黃來(lái)珍，謝偉彬，邵海艷

（廣東海洋大學(xué) 食品科技學(xué)院，廣東 湛江 524025）

大豆分離蛋白是從大豆脫脂后的低變性脫脂豆粕中提取的蛋白質(zhì)質(zhì)量90%以上（以干基計(jì)）的蛋白質(zhì)類食品添加劑[1]，其中有人體必需的8種氨基酸，而且這些氮基酸的組合比較均衡，與動(dòng)物蛋白近似，易于被人體吸收利用，屬于全價(jià)蛋白。作為一種理想優(yōu)質(zhì)的植物蛋白來(lái)源，大豆蛋白近年來(lái)以其應(yīng)用范圍廣泛而越來(lái)越多受到人們關(guān)注。如在面制品[2]、肉制品[3]、乳制品[4]和飲料制品[5]等多個(gè)食品加工領(lǐng)域均受到研究者重視并顯示出優(yōu)越的理化特性。

本文采用堿提酸沉法進(jìn)行豆粕中大豆分離蛋白的提取，通過(guò)實(shí)驗(yàn)確定提取分離蛋白的最佳工藝參數(shù)并對(duì)提取蛋白的理化特性進(jìn)行分析，以期為脫脂豆粕的進(jìn)一步開發(fā)和應(yīng)用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

豆粕：湛江富虹油品有限公司提供。

1.2 主要儀器

PHS-25C pH計(jì)：上?？祪x儀器有限公司；DK-98-I型電熱恒溫水浴鍋：天津市泰斯特儀器有限公司；JD-2型磁力攪拌器：常州國(guó)華電器有限公司；Uv-2102pc型紫外可見分光光度計(jì)：尤尼柯（上海）儀器有限公司；GL-10LMD高速冷凍離心機(jī)：湖南星科科學(xué)儀器有限公司；101A-2數(shù)顯電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱：上海浦東躍欣科學(xué)儀器廠。

1.3 主要試劑

牛血清白蛋白：國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；硫酸銅、硫酸鉀、氫氧化鈉、鹽酸等試劑均為分析純。

1.4 方法

1.4.1 豆粕分離蛋白的制取及得率計(jì)算

將一定量的大豆餅粕與水按一定比例（料液比）混合，用NaOH調(diào)所需pH，在一定溫度下水浴加熱一定時(shí)間后離心，將離心后的上清液水浴加熱到一定溫度，用鹽酸調(diào)至所需pH，沉淀，離心分離，收集沉淀物，冷凍干燥，得到成品豆粕分離蛋白粉，并計(jì)算蛋白質(zhì)得率。

1.4.2 溫度對(duì)蛋白質(zhì)得率的影響

料液比為1∶10，浸提時(shí)間為60 min，pH為8.5，分別在40、50、60、70、80℃溫度下，按1.4.1的制取方法，提取豆粕分離蛋白，并計(jì)算蛋白質(zhì)得率。

1.4.3 料液比對(duì)蛋白質(zhì)得率的影響

浸提溫度為50℃，浸提時(shí)間為60 min，pH為8.5，在料液比分別為1∶5、1∶10、1∶15、1∶20、1∶25的條件下，按1.4.1的制取方法，提取豆粕分離蛋白，并計(jì)算蛋白質(zhì)得率。

1.4.4 提取時(shí)間對(duì)蛋白質(zhì)得率的影響

料液比為1∶10，浸提溫度為50 ℃，pH為8.5，提取時(shí)間分別為30、60、90、120、150 min的條件下，按1.4.1的制取方法，提取豆粕分離蛋白，并計(jì)算蛋白質(zhì)得率。

1.4.5 提取pH對(duì)蛋白質(zhì)得率的影響

料液比為1∶10，浸提溫度為50℃，時(shí)間為60 min，在pH分別為7.5、8.0、8.5、9.0、9.5的條件下，按1.4.1的制取方法，提取豆粕分離蛋白，并計(jì)算蛋白質(zhì)得率。

1.4.6 豆粕分離蛋白的功能分析

1.4.6.1 溶解度測(cè)定[6]

0.5 g樣品溶于30 mL去離子水中，0.5 mol/L HCl或0.5 mol/L NaOH調(diào)pH7.0，定容至50 mL，攪拌30 min，在轉(zhuǎn)速3000 r/min下離心20 min，溶解度S用半微量凱氏定氮法測(cè)定。

1.4.6.2 乳化性及乳化穩(wěn)定性的測(cè)定[7]

用pH為7.0，濃度為0.01 mol/L的磷酸鹽緩沖液,配制成質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.5%的蛋白溶液,取10 mL色拉油與20 mL蛋白液混合,均質(zhì)或電動(dòng)攪拌器攪拌1 min,用移液槍取10 μL,稀釋于10 mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.1%的SDS緩沖溶液（十二烷基磺酸鈉）中,立即測(cè)定500 nm下的吸光值（分光光度計(jì)）。

式中：ESI為乳化活力指數(shù)，每克蛋白質(zhì)的乳化面積，m2／g蛋白；ε為在500 nm 波長(zhǎng)下測(cè)得吸光值；Φ為油相所占的分?jǐn)?shù)，1/3；c為蛋白質(zhì)的質(zhì)量分?jǐn)?shù)，0.5%；L為比色池的厚度，10 mm。

上述乳液在溫度80℃中水浴加熱30 min，冷卻。

按上述方法再測(cè)定乳化活力指數(shù)ESI80，按下式計(jì)算乳化穩(wěn)定性。

式中：EA為乳化穩(wěn)定性；ESI為乳化活力指數(shù)；ESI80為80℃下的乳化活力指數(shù)。

1.4.6.3 起泡性的測(cè)定[8]

在室溫下，將大豆分離蛋白溶于pH為7.0的磷酸鹽緩沖液配成體積分?jǐn)?shù)為3%的溶液100 mL，在轉(zhuǎn)速10000 r/min下均質(zhì)1 min，測(cè)定泡沫體積。

起泡度=（V-100）/100×100%

式中：V為攪拌停止時(shí)泡沫的總體積，mL。

2 結(jié)果與分析

2.1 大豆餅粕提取分離蛋白單因素試驗(yàn)

2.1.1 溫度對(duì)蛋白質(zhì)得率的影響

不同溫度對(duì)蛋白質(zhì)得率的影響見圖1。

圖1 溫度對(duì)蛋白質(zhì)得率的影響Fig.1 The effect of temperature on the extraction rate of protein

由圖1可知，溫度的高低對(duì)大豆蛋白的溶解度有較大的影響。隨著溫度的升高，蛋白質(zhì)得率增大,但溫度過(guò)高會(huì)引起蛋白質(zhì)變性[9]。因此本試驗(yàn)溫度為50℃最佳。

2.1.2 料液比對(duì)蛋白質(zhì)得率影響

不同料液比對(duì)蛋白質(zhì)得率的影響見圖2。

由圖2可知，在選定的范圍內(nèi)，隨著料液比的增大，蛋白質(zhì)得率相應(yīng)增高，這是因?yàn)榱弦罕鹊脑黾幽芴岣叩鞍椎娜芙?，減少殘?jiān)鼛ё叩牡鞍讚p失。但是，料液比的增加給后續(xù)分離工藝造成負(fù)擔(dān)，且污水量也隨著料液比的增加而增多，所以控制料液比非常重要，在此初步選擇料液比為1∶20。

2.1.3 提取時(shí)間對(duì)蛋白質(zhì)提取率影響

不同提取時(shí)間對(duì)蛋白質(zhì)得率的影響見圖3。

圖3 時(shí)間對(duì)蛋白質(zhì)得率影響Fig.3 The effect of time on the extraction rate of protein

由圖3可知，在30 min～150 min之間隨著時(shí)間的升高，蛋白質(zhì)提取率也相應(yīng)不斷增高，在60 min后隨時(shí)間的升高蛋白質(zhì)的提取率升高緩慢。另外，在較高的pH或較高溫度下提取蛋白質(zhì)，延長(zhǎng)浸提時(shí)間會(huì)使大豆蛋白的水解程度加深。從實(shí)驗(yàn)情況來(lái)看，浸提時(shí)間以60 min左右為宜，因此選60 min為最佳浸提時(shí)間。

2.1.4 pH對(duì)蛋白質(zhì)提取率影響

不同溫度對(duì)蛋白質(zhì)得率的影響見圖4。

圖4 pH對(duì)蛋白質(zhì)得率影響Fig.4 The effect of pH on the extraction rate of protein

由圖4中可知，在溫度50℃，料液比1∶20，提取時(shí)間60 min的條件下，在pH小于8.5時(shí)，蛋白得率隨pH的增大而增加，且增加幅度明顯。當(dāng)pH超過(guò)8.5時(shí)，蛋白質(zhì)溶出量的增加趨于緩慢，pH超過(guò)9.0時(shí)，蛋白質(zhì)得率有下降趨勢(shì)。另外，在強(qiáng)堿條件下大豆蛋白易發(fā)生朧賴反應(yīng)，氨基酸轉(zhuǎn)化成了有毒化合物[9]，因此，如果在提取液的pH為8.5的條件下提升浸提溫度，不僅可以避免出現(xiàn)因溫度升高而造成的蛋白質(zhì)酸敗現(xiàn)象，而且可以進(jìn)一步提高蛋白質(zhì)的得率。

2.2 提取工藝優(yōu)化

根據(jù)大豆餅粕提取工藝單因素試驗(yàn)結(jié)果，以溫度（40、50、60 ℃）、時(shí)間（30、60、90 min）、料液比（1∶15、1∶20、1∶25）、（pH8.0、8.5、9.0）為參考因素和水平，按L9（34）正交表設(shè)計(jì)試驗(yàn)對(duì)提取工藝參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化。正交試驗(yàn)因素水平設(shè)計(jì)與試驗(yàn)結(jié)果與分析分別如表1、表2所示。

表1 正交試驗(yàn)因素水平表Table 1 Orthogonal table of factors and levels

表2 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果Table 2 Design and results of the orthogonal experiment

由表2可知，影響分離蛋白提取率的主次因素為A>B>D>C，即：溫度>時(shí)間>pH>料液比，得出最優(yōu)水平組合為A3B2D2C2，即溫度為50℃，提取時(shí)間為60 min，提取料液比為1∶20，提取pH為8.5。進(jìn)一步驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果表明該種組合的蛋白質(zhì)得率最高，達(dá)到84.2%。

2.3 產(chǎn)品功能特性

在最佳工藝條件下制得的大豆分離蛋白，在pH7.0下對(duì)其功能特性進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果見表3。

表3 大豆分離蛋白功能特性Table 3 The functional properties of soybean protein isolates

3 結(jié)論

1）利用“堿提酸沉”法提取大豆餅粕分離蛋白時(shí)，豆粕的浸取溫度、浸提時(shí)間、料液比和pH等都會(huì)影響到分離蛋白的提取效果。當(dāng)浸提溫度為60℃、浸提時(shí)間達(dá)到60 min、料液比為1∶20、pH為8.5時(shí)，蛋白質(zhì)的得率最高，達(dá)84.2%。

2）所得大豆餅粕分離蛋白（pH7.0）的溶解性為25.2%，乳化性為每克蛋白3.23m2，乳化穩(wěn)定性為27.0%，起泡性為55.2%。

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