徐淑梅，劉卓剛

(中國(guó)醫(yī)科大學(xué)附屬盛京醫(yī)院血液科，沈陽(yáng) 110021)

腫瘤的發(fā)生、發(fā)展是一個(gè)多因素、多步驟的生物學(xué)過(guò)程，一方面與細(xì)胞增殖的基因過(guò)度表達(dá)及分化調(diào)控紊亂有關(guān)，另一方面與調(diào)控細(xì)胞凋亡的基因異常有關(guān)。近年來(lái)，細(xì)胞凋亡與腫瘤關(guān)系成為研究的熱門(mén)課題，生存素(survivin)是凋亡抑制蛋白(inhibitor of apoptosis proteins，IAP)家族的成員，廣泛表達(dá)于人的胚胎組織和多數(shù)腫瘤組織，具有抑制細(xì)胞凋亡和調(diào)節(jié)細(xì)胞有絲分裂的生物學(xué)功能，是聯(lián)系細(xì)胞周期和細(xì)胞凋亡的重要因子。筆者就生存素的分子結(jié)構(gòu)及生物學(xué)功能、生存素與腫瘤表達(dá)、生存素與癌基因、生存素與腫瘤治療的研究進(jìn)展作一綜述。

1 生存素的分子結(jié)構(gòu)及生物學(xué)功能

1.1 生存素的分子結(jié)構(gòu) 生存素基因是AMBROSINI等［1］用效應(yīng)細(xì)胞蛋白酶受體-1(effector cell prorease recetpor-1，EPR-1)cDNA在人類基因組庫(kù)的雜交篩選中分離出來(lái)，是IAP家族相對(duì)分子質(zhì)量最小的成員，位于染色體17q25，全長(zhǎng)14.7 kb。生存素基因包含4個(gè)外顯子和3個(gè)內(nèi)含子，編碼142個(gè)氨基酸組成的相對(duì)分子質(zhì)量為16 500的蛋白質(zhì)。生存素具有獨(dú)特的蝶形領(lǐng)結(jié)樣結(jié)構(gòu)，僅含一個(gè)桿狀病毒 IAP重復(fù)序列(baculoviral IAP repeat，BIR)，位于生存素氨基端，為生存素發(fā)揮細(xì)胞凋亡作用所必需。羧基端不含有鋅指狀結(jié)構(gòu)，而代之以一個(gè)含有42個(gè)氨基酸形成的α-螺旋結(jié)構(gòu)。生存素的前體mRNA經(jīng)過(guò)選擇性拼接可產(chǎn)生不同的剪接變構(gòu)體，具有不同的抗凋亡特性，一種是缺乏外顯子3的生存素(生存素-ΔEx3)，另一種是保留了部分內(nèi)含子2作為隱性外顯子的生存素(生存素-2B)。生存素-ΔEx3保留抗凋亡特性，而生存素-2B的抗凋亡能力明顯降低。

細(xì)胞周期依賴元件(cell-cycle dependent element，CDE)和細(xì)胞周期同源性區(qū)域(cell-cycle genes homology region，CHR)特異性存在于G2/M期表達(dá)基因。生存素基因在2 811 bp處有一個(gè)開(kāi)放閱讀框，基因上游2 560～2 920 bp是生存素基因的啟動(dòng)子，缺少TATA盒，富含GC，有3個(gè)CDE和1個(gè)CHR。生存素在G2/M期的表達(dá)可克服凋亡的“關(guān)卡”，通過(guò)有絲分裂促進(jìn)細(xì)胞的異常增殖，提示生存素主要是G2/M期的調(diào)節(jié)基因。

1.2 生存素的生物學(xué)功能 細(xì)胞凋亡主要是通過(guò)效應(yīng)蛋白酶(Caspase)來(lái)實(shí)現(xiàn)的，體外實(shí)驗(yàn)證明，生存素可特異結(jié)合于細(xì)胞凋亡蛋白酶的終末階段分子Caspase-3、Caspase-7［2］，發(fā)揮抑制凋亡的作用。腫瘤細(xì)胞表達(dá)生存素不僅可以阻斷Fas介導(dǎo)的凋亡信號(hào)途徑來(lái)逃避免疫細(xì)胞的殺傷，如細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞(cytotoxic T lymphocyte，CTL)和自然殺傷(natural killer，NK)細(xì)胞，而且可以通過(guò)增強(qiáng)Fas配體的表達(dá)反過(guò)來(lái)抑制免疫細(xì)胞的殺傷作用［3］。生存素的磷酸化修飾是決定其功能的重要因素。生存素的磷酸化位點(diǎn)是34位的蘇氨酸(threonine 34，Thr34)，在有絲分裂前、中期，生存素與有絲分裂激酶P34 cdc2-CyclinB1在裝配體上形成復(fù)合體并被其在Thr34上磷酸化，Thr34磷酸化的生存素與 Caspase-9形成生存素/Caspase-9復(fù)合體發(fā)揮抗凋亡作用，而Thr34非磷酸化導(dǎo)致生存素/Caspase-9復(fù)合體從裝配體上解離，釋放出Caspase-9導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。生存素還可以通過(guò)與Smac/DIABLO(即第2個(gè)線粒體來(lái)源的胱氨酸酶激活劑或低等電點(diǎn)IAP直接結(jié)合蛋白)作用，使XIAP活性增加，XIAP直接與Caspases結(jié)合達(dá)到抑制凋亡的作用;通過(guò)抑制p53、p21的功能阻斷凋亡過(guò)程［4］。

生存素不但具有抑制細(xì)胞凋亡的作用，而且參與細(xì)胞有絲分裂的調(diào)節(jié)和細(xì)胞質(zhì)分裂。有絲分裂初期，生存素與有絲分裂紡錘體微管蛋白特異性結(jié)合，抑制Caspase活性，降低凋亡的發(fā)生，維護(hù)有絲分裂的正常進(jìn)行。干擾生存素和微管蛋白的反應(yīng)，可使生存素抗凋亡活性喪失，增加Caspase-3的活性，導(dǎo)致細(xì)胞的G2/M期凋亡，細(xì)胞分裂異常，伴有多倍體細(xì)胞形成。在細(xì)胞周期的G2/M期，生存素能對(duì)抗異常因素誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡，而腫瘤細(xì)胞生存素的過(guò)度表達(dá)，能使細(xì)胞克服這個(gè)凋亡的調(diào)控點(diǎn)而利于轉(zhuǎn)化細(xì)胞，完成異常的有絲分裂。生存素也可與p21蛋白結(jié)合于中心粒上，使p21聚集在中心粒上，減弱p21對(duì)細(xì)胞周期的負(fù)性調(diào)節(jié)，使細(xì)胞周期縮短［4］。

研究顯示，生存素還參與血管形成過(guò)程，應(yīng)用血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子 (vascular endothelial growth factor，VEGF)和堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(buck fibroblast growth factor，bFGF)誘導(dǎo)靜止期的內(nèi)皮細(xì)胞，結(jié)果血管內(nèi)皮細(xì)胞內(nèi)生存素含量升高16倍，6～10 h達(dá)峰值，24 h開(kāi)始下降。炎癥因子、腫瘤壞死因子 α(tumor necrosis factorα，TNF-α)和白細(xì)胞介素(interleukin，IL)-1未能誘導(dǎo)血管內(nèi)皮細(xì)胞內(nèi)生存素的表達(dá)，提示生存素可能是血管形成中生長(zhǎng)因子誘導(dǎo)的保護(hù)性基因，維持血管內(nèi)皮細(xì)胞的正常增殖。

2 生存素與腫瘤表達(dá)

生存素主要分布于胚胎及分化未成熟的組織中，在成人體內(nèi)除胸腺、甲狀腺、子宮內(nèi)膜組織、生殖腺中有微量表達(dá)外，所有分化成熟的組織，包括外周血白細(xì)胞、淋巴結(jié)、脾、胰、腎、骨骼肌、肝、肺、腦以及心臟組織中均無(wú)表達(dá)。很多實(shí)體瘤和造血系統(tǒng)惡性腫瘤中都檢測(cè)到生存素的高表達(dá)，且表達(dá)陽(yáng)性患者的生存率相對(duì)陰性患者明顯降低，復(fù)發(fā)率則升高，與預(yù)后密切相關(guān)。體外實(shí)驗(yàn)在多種腫瘤細(xì)胞系中也檢測(cè)到生存素的高表達(dá)。美國(guó)國(guó)立癌癥研究中心使用的60種腫瘤細(xì)胞系的檢測(cè)結(jié)果顯示［2］:生存素在60種腫瘤細(xì)胞系中普遍高表達(dá)，包括乳腺癌、肺癌、結(jié)腸癌、卵巢癌、前列腺癌、腎癌、肝癌、黑色素瘤、白血病、淋巴瘤等，其中在乳腺癌及肺癌表達(dá)最高，腎癌表達(dá)最低。

3 生存素與癌基因

3.1 生存素與p53 野生型p53是生存素的負(fù)調(diào)控基因，能夠結(jié)合在生存素啟動(dòng)子上，從而抑制生存素的轉(zhuǎn)錄，推測(cè)在生存素啟動(dòng)子上可能存在p53基因結(jié)合位點(diǎn)，生存素參與了p53依賴性凋亡通路［5］。p53是bcl-2的上游調(diào)控基因，在正常情況下，野生型p53可以在轉(zhuǎn)錄水平上下調(diào)bcl-2，促使細(xì)胞發(fā)生凋亡，bcl-2水平的下調(diào)直接或間接的影響了生存素的表達(dá)［6］。

3.2 生存素與bcl-2 bcl-2是重要的細(xì)胞凋亡調(diào)節(jié)因子，通過(guò)對(duì)抗引起線粒體破裂的離子失衡，阻斷細(xì)胞色素C從線粒體向細(xì)胞質(zhì)釋放，在Caspase級(jí)聯(lián)反應(yīng)上游防止其活化，保持線粒體完整性。生存素主要是抑制Caspase-3和Caspase-7的活性，與bcl-2都可在線粒體水平參與抗凋亡，并具有協(xié)同性。此外，生存素基因與bcl-2基因都是由TATA的富含GC啟動(dòng)子調(diào)節(jié)的［注:T為胸腺嘧啶(thymine)，A為腺嘌呤(adenine)，G為鳥(niǎo)嘌呤(guanine)，C為胞嘧啶(cytosine)］，轉(zhuǎn)錄激活后均能增強(qiáng)細(xì)胞增殖，生存素基因所在的17q25染色體不穩(wěn)定，此位點(diǎn)可能涉及t(14;18)易位而導(dǎo)致bcl-2基因轉(zhuǎn)錄激活。ANGILERI等［7］對(duì)神經(jīng)膠質(zhì)瘤抗凋亡基因的研究中發(fā)現(xiàn)，8例低級(jí)星形細(xì)胞瘤中生存素與bcl-2都是高表達(dá)，證實(shí)二者抗凋亡的協(xié)同性。

3.3 生存素與Bax Bax基因?qū)俚蛲龌罨?，轉(zhuǎn)染Bax基因能修飾腫瘤細(xì)胞的惡性表型，Bax基因突變存在于多種惡性腫瘤，提示Bax基因也屬抑癌基因。研究發(fā)現(xiàn)，將Bax基因與生存素基因協(xié)同轉(zhuǎn)染腫瘤細(xì)胞系，其共同誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡比單純Bax基因轉(zhuǎn)染減少1/3，表明生存素基因可拮抗Bax基因的促細(xì)胞凋亡作用［7］。Bax過(guò)度表達(dá)誘發(fā)線粒體釋放細(xì)胞色素C，激活Caspase-9，Caspase-9又激活下游的 Caspase-3和Caspase-7。生存素可以影響B(tài)ax的表達(dá)，阻滯由Bax介導(dǎo)的細(xì)胞色素C向細(xì)胞質(zhì)釋放，從而抑制細(xì)胞凋亡［8］。

3.4 生存素與磷酸酶(phosphatase and tensin homolog deleted on chromosome 10，PTEN) 生存素與PTEN均參與細(xì)胞周期調(diào)控和細(xì)胞凋亡，兩者作用環(huán)節(jié)一致，但生物學(xué)效應(yīng)相反。研究發(fā)現(xiàn)，生存素與PTEN在腫瘤中的表達(dá)可能存在負(fù)性相關(guān)，腫瘤惡性程度越高，生存素基因表達(dá)越高，而PTEN表達(dá)越低。推測(cè)其機(jī)制是生存素的表達(dá)受PI3K/Akt信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑調(diào)控，而PTEN在正常生理情況下抑制PI3K/Akt通路，從而抑制生存素的表達(dá)。當(dāng)組織發(fā)生惡變，PTEN表達(dá)下調(diào)或缺失時(shí)，其對(duì)PI3K/Akt通路的抑制作用削弱，生存素表達(dá)上調(diào)［6］。生存素基因沉默和PTEN介導(dǎo)的腫瘤抑制密切相關(guān)［9］。

4 生存素與腫瘤治療

生存素表達(dá)水平下調(diào)可以直接調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞自身凋亡，增加腫瘤細(xì)胞對(duì)化療或放療敏感性，增強(qiáng)化療或放療等對(duì)腫瘤細(xì)胞凋亡的誘導(dǎo)作用。生存素成為腫瘤治療的關(guān)鍵靶點(diǎn)。

4.1 反義技術(shù) 應(yīng)用反義策略阻斷生存素表達(dá)，可明顯抑制腫瘤細(xì)胞的增殖，提高腫瘤細(xì)胞對(duì)化療藥物的敏感性，誘導(dǎo)凋亡的發(fā)生，而對(duì)正常組織幾乎沒(méi)有不良影響，具有良好的靶向性、特異性和安全性。

4.1.1 反義寡核苷酸 OLIE等［10］設(shè)計(jì)了針對(duì)生存素mRNA不同區(qū)域的反義寡核苷酸，其中針對(duì)生存素的mRNA232～251 bp位置的反義寡核苷酸最有效，可使生存素的mRNA表達(dá)減少70%，并且治療后的腫瘤對(duì)化療的敏感性增加。反義介導(dǎo)的生存素基因敲除使得腫瘤細(xì)胞增殖明顯受抑，反義寡核苷酸藥物L(fēng)Y2181308已進(jìn)入臨床試驗(yàn)階段。SPC3042通過(guò)下調(diào)生存素的表達(dá)，抑制細(xì)胞增殖和誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，并同時(shí)能下調(diào)bcl-2的表達(dá)，具有更強(qiáng)的穩(wěn)定性和抑制作用［11］。

4.1.2 核酶 靶向生存素的核酶載體轉(zhuǎn)染后能使生存素表達(dá)下降。CHOI等［12］設(shè)計(jì)了針對(duì)生存素mRNA 279 bp和289 bp位置，能夠特異降解生存素mRNA的兩個(gè)棒狀核酶(hammerhead ribozymes)，通過(guò)重組腺病毒導(dǎo)入乳腺癌細(xì)胞(MCF27)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)導(dǎo)入的核酶能夠有效降低生存素的表達(dá)，促進(jìn)依托泊苷用藥后的凋亡。PENNATI等［13］構(gòu)建了表達(dá)靶向生存素的核酶載體，轉(zhuǎn)染前列腺癌細(xì)胞DU145、PC3，穩(wěn)定表達(dá)核酶的細(xì)胞較對(duì)照前列腺細(xì)胞生存素的表達(dá)量明顯下降，并出現(xiàn)多倍體表型、Caspase-9依賴的凋亡，生存素表達(dá)的下調(diào)還導(dǎo)致前列腺癌細(xì)胞對(duì)順鉑的增敏，抑制接種于裸鼠的前列腺癌細(xì)胞形成腫瘤。

4.2 基因治療 主要包括2種方法:一種是生存素顯性失活突變體，將占優(yōu)勢(shì)的生存素顯性失活突變體導(dǎo)入腫瘤細(xì)胞后，減少內(nèi)源性生存素的表達(dá)，從而誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡和抑制細(xì)胞增殖。MESRI等［14］將含生存素突變體 T34A的腺病毒載體(Pad-T34A)注射到SCID小鼠體內(nèi)的移植性人乳腺癌瘤體內(nèi)，觀察發(fā)現(xiàn)腫瘤細(xì)胞增殖明顯受抑，通過(guò)轉(zhuǎn)染生存素(Pad-T34A)能誘導(dǎo)HeLa細(xì)胞等5種腫瘤細(xì)胞凋亡，而對(duì)正常增生活躍的組織細(xì)胞(纖維母細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞)則無(wú)影響，結(jié)果證明生存素(Pad-T34A)可在體內(nèi)和體外誘發(fā)凋亡。另一種是基于生存素基因啟動(dòng)子來(lái)促使腫瘤細(xì)胞中細(xì)胞毒基因表達(dá)。

4.3 小分子抑制劑

4.3.1 CDK抑制劑 cdc-2激酶抑制劑通過(guò)阻斷cdc-2對(duì)生存素的磷酸化作用，可以抑制腫瘤生長(zhǎng)和誘導(dǎo)凋亡。目前名為flavorpividol的藥物己用于臨床。

4.3.2 Hps90抑制劑 生存素的氨基酸序列賴氨酸(lysine，Lys)-7-Lys-90能與分子伴侶Hps90氨基末端結(jié)合，利于生存素穩(wěn)定表達(dá)，目前普遍認(rèn)為Hps90抑制劑，如17-AAG、shepherdin，能夠下調(diào)生存素，起到靶向腫瘤治療作用。Shepherdin能穿透細(xì)胞結(jié)合于Hps 90和生存素之間，占據(jù)ATP結(jié)合位點(diǎn)，松動(dòng)client蛋白，啟動(dòng)凋亡途徑和非凋亡途徑致腫瘤細(xì)胞大量死亡;此外，shepherdin不會(huì)影響正常細(xì)胞活力和造血祖細(xì)胞的克隆形成能力。最近有研究報(bào)道，17-AAG能抑制與生存素負(fù)相關(guān)的26s蛋白酶體活性，反而使腫瘤細(xì)胞生存素的過(guò)表達(dá)，所以通過(guò)Hps90來(lái)抑制生存素表達(dá)還有待進(jìn)一步探索［15］。

4.3.3 YM155 YM155可以誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞生存素表達(dá)的下調(diào)，有濃度-時(shí)間依賴性，能增加實(shí)體瘤對(duì)放療的敏感性。YM155具有更強(qiáng)的抗腫瘤活性，是因?yàn)閅M155用藥后在腫瘤組織中的濃度比血漿中明顯高，已進(jìn)入臨床實(shí)體瘤的試驗(yàn)治療階段［16］。

4.3.4 其他小分子抑制劑 研究證明其他小分子抑制劑也能間接抑制生存素的表達(dá)，包括信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)子與轉(zhuǎn)錄活化子3(signal transducer and activator of transcription 3，STAT3)和T-cell factor的拮抗劑可以抑制生存素的轉(zhuǎn)錄，Erb B2的拮抗劑拉帕替尼(lapatinib)通過(guò)加速泛素-蛋白酶體介導(dǎo)的蛋白質(zhì)降解抑制生存素表達(dá)。

4.4 靶向生存素的RNA干涉 RNA干涉(RNA interferencing，RNAi)能使生存素基因沉默，具有高度的特異性、穩(wěn)定性、穿透性。SHEN等［17］通過(guò)構(gòu)建干擾生存素的小發(fā)夾RNA(short hairpin RNA，shRNA)的表達(dá)質(zhì)粒，并轉(zhuǎn)染生存素高表達(dá)的胰腺癌細(xì)胞Patu8988。結(jié)果證明，生存素mRNA和蛋白均明顯下降，并抑制Patu8988細(xì)胞增殖。質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細(xì)胞的能力有限，YAN等［18］構(gòu)建腺病毒表達(dá)載體的小干擾RNA(small interfering RNA，siRNA)，轉(zhuǎn)染肝癌細(xì)胞HepG2后，生存素mRNA與蛋白表達(dá)下降率分別為72.34%和66.32%，說(shuō)明構(gòu)建腺病毒表達(dá)siRNA的表達(dá)系統(tǒng)有利于基因功能的基礎(chǔ)研究和臨床腫瘤治療。靶向生存素的siRNA不僅能下調(diào)生存素的表達(dá)，還能增加腫瘤細(xì)胞對(duì)化療的敏感性，通過(guò)抑制肺抗性相關(guān)蛋白(lung resistance related protein，LRP)逆轉(zhuǎn)腫瘤耐藥［19］。

4.5 免疫治療 近年發(fā)現(xiàn)生存素在腫瘤免疫治療中同樣起著重要作用，能使被之修飾的樹(shù)突狀細(xì)胞等免疫細(xì)胞具有腫瘤組織靶向性。從生存素蛋白中分離出的人類白細(xì)胞抗原復(fù)合物A2亞型(HLA-A2)結(jié)合肽具有誘導(dǎo)腫瘤患者特異性T細(xì)胞免疫的功能。生存素誘導(dǎo)的CTL細(xì)胞能特異性殺傷表達(dá)陽(yáng)性的腫瘤細(xì)胞，使其成為T(mén)細(xì)胞免疫的靶點(diǎn)，為腫瘤的免疫治療提供了新策略［20］。

4.6 其他 生存素在細(xì)胞有絲分裂初期與紡錘體微管蛋白特異性結(jié)合，從而干擾和微管蛋白的反應(yīng)，導(dǎo)致細(xì)胞凋亡，抗微管藥物如長(zhǎng)春新堿也可間接抑制生存素。

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