侯士方 孟 馨 相泓冰 王滌非

蛋白激酶C對(duì)胰島素抵抗骨骼肌細(xì)胞的影響

侯士方 孟 馨 相泓冰 王滌非＊

(中國(guó)醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院內(nèi)分泌科遼寧沈陽(yáng)110001)

目的 探討蛋白激酶C(Protein Kinase C,PKC)在棕櫚酸(Palmitic Acid,PA)誘導(dǎo)的骨骼肌細(xì)胞胰島素抵抗(Isulin Resistance,IR)中的作用。方法 免疫熒光鑒定原代大鼠骨骼肌細(xì)胞,氧化酶-過(guò)氧化物酶偶聯(lián)法(GOD-POD法)檢測(cè)培養(yǎng)液中葡萄糖濃度。設(shè)立對(duì)照組、棕櫚酸組(PA組)、羅格列酮組(Rosiglitazone,Ros組),每組一分為二,分別加 PKC抑制劑白屈萊紅堿(Chelerythrine Chloride,CC)與正常培養(yǎng)液作用1h,Western Blot檢測(cè)PKB及P-Ser473 PKB表達(dá)水平。結(jié)果90%以上的細(xì)胞α-sarcometric actin免疫熒光染色呈陽(yáng)性反應(yīng),表明培養(yǎng)的細(xì)胞為骨骼肌細(xì)胞;0.6mmol/L的PA作用24h可誘導(dǎo)骨骼肌細(xì)胞產(chǎn)生胰島素抵抗;PA組與對(duì)照組相比P-Ser473 PKB水平顯著降低,與本組未加CC相比顯著升高。同時(shí),羅格列酮組及本組加CC中P-Ser473PKB水平均高于PA組。結(jié)論 在PA誘導(dǎo)的骨骼肌細(xì)胞IR方面PKC起重要作用,羅格列酮與PKC抑制劑CC均能改善PA引起的IR。

胰島素抵抗; 蛋白激酶C; 蛋白激酶B; 棕櫚酸; 骨骼肌細(xì)胞

胰島素抵抗是葡萄糖耐量受損和2型糖尿病的主要特征,而胰島素受體信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)缺陷是胰島素抵抗發(fā)生的主要原因,骨骼肌是胰島素刺激的葡萄糖攝取的主要靶組織,也是胰島素抵抗發(fā)生的主要部位[1],因此研究骨骼肌胰島素抵抗的發(fā)生機(jī)制,將有助于進(jìn)一步理解2型糖尿病發(fā)病機(jī)理及病理生理機(jī)制。本研究從胰島素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑出發(fā),探討棕櫚酸引起骨骼肌細(xì)胞IR的分子機(jī)制及PKC在棕櫚酸誘導(dǎo)骨骼肌細(xì)胞 IR中的作用,為臨床尋找有效的預(yù)防和治療2型糖尿病靶點(diǎn)奠定理論基礎(chǔ)和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

材料和方法

1.實(shí)驗(yàn)動(dòng)物和試劑 SD大鼠(沈陽(yáng)博爾美公司),DMEM培養(yǎng)基(HyClone公司),優(yōu)級(jí)胎牛血清(天津?yàn)?,胰蛋白酶(沈陽(yáng)寶泰克),棕櫚酸(中國(guó)醫(yī)藥),羅格列酮(Cayman Chemical),白屈萊紅堿(Chelerythrine Chloride,CC)(Sigmal公司),諾和靈(諾和諾德公司提供),葡萄糖檢測(cè)試劑盒(上海榮升),α-sarcometric actin單克隆抗體和羅丹明(TRITC)標(biāo)記的二抗(北京中衫),PKB多克隆抗體及堿性磷酸酶(AL P)標(biāo)記的羊抗兔二抗(bioworld公司),P-Ser473PKB多克隆抗體(SAB公司)

2.骨骼肌細(xì)胞培養(yǎng)及純化 取新生3-5d的SD大鼠,斷頭處死,浸泡在 75℅乙醇中消毒15min,無(wú)菌濾紙擦干。超凈臺(tái)內(nèi)去皮、剪下四肢、去爪。盡量去除脂肪、肌腱等結(jié)締組織,PBS洗3次。將肌肉組織剪成1 mm3左右的碎塊,PBS洗3次。Ⅰ型膠原酶和胰蛋白酶聯(lián)合消化30min,依次濾過(guò) 100、200、400 目的篩網(wǎng)[2、3]。用 10%胎牛血清的DMEM懸浮細(xì)胞,將細(xì)胞懸液接種于L-多聚賴氨酸鋪底的培養(yǎng)瓶中,37℃、5℅CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng),1h后將上清液重新接種,重復(fù)接種2次,每2-3d換液,5-7d后傳代即可獲得原代培養(yǎng)的骨骼肌細(xì)胞。

3.骨骼肌細(xì)胞的免疫熒光鑒定 將無(wú)菌蓋玻片放入6孔板中進(jìn)行細(xì)胞爬片,當(dāng)細(xì)胞增殖至70%密度后,用含3℅胎牛血清的DMEM進(jìn)行分化培養(yǎng),48h后細(xì)胞分化為成熟的肌管,免疫熒光方法鑒定骨骼肌細(xì)胞。

4.GOD-POD法測(cè)定葡萄糖濃度 細(xì)胞以1×104/ml接種于48孔板,分化培養(yǎng)為成熟的肌管后,每6孔一組,分別加入正常培養(yǎng)液(對(duì)照組)、0.6 mmol/L PA 的培養(yǎng)液(PA 組),于 6h、12h、24h加入胰島素刺激15min,GOD-POD法(按說(shuō)明書進(jìn)行)測(cè)定每孔培養(yǎng)液中葡萄糖濃度。

5.Western blot檢測(cè)PKB及P-Ser473 PKB的表達(dá)水平 根據(jù)每組加與不加 CC,分為對(duì)照(+)、對(duì)照(-);PA(+)、PA 組(-);Ros(+)、Ros(-)六組,各組一分為二,分別用正常培養(yǎng)基和胰島素(1×10-7mol/L)作用15min后收集細(xì)胞。PBS洗2次,加入蛋白裂解液,冰上裂解30min,考馬斯亮藍(lán)法(比色法)測(cè)定蛋白濃度。每組上樣蛋白150μg,10%SDS-PA GE凝膠電泳,濕法電轉(zhuǎn)移至 PVDF膜上(電轉(zhuǎn)3h);5%脫脂奶粉封閉,4℃過(guò)夜。棄去封閉液,用0.1%Tween-20 TBST洗膜,10 min×3次。將膜置于塑料袋內(nèi),分別加入0.1%Tween-20的 TBST稀釋的 抗 PKB(1:600)、抗 P-Ser473 PKB(1:600)及β-actin(1:1500)一抗,室溫孵育2h。TBST洗膜,10min×3次;然后用辣根過(guò)氧化酶標(biāo)記羊抗兔二抗(1:15000),室溫孵育1.5h,TBST洗膜,10min×3次,ECL發(fā)光。采用 Graph Pad Prism 5軟件進(jìn)行Western blot灰度值分析。

6.統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 用SPSS 13.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析,數(shù)據(jù)以 ˉx±s表示,組間比較使用配對(duì)t檢驗(yàn),P<0.05差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,P<0.01,差異有極顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1.骨骼肌細(xì)胞形態(tài)觀察

倒置顯微鏡下觀察原代骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞,開(kāi)始為單核的長(zhǎng)梭形細(xì)胞(圖1.A),逐漸融合為多核的長(zhǎng)條形肌管,按一定方向呈有序排列,核位于中央,類似骨骼肌的縱切面(圖1.B)。

圖1 A.肌細(xì)胞培養(yǎng)5天 (×20)圖1 B.肌細(xì)胞培養(yǎng)8天 (×20)Fig.1 A.Skeletal muscle cell raises for 5 days(×20)Fig.1 B.Skeletal muscle cell raises for 8 days(×20)

2.免疫熒光鑒定骨骼肌細(xì)胞

將分化成熟的成肌細(xì)胞,行免疫熒光染色,90%的細(xì)胞α-sarcometric actin克隆抗體染色呈陽(yáng)性反應(yīng),胞漿染成紅色,表明培養(yǎng)的細(xì)胞為骨骼肌細(xì)胞[4](圖2)。

圖2 骨骼肌細(xì)胞α-sarcometric actin的熒光染色(×40)Fig.2 α-sarcometric actin antibody staining of skeletal muscle cell(×40)

3.GOD-POD法測(cè)定上清液中葡萄糖濃度結(jié)果

棕櫚酸作用6h、12h后,PA組培養(yǎng)液中葡萄糖濃度與對(duì)照組相比差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),24h后,PA組培養(yǎng)液中葡萄糖濃度較正常組顯著升高,差異有極顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01),對(duì)胰島素刺激的糖轉(zhuǎn)運(yùn)產(chǎn)生抑制[4](見(jiàn)表1)。

表 1 (ˉx±s,n=6,mmol/L)

4.Western blot檢測(cè)PKB及P-Ser473 PKB表達(dá)

在基礎(chǔ)狀態(tài)下及胰島素刺激15min后,對(duì)照(-)、PA(-)、對(duì)照(+)、PA(+)、Ros(-)、Ros(+)之間PKB(Akt)蛋白水平差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)(圖3、4)。基礎(chǔ)狀態(tài)及胰島素刺激15min后,PSer473 PKB表達(dá)水平在 PA(-)組顯著低于對(duì)照(-),差異有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01);而 Ros(-)組和Ros(+)組顯著高于 PA(-),差異有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01);當(dāng)用 PKC抑制劑CC作用1h,PA(+)組與PA(-)組相比,P-Ser473PKB表達(dá)顯著增加,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);而 Ros(+)組,對(duì)照(+)組與本組未加抑制劑相比P-Ser473 PKB表達(dá)水平,差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)(圖5、6)。

圖3 基礎(chǔ)狀態(tài)下PKB的蛋白表達(dá)Fig.3 Western blot analysisfor PKB in the absenceof insulin

圖4 胰島素刺激15分鐘PKB的蛋白表達(dá)Fig.4 Western blot analysis PKB treated with insulin for 15 minutes

圖5 基礎(chǔ)狀態(tài)下P-Ser437PKB蛋白表達(dá)Fig.5 Western blot analysis for P-Ser437PKB in the absence of insulin

圖6 胰島素刺激15分鐘P-Ser437PKB蛋白表達(dá)Fig.6 Western blot analysis for P-Ser437PKB treated with insulin for 15 minutes.

討 論

目前,IR的發(fā)病機(jī)制尚不完全清楚,骨骼肌是機(jī)體利用葡萄糖的主要器官之一,80℅的葡萄糖在骨骼肌內(nèi)代謝,也是 IR發(fā)生的主要部位。胰島素主要通過(guò)IRS-1/PI3K/PKB(Akt)途徑促進(jìn)葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)。PKB是PI3K信號(hào)通路下游受體蛋白激酶的主要靶點(diǎn),由PI3 K激活后其結(jié)構(gòu)發(fā)生變化導(dǎo)致其兩個(gè)調(diào)節(jié)位點(diǎn) Thr308和Ser-473磷酸化。在多數(shù)情況下,Ser-473位點(diǎn)磷酸化水平可以代表PKB的磷酸化程度[5-6],磷酸化的 PKB能刺激葡萄糖攝取和 Glut-4轉(zhuǎn)位,調(diào)節(jié)葡萄糖攝取、糖原合成、糖酵解等胰島素代謝反應(yīng)[7]。本實(shí)驗(yàn)中PA組P-Ser473 PKB的水平低于對(duì)照組,表明 PA誘導(dǎo)骨骼肌細(xì)胞產(chǎn)生IR與 PKB活性降低有關(guān)[4]。而 PA組加用CC與本組未加CC相比,P-Ser473 PKB的水平是升高的,表明 PKC抑制劑可增加 IR中 P-Ser473 PKB的表達(dá),PKC可能通過(guò)抑制PKB的活性而影響胰島素信號(hào)的下傳。同時(shí),PA組P-Ser473 PKB的水平顯著低于羅格列酮組(加CC和不加CC),提示胰島素增敏劑羅格列酮可增加胰島素抵抗肌組織中PKB的磷酸化水平,而 PKC抑制劑CC與羅格列酮存在相似性的作用,二者均可以改善骨骼肌胰島素抵抗。此外,各組的PKB蛋白總體水平并沒(méi)有發(fā)生變化,說(shuō)明在胰島素抵抗?fàn)顟B(tài)下,PKB的總蛋白水平并不減少,只是活性降低,而羅格列酮和CC并不增加PKB總蛋白的表達(dá)水平,只是使其活性增加。

蛋白激酶C(Protein Kinase C,PKC)是1977年由Nishizuka在鼠腦的胞質(zhì)成分中發(fā)現(xiàn)的一種依賴磷脂和鈣的蛋白激酶,由多種亞型構(gòu)成,目前發(fā)現(xiàn)其包括α、β、δ、ε、γ、η、μ、φ、θ等 12 種亞 型[8]。研究顯示,C2C12細(xì)胞中 PKCδ激活可使 IRS-1的Ser357發(fā)生磷酸化,從而降低胰島素介導(dǎo)的 IRS-1的酪氨酸磷酸化,進(jìn)一步使 PKB的激活減少,即PKCδ激活對(duì)胰島素信號(hào)起負(fù)性調(diào)節(jié)作用[9、10]。Kim等報(bào)道 PKC-θ失活可明顯減少 IRS-1降解并增加胰島素誘導(dǎo)的IRS-1酪氨酸磷酸化和與p85相關(guān)的IRS-1和PI3K的磷酸化[11]。Cipok發(fā)現(xiàn)選擇性的抑制PKC-α可改變 IRS-1水平最終使通路中PKB增加[12]。

綜上所述,在 PA誘導(dǎo)的骨骼肌細(xì)胞 IR方面PKC起重要作用,它能抑制 PKB活性并減少葡萄糖利用,PKC抑制劑CC與羅格列酮一樣具有改善PA引起的IR的作用。PKC抑制劑CC增加PKB的磷酸化可能是通過(guò)減少了PKC的過(guò)度激活,而減少其對(duì)PKB的抑制,從而對(duì)胰島素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)起正調(diào)節(jié)。當(dāng)然,我們的后續(xù)研究會(huì)研究PKC的各亞型的功能,從而了解PKC在IR中的全面作用,為T2DM的治療提供新的靶點(diǎn)。

[1]Schmitz-Peiffer C.Protein Kinase C and Lipid-Induced Insulin Resistance in Skeletal Muscle.Ann N Y Acad Sci,2002,967:146-57

[2]王紅勇,何作云,等.骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞的純化、培養(yǎng)、鑒定及生物學(xué)特性的研究.重慶醫(yī)學(xué),2006,35(8):692-694

[3]張晨暉,朱道立.大鼠骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞培養(yǎng)的研究.安徽農(nóng)業(yè)科學(xué),2008,36(12):5004-5006.

[4]侯士方,孟馨,相泓冰等.胰島素抵抗骨骼肌細(xì)胞中 PSer473PKB及糖原合成酶-3表達(dá).山西醫(yī)藥雜志,2011,40(1):9-12

[5]Brazil DP,Hemmings BA.Ten yearsof protein kinase B signalling:a hard Akt to follow.Trends Biochem Sci,2001,26(11):657-664

[6]Brand C,Cipok M,Attali V,et at.Protein kinase C delta participates in insulin-induced activation of PKB via PDK1.J Biochemical and Biophysical Research Communications,2006,349(3):954-962

[7]Tremblay F,Lavigne C,J acques H,et al.Dietary cod protein restores insulin-induced activation of phosphatidylinositol 3-kinase/Akt and Glu T-4 translocation to the T-tubules in skeletal muscle of high-fat-fed obese rats.Diabetes,2003,52(1):29-37

[8]梁佩芳,顧勇,楊道茂,等.從天然產(chǎn)物中尋找蛋白激酶C抑制劑的研究進(jìn)展.中國(guó)藥物化學(xué)雜志,2007,17(4):245-262

[9]Waraich RS,Weigert C,Kalbacher H.Phosphorylation of Ser357 of Rat Insulin Receptor Substrate-1 Mediates Adverse Effects of Protein Kinase C-δon Insulin Action in Skeletal Muscle Cells.J Biol Chem Vol,2008,283(17)11226-11233

[10]Greene MW,Morrice N,Garofalo RS,et a1.Modulation of human insulin receptor substrate-1 tyrosine phosphorylation by protein kinase Cdelta.J.Biochem,2004,378:105-116

[11]Kim JK,Fillmore JJ,Sunshine MJ,et al.PKC-theta knockout mice are p rotected f rom fat-induced insulin resistance.J Clin Invest,2004,114(6):823-827

[12]Cipok M,Aga-Mizrachi S,Bak A.Protein kinase Cαregulates insulin receptor signaling in skeletal muscle.J Biochemical and Biophysical Research Communications,2006,345(2):817-824

Influence of protein kinase C on insulin resistance in skeletal muscle cells

Hou Shifang,Meng Xin,Xiang Hongbing,Wang Difei＊
(Dept of Endorinology,The 1st Af tiliated Hospital,China Medical University,Liaoning 110001,China)

Objective To study the role of protein kinase Cin the mechanism of insulin resistance(IR)induced by palmitic acid in skeletal muscle cells.Methods The primary rat skeletal muscle cells were identified by immunofluorescence,and the glucose concentration was measured by GOD-POD method.Control group,palmitic acid group and rosiglitazone group were each divided into two subgroup s,which

either,the PKCinhibitor chelerythrine chloride or common culture solution for one hour.Levelsof protein kinase B and its phosphorylated form(P-Ser473 PKB)were determined by Western blot.Results Immunofluorescent staining showed that more than 90%of the cells were positively stained forα-sarcometric actin,which proved that the obtained cells were skeletal muscle cells.After 24 hours of treatment with 0.6mmol/L PA,the skeletal muscle cells could be induced for IR.The level of P-Ser473 PKB in the PA group decreased significantly compared to that of the control group and elevated significantly compared to that of the PA group without CC.Meanwhile,the level of P-Ser473 PKB in rosiglitazone and rosiglitazone with CC groups were significantly elevated compared to that of the PA group.Conclusion PKC plays an important role in insulin resistance induced by PA in skeletal muscle cells.Both rosiglitazone and chelerythrine chloride can significantly improve IR induced by PA.

Insulin resistance; Protein kinase C; Protein kinase B; Palmitic acid; Skeletal muscle cells

R322.57

A

10.3870/zgzzhx.2011.03.006

2010-11-06

2011-04-03

遼寧省高等學(xué)?？蒲杏?jì)劃項(xiàng)目(2010225002);遼寧省教育廳科技基金(L2010626);遼寧省自然基金(20092113);遼寧省科技廳專項(xiàng)科研基金(2008934)

侯士方,女(1983年),漢族,碩士研究生。

＊通訊作者(To whom correspondence should be addressed)