography on SephadexG-15 column.The result of which showed that the optimum conditions were pH 7.5，temperature 50℃，substrate concentration 30mg/mL，addition amount of enzyme 600 U/g.Under such conditions，and hydrolyzing for 4 hours，the inhibitory activity of the hydrolysates reached up to 30%，with IC50 value reaching 4.48mg/mL.The hydrolysates of Porphyra yezoensis were then determined by chromatography，the result of which showed that the hydrolysates of antihypertensive activity from Porphyra yezoensis proteins was mainly oligopeptide with molecular weight less than 2000.Key words Porphyra yezoensis，ACE inhibitory activity，Papain

碩士，副教授。

*江蘇省海洋生物技術(shù)重點(diǎn)建設(shè)實(shí)驗(yàn)室開(kāi)放課題(2008HS015)

2010－07－28，改回日期:2010－11－12