崔艷，呂文，龐紅勛，劉金福

（1.天津農(nóng)學(xué)院 食品科學(xué)系，天津 300384；2.中法合營王朝葡萄釀酒有限公司，天津 300402）

葡萄酒是采用新鮮葡萄或葡萄汁經(jīng)完全或部分酒精發(fā)酵而得到的飲料。通過釀酒酵母（Saccharomsyces cerevisiae）的酒精發(fā)酵和自溶，產(chǎn)生了如甘油、醋酸、琥珀酸、丙酮酸、酯類物質(zhì)、蛋白質(zhì)和多糖類物質(zhì)，這些物質(zhì)的產(chǎn)生對葡萄酒的酒體、顏色、香氣和風(fēng)味，乃至葡萄酒整體質(zhì)量都具有重要的影響，因此具有優(yōu)良性狀酵母的選育非常重要。

隨著科技手段的提高和分子生物學(xué)研究的深入發(fā)展，葡萄酒釀酒酵母的選育已經(jīng)不再局限于只考慮釀酒酵母菌自身特點(diǎn)，人們的適飲性需求、釀造工藝、地域特點(diǎn),風(fēng)土環(huán)境對菌種的影響及其協(xié)同作用、以及基因工程菌的構(gòu)建也越來越多地成為近年來的研究熱點(diǎn)。另外本土化特色酵母菌的選育也越來越成為釀造風(fēng)格獨(dú)特的葡萄酒的熱點(diǎn)。本文就近年來國內(nèi)外葡萄釀酒酵母選育技術(shù)的進(jìn)展進(jìn)行綜述,為我國本土化酵母菌的實(shí)際應(yīng)用提供參考。

1 釀酒酵母菌研究的基礎(chǔ)和主要考慮因素

自1997年完成了釀酒酵母菌全基因組的序列測定后，科學(xué)家們相繼建立了釀酒酵母基因組數(shù)據(jù)庫和酵母蛋白質(zhì)組數(shù)據(jù)庫，其中容納了有關(guān)酵母菌的基因和其蛋白質(zhì)功能、結(jié)構(gòu)和相互間關(guān)系等大量信息，再加上近年來DNA微矩陣分析的發(fā)展，為原子和分子水平的酵母特性研究、優(yōu)良表型特征基因的鑒定和酵母菌的基因工程構(gòu)建打下了堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。

在葡萄酒用酵母菌的選育中，有兩類因素影響著研究的方向和出發(fā)點(diǎn)。一類是較復(fù)雜的影響葡萄酒質(zhì)量的因素，包括一類，二類香氣物質(zhì)和其他感官特性的因素，另一類是出于工藝考慮：如耐受性（例如糖，SO2，酒精含量、抗真菌素，低溫和高溫等）、嗜殺型、化學(xué)穩(wěn)定性、生長模式等工藝因素。表1和表2列出了當(dāng)前選育釀酒酵母的主要參考因素。

2 國內(nèi)外葡萄酒酵母選育和改良方法的進(jìn)展和利弊

從1960年開始，一些微生物育種方法產(chǎn)生并得到了發(fā)展和應(yīng)用，自然選育，誘變、雜交育種，原生質(zhì)體融合,基因工程育種都是當(dāng)前最普遍的育種手段，而且各有利弊，在菌種的選育時(shí)，一定要立足出發(fā)點(diǎn)，將不同的育種方法配合使用，才能夠真正篩選出優(yōu)良的酵母菌。

表1 酵母菌選育的主要參考工藝因素Table 1 The main technique factors in wine selection

表2 酵母菌選育的主要參考質(zhì)量因素Table 2 The main quality factors in wine yeast selection

2.1 自然選育

自然選育即不經(jīng)人工處理，利用微生物的自然突變進(jìn)行菌種選育的過程。自然突變被認(rèn)為是由多因素低劑量的誘變效應(yīng)引起的，這樣的突變可使野生的酵母菌天然具有某種較突出的特性。眾所周知，老世界葡萄酒產(chǎn)國通過野生酵母自然發(fā)酵的葡萄酒無論在復(fù)雜感、結(jié)構(gòu)、香氣、地域特色方面都是其他地區(qū)無法比擬的。經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)在它們的葡萄園中篩出的假絲酵母（Candida）、克勒克酵母（Kloeckera）、有孢漢遜酵母（Hanseniasporacan）可通過代謝和自溶提高葡萄酒的香氣，參與復(fù)雜新鮮的風(fēng)味物質(zhì)的形成[1]?，F(xiàn)在，許多國外的酵母生產(chǎn)廠家利用自然選育的方法生產(chǎn)純種的釀酒酵母產(chǎn)品，這類商用葡萄酒酵母已在許多新世界葡萄酒生產(chǎn)國（澳大利亞，美國，南非，智利、中國等）的大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)中被廣泛應(yīng)用。使用這類商用酵母優(yōu)點(diǎn)是易于管理，保障了發(fā)酵的順利進(jìn)行；缺點(diǎn)是使新世界的葡萄酒酒體較單調(diào)、缺乏個(gè)性和特點(diǎn)，相同或相近產(chǎn)區(qū)的葡萄酒風(fēng)味趨于同質(zhì)化。因此國外的科研人員近年來逐步開展了自然選育具有特殊功能酵母菌的研究，希望通過這類酵母菌的使用，彌補(bǔ)葡萄原料品質(zhì)的不足，或滿足特殊生產(chǎn)工藝的要求。例如有人從Parmesan干酪乳清中篩出的釀酒酵母具有降低葡萄酒中蘋果酸的作用，最高降幅可達(dá)50%[2]，這類酵母適用于冷涼產(chǎn)區(qū)酸度較高的葡萄原料的發(fā)酵，有利于降低葡萄酒過強(qiáng)的酸感。還有人從葡萄酒生產(chǎn)中篩出的酵母菌（Saccharomyces uvarum）在低溫下（6℃～10℃）具有較強(qiáng)的發(fā)酵力，可用來發(fā)酵冷藏的葡萄汁，其最主要的特點(diǎn)是能夠合成蘋果酸，可以改善炎熱產(chǎn)區(qū)葡萄原料酸度不夠的問題；同時(shí)它能產(chǎn)少量的醋酸和大量的甘油和琥珀酸,對于改善葡萄酒的香氣也有重要的影響[3]。有科學(xué)家已篩選出在發(fā)酵過程中不積累尿素的酵母，對降低葡萄酒中氨基甲酸乙酯含量具有積極的意義[4]。2009年在新西蘭Kumeu River葡萄酒廠發(fā)現(xiàn)了近100種獨(dú)特的酵母菌株，包含6種不同形態(tài)，之間并未雜交繁殖，且與商用菌株毫無關(guān)聯(lián)，這些酵母或許會成為揭示新西蘭葡萄酒風(fēng)味特性的有效工具[5]。

由于酵母菌株自發(fā)突變幾率很低，只靠從群體中篩選出個(gè)別有價(jià)值的優(yōu)良突變體的機(jī)會相對較少，因此從自然界直接篩選的野生酵母，較難具有葡萄酒所要求的復(fù)雜的理想特性，有時(shí)需進(jìn)一步的人工干預(yù)，才能達(dá)到目的。然而，近年來為了獲得安全的、具有地域風(fēng)格的菌株，很多的葡萄酒國家重新開始重視自然選育。

2.2 誘變育種

誘變育種即利用物理或化學(xué)的方法處理均勻分散的微生物群體，使其基因突變頻率大幅度提高，從中挑選少數(shù)符合目的的突變菌株以供使用的育種方法。國外科研人員對二次發(fā)酵香檳酒的釀酒酵母進(jìn)行誘變，通過改善其自溶特性縮短酵母多糖和甘露糖蛋白等物質(zhì)的溶出時(shí)間，可使瓶內(nèi)二次發(fā)酵香檳酒的瓶儲期縮短3～6個(gè)月，達(dá)到縮短陳釀期的目的[6]。還有人通過該法改善了釀酒酵母對氮源的利用方式，解除了氨基酸利用途徑的阻遏作用，同時(shí)提高了發(fā)酵速率，縮短了發(fā)酵時(shí)間[7]。我國的科研人員發(fā)現(xiàn)紅外CO2激光輻照誘變可使菌株產(chǎn)乙醇能力有較大的變化[8]，甲磺酸乙酯（EMS）誘變可篩出低產(chǎn)H2S和高產(chǎn)谷胱甘肽（GSH）的突變株[9]。

盡管誘變育種簡單易行，但研究發(fā)現(xiàn)酵母菌的基因結(jié)構(gòu)使得這種育種方法應(yīng)用起來有局限性，因?yàn)榇蟛糠值慕湍富蚨加?個(gè)以上的拷貝，因此選擇隱性突變是很困難的，而且長期使用誘變劑會導(dǎo)致菌種疲勞，遺傳很不穩(wěn)定。

2.3 雜交育種

雜交育種是利用酵母在營養(yǎng)缺乏時(shí)的有性繁殖、不同遺傳特性和相反交配型的細(xì)胞產(chǎn)生雙倍體等特點(diǎn)進(jìn)行育種的方法。雜交育種的目的一般是為了使菌種性狀滿足釀造工藝的特殊要求。比較典型的例子是國外運(yùn)用這種技術(shù)成功地將一個(gè)嗜殺酵母的單倍體和一個(gè)耐SO2的單倍體進(jìn)行雜交，所獲得的新酵母菌增強(qiáng)了耐SO2能力，提高了抵御雜菌污染的能力和發(fā)酵效率[10]。由于我國葡萄產(chǎn)區(qū)大多在采收季節(jié)前后降雨量較多，較高的環(huán)境濕度使葡萄易被有害微生物侵染，具有嗜殺特性和耐SO2能力的酵母對于葡萄質(zhì)量不佳的產(chǎn)區(qū)具有較好的發(fā)酵效果。國外在葡萄酒酵母雜交育種方面已做了許多科學(xué)研究，有人將篩自乳清的釀酒酵母與葡萄汁酵母雜交，其雜合子具有更強(qiáng)的降解蘋果酸能力和較低的產(chǎn)乙酸能力[11]，這項(xiàng)研究對選育紅葡萄酒酵母具有指導(dǎo)作用。有人將一種絮凝的酵母菌和一種不產(chǎn)H2S的酵母菌進(jìn)行了雜交用于起泡葡萄酒的發(fā)酵[12]，新菌種有利于發(fā)酵后排除酒泥、提高酒體澄清度，并能改善酒體香氣和口感。還有人成功地將耐寒的葡萄汁酵母菌和不耐寒的釀酒酵母進(jìn)行了雜交[13]，選育出的酵母菌可在5℃～10℃條件下具有較好的發(fā)酵能力，有利于果香型葡萄酒的釀造。我國在葡萄酒酵母雜交育種方面的研究還較少。

酵母菌雜交育種也存在一定局限性，主要是由于酵母菌的多倍體基因排列，使得自然界中能形成孢子的菌株出現(xiàn)幾率很小，還有一些特殊的酵母菌屬間雜交不會將結(jié)合子的理想特性傳遞給子代，另外，能夠被交換或傳遞到子代、結(jié)合子上的理想性狀特點(diǎn)也是有限的。

2.4 原生質(zhì)體融合

原和質(zhì)體融合是將2種不同菌株的原生質(zhì)體（球）置于高滲溶液中，在一定融合劑的促融作用下相互凝集并發(fā)生細(xì)胞之間的融合，進(jìn)而導(dǎo)致基因重組，獲得融合了親本優(yōu)良性能新菌株的育種方法，這種技術(shù)可以在屬內(nèi)和屬間進(jìn)行。國外曾報(bào)道過一些重要的工業(yè)用釀酒酵母菌就是自然界中屬間雜交的結(jié)果[14]。有人通過跨界融合釀酒酵母和葡萄汁酵母發(fā)現(xiàn)，融合子所產(chǎn)的葡萄酒中的副產(chǎn)物的含量大約是親本的一半，因?yàn)樵撚H本具有過高的產(chǎn)酸、產(chǎn)甘油以及產(chǎn)苯乙醇的能力[13]。國內(nèi)有人對釀酒酵母與酒類酒球菌（Oenos.oeni）進(jìn)行了跨界融合，發(fā)現(xiàn)融合子質(zhì)粒DNA中存在蘋果酸-乳酸酶基因MleP和蘋果酸-乳酸透性酶基因MleP，從而實(shí)現(xiàn)了葡萄酒降酸[15]。國內(nèi)還有研究將葡萄酒酵母與裂殖酵母進(jìn)行融合，選育出能夠一步降解蘋果酸的酵母[16]；以及利用單滅活原生質(zhì)體融合技術(shù)選育出降酸能力強(qiáng)的酵母菌株[17]。

此技術(shù)具有雜交頻率較高、受接合型限制較小、遺傳物質(zhì)完整等優(yōu)點(diǎn)，但是，由于所獲得的融合子其遺傳穩(wěn)定性較差，通常理想特點(diǎn)的表達(dá)是偶然的。再加上缺乏遺傳標(biāo)記，用做工業(yè)菌種還是有一定的障礙。

2.5 基因工程育種

上述的酵母改良技術(shù)都是隨機(jī)地改變菌種特性，缺乏特異性和準(zhǔn)確性?；蚬こ逃N克服了這一缺點(diǎn)，把理想的外源DNA片段克隆或插入到葡萄酒釀酒酵母菌基因的特定位置中，實(shí)現(xiàn)DNA重組，使其得到表達(dá)，并穩(wěn)定遺傳而不改變受體原有特性。

在研究中發(fā)現(xiàn)，當(dāng)一個(gè)或者幾個(gè)已知基因編碼優(yōu)良特征時(shí)，基因工程菌的構(gòu)建是容易且可行的。有人構(gòu)建了具有果膠降解、葡聚糖降解和木聚糖降解能力的釀酒酵母，使葡萄酒澄清變得容易[18]。有人通過構(gòu)建能充分表達(dá)甘油磷酸脫氫酶基因的高產(chǎn)甘油酵母菌，釀造出了低醇兼有圓潤酒體香的葡萄酒[19]。由于釀酒酵母中沒有蘋果酸乳酸途徑，又缺乏蘋果酸運(yùn)輸系統(tǒng)，因此有人將乳酸乳球菌（Lactococcus lactis）中的蘋乳酶基因和粟酒裂殖酵母 （Schizosaccharomyces pombe）中的蘋果酸透性酶基因轉(zhuǎn)入釀酒酵母而成功降酸，解決了冷涼產(chǎn)區(qū)葡萄酒生物降酸的難題[20-21]。有人發(fā)現(xiàn)在單倍體和二倍體階段進(jìn)行基因處理，可在自溶程度、酒精耐受性和工藝可行性方面明顯提高起泡葡萄酒的質(zhì)量[22]。有人利用氮代謝的調(diào)節(jié)機(jī)制，構(gòu)建了促進(jìn)尿素酰氨分解酶表達(dá)的基因工程菌，有效降低了酒中尿素的含量，從而大幅降低了葡萄酒中氨基甲酸乙酯的濃度[23]。還有人描述了通過構(gòu)建KNR4基因敲除酵母菌，細(xì)胞壁的結(jié)構(gòu)和成分得以改變，增加了葡萄酒中甘露糖蛋白的表達(dá)，還有效防止了葡萄酒蛋白質(zhì)渾濁[24]。

然而例如發(fā)酵力，產(chǎn)酒精能力，耐受性和培養(yǎng)溫度等工藝特征因素并不是由單一的或少數(shù)幾個(gè)基因控制的，決定這些特性的基因往往廣泛分布于整個(gè)酵母菌基因組中，有科學(xué)家已推測出決定酒精耐受性的基因多于250個(gè)，而這些位點(diǎn)通常是我們了解很少又分布很廣的。盡管近幾年微衛(wèi)星和單核苷酸多態(tài)性方法成功地用于繪制基因譜圖,但是像這樣特征復(fù)雜的基因識別仍然是當(dāng)前遺傳學(xué)的一個(gè)挑戰(zhàn)。因此僅利用基因工程菌的構(gòu)建仍然不能解決這些因素帶來的問題。

近年來一項(xiàng)不改變單個(gè)基因，而是隨機(jī)地改變整個(gè)基因組的基因組改組（Genome shuffling）技術(shù)引起了研究人員極大的興趣，它在誘變基礎(chǔ)上通過細(xì)胞融合技術(shù)，對誘變后的細(xì)胞進(jìn)行重組，從而使正向突變菌株的優(yōu)點(diǎn)結(jié)合在一起。它能將多重親本的優(yōu)良性狀在體外整合到一個(gè)子代身上，快速地完成優(yōu)良性狀的重組和選育，被稱為遞推式多次融合。但是由于缺乏有效的識別復(fù)雜表型的方法，和將具有理想特征的子代從龐大的重組菌種庫中有效分離出來的方法，這一技術(shù)還沒有在葡萄酒酵母中獲得應(yīng)用，如果這一瓶頸得以攻克，該技術(shù)將成為酵母選育的一個(gè)重要的里程碑，且基于其自然選育的原則，產(chǎn)生的后代將不會冠以“轉(zhuǎn)基因菌”的頭銜，因此將有很大的發(fā)展前景。

3 對我國葡萄酒酵母發(fā)展的展望

我國葡萄酒年產(chǎn)量在2009年已經(jīng)達(dá)到93萬t，躋身世界葡萄酒生產(chǎn)國十強(qiáng)，但我國在葡萄酒釀酒酵母研究方面與國外相比還處于起步階段，葡萄酒行業(yè)的生產(chǎn)還以購買使用國外商用酵母為主。由于我國釀酒葡萄產(chǎn)區(qū)分布廣泛，土壤氣候條件存在具有較大差異，因此不同產(chǎn)區(qū)的葡萄原料在品種、品質(zhì)、特征等方面存在較大的差異。如何根據(jù)不同產(chǎn)區(qū)葡萄品種的特點(diǎn)，選育適合發(fā)揮我國本土原料優(yōu)勢特性的釀酒酵母，是從事葡萄酒科研工作者需要面對的問題。例如通過適宜的菌種選育，在我國東部產(chǎn)區(qū)推廣釀造口感柔和細(xì)膩的新鮮果香型葡萄酒、在我國中西部產(chǎn)區(qū)推廣釀造口感濃郁醇厚的陳釀型葡萄酒是我國葡萄酒行業(yè)未來發(fā)展的一個(gè)基本方向。

從技術(shù)角度來講，釀酒酵母作為一個(gè)實(shí)驗(yàn)室真菌模型，其生理生化、基因和分子生物學(xué)特性已經(jīng)為大家所熟知，但實(shí)驗(yàn)室菌種和工業(yè)菌種在遺傳和生理方面仍然有很大不同，還需進(jìn)一步研究。無論是理性的DNA重組技術(shù)還是隨機(jī)的誘變或者雜交融合等技術(shù)，都有優(yōu)缺點(diǎn)，都會遇到困難，我們應(yīng)該按照選育出發(fā)點(diǎn)的不同，揚(yáng)長避短，各種技術(shù)互為補(bǔ)充、配合使用，努力培育出具有我國產(chǎn)區(qū)特色的本土葡萄酒酵母，為提高我國葡萄酒的整體質(zhì)量，推動(dòng)我國的葡萄酒產(chǎn)業(yè)的穩(wěn)步健康發(fā)展提供可靠的技術(shù)支持。

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