王 菁， 張 園， 袁 媛， 陳光英*

（1.海南師范大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院,海南 海口 571158；

2.海南師范大學(xué)熱帶藥用植物化學(xué)省部共建重點實驗室,海南 ?？?571158）

5種海南島藥用植物抗腫瘤活性部位的篩選

王 菁1，2， 張 園1，2， 袁 媛2， 陳光英2*

（1.海南師范大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院,海南 ?？?571158；

2.海南師范大學(xué)熱帶藥用植物化學(xué)省部共建重點實驗室,海南 ?？?571158）

篩選豬屎豆、蔞葉、喜光花、廣南天料木和紅花天料木等5種藥用植物的抗腫瘤有效部位.采用MTT法測試了該5種藥用植物不同溶劑萃取物對四種癌細(xì)胞的體外抑制活性.證明了該5種藥用植物的部分提取物對4種腫瘤細(xì)胞增殖有較強的抑制作用，量-效關(guān)系明顯.

藥用植物；活性部位；抗腫瘤作用；MTT法

癌癥仍然是困擾全人類的最大難題之一，隨著癌癥發(fā)病率的升高，越來越多的學(xué)者們致力于癌癥藥物的尋找，而藥用植物作為純天然藥物，成為學(xué)者們研究的熱點[1].Cheong等發(fā)現(xiàn)金蕎麥提取物能抑制肝癌細(xì)胞生長[2]，Joseph在藤黃毛竹中分離出一種化合物具有抗HIV活性[3]，Monika等人發(fā)現(xiàn)長葉暗羅的乙醇浸提物可以抑制人HL-60細(xì)胞的增長[4].本文研究的5種海南植物長期被海南黎族地區(qū)用作藥物治療各種疾病.該5種植物均為海南特有物種，其中蔞葉（Piper betleL1）、紅花天料木（Homalium hainanensis）和廣南天料木（Homalium paniculiflorum）的抗腫瘤活性為本文首次報道.試驗以豬屎豆（Crotalaria mucronata Desv）的4種不同的溶劑（石油醚、氯仿、乙酸乙酯、正丁醇）萃取物，豬屎豆的葉、果、莖的乙醚提取物，蔞葉的3種不同的溶劑（石油醚、氯仿、水）提取物，喜光花（Actephi?la merrilliana）的4種不同的溶劑（石油醚、氯仿、乙酸乙酯、正丁醇）提取物，紅花天料木和廣南天料木的3種不同的溶劑（石油醚、乙酸乙酯、正丁醇）提取物，對四種腫瘤細(xì)胞的體外增殖抑制作用進行篩選，確定有效部位，測定有效部位的半數(shù)抑制率（IC50），為進一步研究該幾種植物的抗腫瘤作用提供基礎(chǔ)實驗數(shù)據(jù).

1 實驗部分

1.1 儀器

高壓滅菌鍋（日本森展企業(yè)有限公司）；倒置顯微鏡（重慶光學(xué)儀器廠）；ELx800酶標(biāo)儀（BioTek公司）；CO2恒溫培養(yǎng)箱（日本SANYO公司）；超凈工作臺（蘇州凈化設(shè)備廠）；可調(diào)式移液器（BRAND公司）；96孔細(xì)胞培養(yǎng)板（Pore公司）；TB-215D電子天平（Sartious公司）.

1.2 試藥

RPMI1640培養(yǎng)液（Gibco公司），胰酶（Gibco公司）；四甲基偶氮唑藍(lán)（MTT）（Sigma公司），超級新生牛血清（杭州四季青生物科技有限公司），二甲基亞砜（DMSO）（天津市化學(xué)試劑二廠）.

1.3 材料

豬屎豆、蔞葉、喜光花、廣南天料木和紅花天料木均采自海南，由海南師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院鐘瓊芯副教授進行鑒定，其標(biāo)本保藏于海南省熱帶藥用植物化學(xué)重點實驗室.

1.4 細(xì)胞株

人肺腺癌細(xì)胞（SPCA-1）、人肝癌細(xì)胞（BEL-7402）、人胃癌細(xì)胞（SGC-7901）、人白血病細(xì)胞（K562），由南方醫(yī)科大學(xué)提供.細(xì)胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清、100 μg/mL青霉素、100 μg/mL鏈霉素、0.2%NaHCO3的RPMI1640培養(yǎng)液中，于37℃、5%CO2飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng).

1.5 供試樣品的制備

取豬屎豆粗粉25 kg，75%乙醇水浴回流12 h，合并濾液，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀回收溶劑，浸膏加水溶解，依次用石油醚、氯仿、乙酸乙酯、正丁醇萃取，將萃取物回收溶劑并制成凍干粉，即得粗提物.分別取豬屎豆的葉、果、莖粗粉500 g，用300 mL乙醚30℃索氏回流8 h，所得乙醚提取物為揮發(fā)油組分，儲存于4℃?zhèn)溆?取蔞葉粗粉500 g，75%乙醇水浴回流提取3次，每次3 h，合并濾液,旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀回收溶劑，浸膏加水溶解，依次用石油醚、氯仿萃取，將萃取物及萃取后剩余水層回收溶劑并制成凍干粉，分別得到氯仿、石油醚、水的提取物.取廣南天料木粗粉17 kg和紅花天料木粗粉200 g，加75%乙醇水浴回流3提取3 h，合并濾液,旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀回收溶劑，浸膏加水溶解，依次用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇萃取，將萃取物及萃取后剩余水層回收溶劑并制成凍干粉，即得粗提物.以上干膏均以50%DMSO為溶劑，精確配制成10 mg/mL供試樣儲備液，使用時用PBS（磷酸鹽緩沖液）稀釋，使藥液在96孔板中的濃度分別為100、10、1 μg/mL.

1.6 MTT比色法

人肺腺癌細(xì)胞（SPCA-1）、人肝癌細(xì)胞（BEL-7402）、人胃癌細(xì)胞（GSC-7901）和人白血病細(xì)胞（K562）分別以2×104個/ml、7×104個/ml、4×104個/mL和1×104個/mL接種于96孔板中.每孔體積180μL，在CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)8～12 h.待細(xì)胞貼壁后，加入不同濃度藥液20 μL.加藥細(xì)胞培養(yǎng)44h后，每孔加入MTT[5]溶液（1 mg/ml）50 μL，繼續(xù)在培養(yǎng)箱內(nèi)孵育4 h，取出傾去上清液，每孔加入150 μL DMSO，振蕩10 min后，使用酶聯(lián)免疫檢測儀于570 nm測定各孔光吸收值.同時設(shè)置空白組（僅加入不含細(xì)胞的培養(yǎng)液）和對照組（以培養(yǎng)液替代藥物），算細(xì)胞增殖抑制率[6].以抑制率大于50%為有效.

1.7 IC50的測定

根據(jù)MTT實驗初步篩選所得到的數(shù)據(jù)，選擇有細(xì)胞增殖抑制活性的樣品（濃度為100 μg/mL時抑制率＞50%）進一步測定其半數(shù)抑制率IC50.以同一樣品的濃度對數(shù)值作橫坐標(biāo)，以抑制率作縱坐標(biāo)，作回歸曲線，計算IC50.

1.8 數(shù)據(jù)處理

每份樣本平行測定5孔，全部數(shù)據(jù)用SPSS13.0統(tǒng)計軟件包進行統(tǒng)計分析.吸收值以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（X±s）表示，采用方差分析比較組間均數(shù)差異.

2 結(jié)果與分析

2.1 5種海南藥用植物的不同部位對人胃癌細(xì)胞（SGC-7901）的增殖抑制作用

豬屎豆的氯仿部位、喜光花的氯仿部位、喜光花的石油醚部位、廣南天料木石油醚部位對人胃癌細(xì)胞（SGC-7901）的增殖有較好的抑制作用，均成劑量依賴性，在高劑量組細(xì)胞增殖抑制率可以達到80%以上，IC50均小于20 μg/mL；蔞葉的石油醚部位、紅花天料木石油醚部位、紅花天料木的乙酸乙酯部位對人胃癌細(xì)胞（SGC-7901）顯示較弱的抑制作用.活性部位對胃癌細(xì)胞的抑制作用均成劑量依賴性，其余部位對人胃癌細(xì)胞（SGC-7901）的增殖抑制作用不明顯，見表1.

2.2 5種海南藥用植物的不同部位對人肺腺癌細(xì)胞（SPCA-1）的增殖抑制作用

喜光花的石油醚部位、廣南天料木的石油醚部位對人肺腺癌細(xì)胞（SPCA-1）的增殖有較好的抑制作用,在高劑量組細(xì)胞增殖抑制率可以達到80%以上，IC50均小于20 μg/mL.其中喜光花石油醚的IC50達到5.34 μg/mL.豬屎豆葉的乙醚部位、紅花天料木的石油醚部位對人肺腺癌細(xì)胞（SPCA-1）顯示較弱的抑制作用.活性部位對胃癌細(xì)胞的抑制作用均成劑量依賴性，其余部位對人肺腺癌細(xì)胞（SP?CA-1）的增殖抑制作用不明顯，見表2.

表15 種海南藥用植物的不同部位對SGC-7901細(xì)胞增殖的影響（X±s,n=5）Tab.1 Antiproliferative activity of different extracts from 5 kinds of herbs in Hainan on SGC-7901 cells（X±s,n=5）

表25 種海南藥用植物的不同部位對SPCA-1的增殖抑制作用（X±S,n=5）Tab.2 Antiproliferative activity of different extracts from 5 kinds of herbs in Hainan on SPCA-1 cells(X±s,n=5)

2.3 5種海南藥用植物的不同部位對人白血病細(xì)胞（K562）的增殖抑制作用

豬屎豆的石油醚部位、豬屎豆葉的乙醚部位對人白血病細(xì)胞（K562）的增殖有較好的抑制作用，在高劑量組細(xì)胞增殖抑制率可以達到80%以上，IC50均小于20 μg/mL，其中豬屎豆石油醚部位的IC50達到3.49 μg/mL，豬屎豆葉的乙醚部位的IC50達到8.01 μg/mL.豬屎豆的氯仿部位和果的乙醚部位、喜光花的石油醚和氯仿部位、紅花天料木的石油醚和乙酸乙酯部位對人白血病細(xì)胞（K562）顯示較弱的抑制作用.活性部位對胃癌細(xì)胞的抑制作用均成劑量依賴性，其余部位對人白血病細(xì)胞（K562）的增殖抑制作用不明顯，見表3.

2.4 5種海南藥用植物的不同部位對人肝癌細(xì)胞（BEL-7402）的增殖抑制作用

喜光花和廣南天料木的石油醚部位對人肝癌細(xì)胞（BEL-7402）的增殖有較好的抑制作用，在高劑量組細(xì)胞增殖抑制率可以達到80%以上.紅花天料木的石油醚部位對人肝癌細(xì)胞（BEL-7402）顯示較弱的抑制作用.活性部位對胃癌細(xì)胞的抑制作用均成劑量依賴性，其余部位對人肝癌細(xì)胞（BEL-7402）的增殖抑制作用不明顯，見表4.

表35 種海南藥用植物的不同部位對K562細(xì)胞增殖的影響（X±s,n=5）Tab.3 Antiproliferative activity of different extracts from 5 kinds of herbs in Hainan on K562 cells（X±s,n=5）

表45 種海南藥用植物的不同部位對BEL-7402的增殖抑制作用（X±S,n=5）Tab.4 Antiproliferative activity of different extracts from 5 kinds of herbs in Hainan on BEL-7402 cells(X±s,n=5)

3 討論

豬屎豆為豆科蝶形花亞科豬屎豆屬半灌木狀草本植物，藥用可補肝腎，明目，固精[7].蔞葉為胡椒科胡椒屬植物，具有祛風(fēng)散寒、行氣化痰、消腫止癢之功效[8].喜光花為大戟科喜光花屬植物，用于通便、利尿、治療水腫，結(jié)核、牛皮癬、疥瘡和無名腫毒，腸炎痢疾，尤其是除疣、抗腫瘤等[9].紅花天料木和廣南天料木是天料木科常綠大喬木，是原產(chǎn)于海南的熱帶珍貴用材樹種，被列為海南特類材，也是我國最珍貴的工業(yè)用材[10].用MTT法體外研究各活性部位對不同來源的腫瘤細(xì)胞株的作用，得到部分部位體外對腫瘤細(xì)胞增殖具有明顯抑制作用，說明這些部位為該5種海南藥用植物的有效作用部位.

該5種海南藥用植物長期被海南黎族地區(qū)用作治療藥物，雖有文獻報道從蔞葉中提取出木質(zhì)素[11]和生物堿[12]，但國內(nèi)外對該5種藥用植物的活性研究未見報道.為了開發(fā)出活性好、毒性低、來源廣泛的抗腫瘤藥物，藥用植物可能含有抗癌活性極佳的化合物，例如三萜類[13-15]、生物堿類[16-18]等.通過選用不同來源、不同生長特性的細(xì)胞株進行實驗，我們發(fā)現(xiàn)豬屎豆氯仿部位、喜光花的石油醚、氯仿部位和廣南天料木的石油醚部位對胃癌細(xì)胞株，喜光花和廣南天料木的石油醚部位對肺癌細(xì)胞株，豬屎豆的石油醚和葉乙醚部位對白血病細(xì)胞株，喜光花的石油醚部位對肝癌細(xì)胞株，在體外均有非常好的抑制作用，其IC50＜30 μg/mL，并且對腫瘤細(xì)胞毒性呈劑量依賴關(guān)系，最高抑制效應(yīng)均達到80%以上，符合被認(rèn)為有研究的價值的要求[19].文獻表明，腫瘤藥物敏感實驗的體外實驗結(jié)果與體內(nèi)化療療效總符合率高達85%[20].針對活性部位，探尋其中的物質(zhì)基礎(chǔ)，進一步進行活性成分分析，確定其有效物質(zhì)成分，并進行一些相關(guān)的抗癌機理研究，將是我們今后研究的重點.

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Antitumor Activities of Different Extracts from 5 Kinds of Medical Plants in Hainan

WANG Jing1，2，ZHANG Yuan1，2，YUAN Yuan2，CHEN Guangying2＊
（1.College of Life Science，Hainan Normal University，Haikou 571158，China；
2.Key Lab of Tropical Pharmaceutical Herb Chemistry of Hainan province，Haikou 571158，China）

The anti-tumor active extracts of 5 kinds of medicinal plants were screened,which are Crotalaria mucronata Desv,Piper betle L1,Actephila m errilliana,Homalium paniculiflorum and Homalium hainanensis.The MTT assay was used to test the antitumor activity of the different extracts of 5 kinds of medicinal plants against four kinds of cancer cells in vitro.Some of the extracts showed remarkable inhibitory activities against the four tumor cells,and expressed dose-ef?fect relationship obviously.

medicinal plants；active fractions；anti-tumor activity；MTT assay

R 730.52

A

1674-4942（2011）03-0301-06

2011-04-28

教育部新世紀(jì)優(yōu)秀人才支持計劃項目（NCET-08-0656）

*通訊作者

畢和平