樊 華，李漢忠，嚴(yán)維剛，石冰冰

中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院 北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院 北京協(xié)和醫(yī)院泌尿外科，北京100730

·論著·

促腎上腺皮質(zhì)激素受體檢測和腫瘤細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)觀察在腎上腺皮質(zhì)腫瘤亞型診斷中的應(yīng)用價(jià)值

樊 華，李漢忠，嚴(yán)維剛，石冰冰

中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院 北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院 北京協(xié)和醫(yī)院泌尿外科，北京100730

目的評估促腎上腺皮質(zhì)激素受體(ACTH-R)檢測和腫瘤細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)觀察在腎上腺皮質(zhì)腫瘤亞型診斷中的應(yīng)用價(jià)值。方法采用Polymer免疫組織化學(xué)染色方法檢測87例腎上腺皮質(zhì)腫瘤組織中的ACTH-R表達(dá)情況，并以10例正常腎上腺組織作為對照；電子顯微鏡觀察腫瘤細(xì)胞的超微結(jié)構(gòu)，比較超微結(jié)構(gòu)間的差異。結(jié)果sub-CPA組、CPA組、APA組、NFA組和NC組的ACTH-R陽性表達(dá)率分別為(80.1±8.2)%、(53.2±10.3)%、(63.2±10.1)%、(83.3±6.5)%和(70.1±7.3)%，其中，NFA組和sub-CPA組均明顯高于NC組(P=0.001，P=0.000)、APA組(P=0.000，P=0.000)及CPA組(P=0.000，P=0.000)，NC組明顯高于APA組(P=0.039)，APA組明顯高于CPA組(P=0.037)，NFA與sub-CPA組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.325)。透射電子顯微鏡觀察結(jié)果顯示，腎上腺皮質(zhì)腫瘤具有部分相似的超微結(jié)構(gòu)，但不同亞型腎上腺皮質(zhì)腫瘤細(xì)胞內(nèi)分泌顆粒的類型和數(shù)量存在差異。結(jié)論ACTH-R檢測和腫瘤細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)觀察可用于區(qū)分不同分泌功能的腎上腺皮質(zhì)腫瘤。

腎上腺皮質(zhì)腫瘤；亞型；促腎上腺皮質(zhì)激素受體；超微結(jié)構(gòu)

腎上腺皮質(zhì)腫瘤是常見的內(nèi)分泌腫瘤，典型的功能性皮質(zhì)腫瘤包括醛固酮分泌瘤(aldosterone-producing adenoma，APA)及皮質(zhì)醇分泌瘤(cortisol-producing adenoma，CPA)。目前主要依靠臨床表現(xiàn)及內(nèi)分泌檢查區(qū)分不同分泌功能的腎上腺皮質(zhì)腫瘤，而對于臨床中常見的意外瘤(adrenal incidentalomas，AIA)(主要包括亞臨床狀態(tài)腎上腺腫瘤及無功能腺瘤)的認(rèn)識尚有許多不足，明確診斷腎上腺皮質(zhì)腫瘤的亞型對治療及預(yù)后有重大意義。促腎上腺皮質(zhì)激素受體(adrenocorticotropin-receptor，ACTH-R)主要分布于腎上腺皮質(zhì)，可與促腎上腺皮質(zhì)激素(Adrenocorticotropin，ACTH)特異性結(jié)合，引發(fā)腎上腺皮質(zhì)激素分泌，在腎上腺分泌功能的發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮主要作用[1-2]。Latronico[3]研究發(fā)現(xiàn)，ACTH-R在不同類型腎上腺腫瘤中的表達(dá)有顯著差異，提示ACTH-R異常可能參與了腎上腺皮質(zhì)腫瘤中細(xì)胞的增殖和分化。目前腎上腺腫瘤常采用的病理診斷方法，主要傾向于鑒別腫瘤的良惡性[4-7]，對腎上腺皮質(zhì)腫瘤的亞型難以作出有效判斷。本研究評估了ACTH-R檢測和腫瘤細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)觀察在腎上腺皮質(zhì)腫瘤亞型診斷中的應(yīng)用價(jià)值。

材料和方法

標(biāo)本來源2008年3月至2010年7月在北京協(xié)和醫(yī)院就診的腎上腺腫瘤患者87例，包括：(1)腎上腺亞臨床皮質(zhì)醇分泌瘤(sub-Clinical Cortisol-producing adenoma，sub-CPA)24例，其中，男11例，女13例，平均年齡(33.4±4.2)歲(29～52歲)；診斷標(biāo)準(zhǔn)：臨床上無典型皮質(zhì)醇增多癥的表現(xiàn)，血皮質(zhì)醇和24 h尿游離皮質(zhì)醇水平輕度升高，小劑量地塞米松抑制實(shí)驗(yàn)不被抑制，CT顯示為腎上腺占位病變，術(shù)后病理證實(shí)為腎上腺皮質(zhì)腺瘤。(2)CPA 20例，其中，男11例，女9例，平均年齡(38.6±3.2)歲(31～49歲)；診斷標(biāo)準(zhǔn)：臨床上有皮質(zhì)醇增多癥的表現(xiàn)，血皮質(zhì)醇和24 h尿游離皮質(zhì)醇水平升高，大小劑量地塞米松抑制實(shí)驗(yàn)均不被抑制，CT顯示為腎上腺占位病變，術(shù)后病理證實(shí)為腎上腺皮質(zhì)腺瘤。(3)APA 20例，其中，男10例，女10例，平均年齡(37.6±4.3)歲(31～50歲)；診斷標(biāo)準(zhǔn)：臨床上有高血壓和/或低血鉀，高醛固酮、低腎素活性，正常皮質(zhì)醇水平，CT顯示為腎上腺占位病變，術(shù)后臨床表現(xiàn)好轉(zhuǎn)或消失，病理證實(shí)為腎上腺皮質(zhì)腺瘤。(4)腎上腺無功能腺瘤(adrenal nonfunctional adenoma，NFA)23例，其中，男13例，女10例，平均年齡(40.1±4.1)歲(28～60歲)；診斷標(biāo)準(zhǔn)：臨床上沒有皮質(zhì)醇及醛固酮增多癥表現(xiàn)，血皮質(zhì)醇和24 h尿游離皮質(zhì)醇水平正常，醛固酮、腎素活性均正常，CT顯示為腎上腺占位病變，術(shù)后病理證實(shí)為腎上腺皮質(zhì)腺瘤。2008年6月至2010年4月在北京協(xié)和醫(yī)院就診并行根治性腎切除的腎癌患者10例，其中，男5例，女5例，平均年齡(42.3±5.1)歲(35～66歲)，術(shù)后病理證實(shí)一并切除的腎上腺組織無轉(zhuǎn)移，收集其正常腎上腺組織(normal adrenal cortex，NC)作為對照。以上標(biāo)本離體后迅速切取1塊1 cm×1 cm×1 cm大小組織，用冷PBS沖洗3次以去除血跡后立即置于液氮凍存，用于ACTH-R檢測。同時(shí)取1塊1.0 mm×1.0 mm組織塊，冷PBS沖洗3次后置于2.5%戊二醇固定液，4℃凍存?zhèn)溆?，用于?xì)胞的超微結(jié)構(gòu)觀察。本研究經(jīng)北京協(xié)和醫(yī)院倫理委員會審查批準(zhǔn)，所有患者均簽署知情同意書。

ACTH-R檢測采用Polymer免疫組織化學(xué)方法，一抗ACTH-R為兔抗人多克隆抗體，效價(jià)為1∶40，產(chǎn)品編號SC-13107，購自美國Santa Cruz公司；超敏即用型二步法(非生物素)檢測試劑盒購自美國GBI公司，試劑盒組成包括：內(nèi)源性過氧化酶阻斷劑(試劑A)、聚合物輔助劑(Polymer Helper)、辣根酶標(biāo)記抗兔IgG多聚體(Poly Peroxidase-anti-Rabbit IgG)； 3, 3’-4鹽酸二氨基聯(lián)苯胺(3,3’-4 Diaminobenzidine ，DAB)顯色試劑盒購自瑞士Fluka公司。以PBS沖洗液替代一抗作陰性對照，具體操作過程參見試劑盒說明書。ACTH-R定位于細(xì)胞膜或胞漿, 陽性細(xì)胞胞膜或胞漿可出現(xiàn)黃色或棕褐色顆粒，對每例標(biāo)本的ACTH-R陽性表達(dá)進(jìn)行半定量分級，具體為10×30高倍鏡下隨機(jī)1～3個視野下觀察500個細(xì)胞，計(jì)算每100個細(xì)胞中的陽性細(xì)胞表達(dá)率。

細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)觀察采用JEM-1010透射電子顯微鏡(日本電子株式會社)觀察腫瘤細(xì)胞的超微結(jié)構(gòu)，主要試劑包括戊二醛固定液、餓酸固定液、檸檬酸鉛染色劑等。操作過程包括取材、固定、脫水、浸透、包埋、超薄切片、電子染色等。其中，超薄切片是把標(biāo)本切成厚度不超過0.1 μm的薄切片，是研究細(xì)胞、組織超微結(jié)構(gòu)的關(guān)鍵性技術(shù)，本研究采用LEICA EM UC6超薄切片機(jī)(德國萊卡公司)進(jìn)行操作，切片效果滿意。

統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用SPSS 14.0統(tǒng)計(jì)軟件，各組間陽性細(xì)胞表達(dá)率比較采用t檢驗(yàn)及方差分析，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

ACTH-R檢測結(jié)果sub-CPA組、CPA組、APA組、NFA組和NC組的ACTH-R陽性表達(dá)率分別為(80.1±8.2)%、(53.2±10.3)%、(63.2±10.1)%、(83.3±6.5)%和(70.1±7.3)%，其中，NFA組和sub-CPA組均明顯高于NC組(P=0.001，P=0.000)、APA組(P=0.000，P=0.000)及CPA組(P=0.000，P=0.000)，NC組明顯高于APA組(P=0.039)，APA組明顯高于CPA組(P=0.037)，NFA與sub-CPA組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.325)。

超微結(jié)構(gòu)觀察結(jié)果

正常腎上腺皮質(zhì)球狀帶：球狀帶約占皮質(zhì)的1/10，細(xì)胞較小，由3～5個細(xì)胞排列成腺泡狀小球，約3～4層。細(xì)胞呈多邊形或柱狀，核大，圓形；胞質(zhì)多，富有脂滴，脂滴的大小大致相仿；細(xì)胞內(nèi)線粒體相對較小，呈狹長桿狀或卵圓形，嵴呈板狀或管狀，基質(zhì)深暗；滑面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)少，常呈空泡狀，粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)罕見，Golgi復(fù)合體小，胞質(zhì)中有大量游離核糖體。相鄰細(xì)胞的間隙較大，常見細(xì)胞表面有少許微絨毛樣突起，伸入細(xì)胞間隙。球狀帶可見中等量鹽皮質(zhì)顆粒，糖皮質(zhì)顆粒罕見(圖1)。

圖1 正常腎上腺球狀帶見中等量鹽皮質(zhì)顆粒(箭頭)，糖皮質(zhì)顆粒罕見(箭)Fig1 Zona glomerulosa of normal adrenal cortex, with moderate mineralocorticoid(arrowhead) and rarely seen glucocorticoid granules (arrow)

正常腎上腺皮質(zhì)束狀帶：束狀帶約占皮質(zhì)的3/5，細(xì)胞排列成條索狀，在條索狀細(xì)胞之間是伴行的毛細(xì)血管，束狀帶細(xì)胞至少有一面與毛細(xì)血管相鄰。細(xì)胞較球狀帶細(xì)胞為大，也呈多邊形，細(xì)胞內(nèi)充滿大小不一的脂滴；線粒體多，球形，大部分的嵴呈空泡狀，基質(zhì)較透明；滑面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)豐富，大部分圍繞線粒體和脂滴排列，一般找不到粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，胞質(zhì)中有大量糖原粒和游離的核糖體，Golgi復(fù)合體中等大小，溶酶體數(shù)量少?？梢娚倭刻瞧べ|(zhì)顆粒(圖2)。

圖2 正常腎上腺束狀帶見少量糖皮質(zhì)顆粒(箭)Fig2 Fascicular zone of normal adrenal cortex, with a few glucocorticoid granules (arrow)

APA：細(xì)胞顯示分泌醛固酮的球狀帶細(xì)胞特征，大部分瘤細(xì)胞主要由致密的細(xì)胞組成，細(xì)胞表面微絨毛增多。瘤細(xì)胞核以常染色質(zhì)為主，核仁明顯，球形、球面形或長形線粒體，線粒體有長管泡狀嵴，堆狀平行排列的細(xì)長的滑面和粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)；線粒體豐富，高爾基復(fù)合體明顯，滑面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)少見，明顯的脂褐素顆粒，有時(shí)可見核內(nèi)假包涵體—螺內(nèi)脂小體?？梢姶罅靠张菪纬?，中等量的鹽皮質(zhì)顆粒，糖皮質(zhì)顆粒罕見(圖3)。

圖3 醛固酮分泌瘤見中等量鹽皮質(zhì)顆粒(箭頭)，糖皮質(zhì)顆粒罕見Fig3 Ultrastructural of aldosterone-producing adenoma, with moderate mineralocorticoid(arrowhead)and rarely seen glucocorticoid granules

CPA：大部分瘤細(xì)胞符合束狀帶細(xì)胞形態(tài)特征，主要由致密細(xì)胞組成。細(xì)胞表面微絨毛增多，胞質(zhì)豐富，內(nèi)含少量脂滴；線粒體呈圓形或卵圓形，管泡狀嵴；胞質(zhì)中可見發(fā)育良好的高爾基復(fù)合體和滑面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，細(xì)胞器密度較高，主要為泡狀滑面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和短股粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)。瘤細(xì)胞胞質(zhì)內(nèi)含大量脂滴，直徑1～2 μm，胞漿中可見中到大量糖皮質(zhì)顆粒(圖4)。

圖4 皮質(zhì)醇分泌瘤見大量糖皮質(zhì)顆粒(箭)Fig4 Ultrastructural of cortisol-producing adenoma, with a large number of glucocorticoid granules (arrow)

sub-CPA：部分瘤細(xì)胞符合束狀帶細(xì)胞形態(tài)特征，主要由致密的細(xì)胞組成。細(xì)胞表面微絨毛增多，胞質(zhì)豐富，內(nèi)含少量脂滴，胞質(zhì)中可見發(fā)育良好的高爾基復(fù)合體和滑面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，少量粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)；細(xì)胞器密度較高，但胞內(nèi)分泌顆粒少，偶見皮質(zhì)醇顆粒(圖5)。

NFA：細(xì)胞呈多邊形或柱狀，核大，圓形， 位于胞質(zhì)中央；胞質(zhì)多，富有脂滴，脂滴的大小大致相仿；線粒體相對較小，呈狹長桿狀或卵圓形；基質(zhì)深暗，滑面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)少，常呈空泡狀，粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)罕見，Golgi復(fù)合體小，胞質(zhì)中有大量游離核糖體。細(xì)胞內(nèi)分泌顆粒罕見(圖6)。

圖5 亞臨床皮質(zhì)醇分泌瘤偶見糖皮質(zhì)顆粒(箭)Fig5 Ultrastructural of sub-clinical cortisol-producing adenoma, with occasionally seen glucocorticoid granules(arrow)

圖6 無功能腺瘤鹽皮質(zhì)顆粒及糖皮質(zhì)顆粒罕見Fig6 Ultrastructural of adrenal nonfunctional adenoma, with rarely seen mineralocorticoid and glucocorticoid granules

討 論

ACTH-R屬于褪黑素受體超家族，與其他褪黑素受體家族成員不同的是，ACTH-R可與ACTH特異性結(jié)合，而且分布上有高度的組織特異性，主要分布于腎上腺皮質(zhì)[8]。ACTH-R的差異表達(dá)可能參與了腎上腺皮質(zhì)腫瘤中細(xì)胞的增殖和分化，影響腎上腺皮質(zhì)腫瘤的內(nèi)分泌功能。本研究采用Polymer免疫組織化學(xué)方法，將二抗抗體分子的單價(jià)Fab片段和酶聚合在一起，替代傳統(tǒng)方法中的二抗和三抗，直接放大抗原抗體結(jié)合的信號，可有效避免聚合分子過大而造成的空間位阻。與傳統(tǒng)的SP三步法相比，具有快速、簡單、陽性標(biāo)記強(qiáng)度強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)[9-10]。其中，獨(dú)特的Polymer Helper可以使細(xì)胞的通透性發(fā)生改變，有利于大分子檢測系統(tǒng)更好地結(jié)合所檢測的一抗分子，此檢測系統(tǒng)是目前已知的靈敏度最高的系列免疫組織化學(xué)檢測系統(tǒng)[11-12]。實(shí)驗(yàn)中使用的一抗ACTH-R為兔抗人多克隆抗體，經(jīng)預(yù)實(shí)驗(yàn)效價(jià)設(shè)定為1:40，但一抗孵育后需 4℃冰箱過夜，延長了實(shí)驗(yàn)時(shí)間，提示目前ACTH-R兔抗人多克隆抗體屬實(shí)驗(yàn)用試劑，如應(yīng)用于臨床需完善試劑相關(guān)設(shè)計(jì)。本研究涵蓋了腎上腺皮質(zhì)腫瘤中的常見類型，ACTH-R陽性表達(dá)率由低到高依次為CPA、APA、NC、sub-CPA及NFA。除NFA與sub-CPA組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義外，其余各組間差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，提示通過免疫組織化學(xué)染色法區(qū)分不同分泌功能腎上腺皮質(zhì)腫瘤具備一定的可行性。

Sub-CPA有自主分泌糖皮質(zhì)激素而沒有典型庫欣綜合征臨床表現(xiàn)的狀況，其在整體人群中的發(fā)病率約為78/10萬[13-15 ]。文獻(xiàn)報(bào)道sub-CPA發(fā)展到CPA的風(fēng)險(xiǎn)為12.5 %左右[16]。本研究中sub-CPA組ACTH-R陽性細(xì)胞表達(dá)數(shù)與CPA組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，接近NFA的ACTH-R陽性表達(dá)，提示sub-CPA應(yīng)被列為腎上腺皮質(zhì)腫瘤中的獨(dú)立類型，sub-CPA進(jìn)展為CPA的可能性較低，其機(jī)制尚待進(jìn)一步研究[17]，推測ACTH-R的差異表達(dá)可能是原因之一。

腎上腺皮質(zhì)腫瘤內(nèi)分泌顆粒的類型及數(shù)量差異決定腫瘤分泌功能的不同。有研究提示，腎上腺腫瘤分泌功能的發(fā)生可能與異位激素受體或激素的異位分泌等有關(guān)[18]。Ivsic等[19]研究發(fā)現(xiàn)，腎上腺皮質(zhì)腺瘤的瘤細(xì)胞內(nèi)可見神經(jīng)內(nèi)分泌顆粒。本研究結(jié)果顯示，正常腎上腺球狀帶可見中等量鹽皮質(zhì)顆粒，束狀帶可見少量糖皮質(zhì)顆粒，這些內(nèi)分泌顆粒自細(xì)胞分泌入血后產(chǎn)生相應(yīng)生理作用，維持機(jī)體內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定。本研究還發(fā)現(xiàn)，NFA具有典型腫瘤的電鏡結(jié)構(gòu)，具備細(xì)胞間連接及細(xì)胞表面特征，但細(xì)胞內(nèi)分泌顆粒罕見，沒有內(nèi)分泌功能，無法分泌腎上腺皮質(zhì)激素。APA細(xì)胞內(nèi)部密布鹽皮質(zhì)顆粒，提示其通過分泌大量鹽皮質(zhì)激素引起原發(fā)性醛固酮增多癥。CPA細(xì)胞內(nèi)部密布糖皮質(zhì)顆粒，提示其通過分泌大量糖皮質(zhì)激素引起庫欣綜合征[20]。Sub-CPA患者沒有明顯臨床癥狀，可能是由于此類患者的腎上腺皮質(zhì)細(xì)胞中用于合成糖皮質(zhì)激素的細(xì)胞器比較少，或是皮質(zhì)激素的生物合成酶活性較低，皮質(zhì)醇產(chǎn)量相對不足，以至于不能夠引起相應(yīng)的臨床癥狀[21]。本研究在觀察sub-CPA超微結(jié)構(gòu)時(shí)發(fā)現(xiàn)，sub-CPA細(xì)胞符合束狀帶細(xì)胞形態(tài)特征，但胞內(nèi)分泌顆粒少，偶見皮質(zhì)醇顆粒。而CPA細(xì)胞器較sub-CPA豐富，胞內(nèi)有大量皮質(zhì)醇顆粒，差異顯著，進(jìn)一步提示sub-CPA為腎上腺皮質(zhì)腫瘤中的獨(dú)立類型。

綜上，本研究結(jié)果顯示，不同分泌功能腎上腺皮質(zhì)腫瘤細(xì)胞中ACTH-R的表達(dá)及腫瘤超微結(jié)構(gòu)差異明顯，ACTH-R檢測和腫瘤細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)觀察可用于區(qū)分不同分泌功能的腎上腺皮質(zhì)腫瘤。

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ApplicationofAdrenocorticotropicHormoneReceptorDeterminationandUltrastructuralObservationofTumorCellsintheSubtypingofAdrenocorticalNeoplasms

FAN Hua, LI Han-zhong, YAN Wei-gang, SHI Bing-bing

Department of Urology, PUMC Hospital, CAMS and PUMC, Beijing 100730, China

LI Han-zhong Tel：010-65296035，E-mail：lihzhpumch@163.com

ObjectiveTo explore the values of adrenocorticotropic hormone receptor (ACTH-R) determination and ultrastructural observation of tumor cells in the subtyping of adrenocortical neoplasms (ANs).MethodsThe expression of ACTH-R in 87 AN tissues were determined with Polymer immunohistochemical staining, with 10 normal adrenal tissues as the controls. The ultrastructure of the tumor cells was observed using electron microscopy.ResultsThe positive expression rate of ACTH-R was(80.1±8.2)%, (53.2±10.3)%, (63.2±10.1)%,(83.3±6.5)%, and(70.1±7.3)% in the sub-CPA group, CPA group, APA group, NFA group, and NC group, respectively. ACTH-R expression was significantly higher in NFA and sub-CPA groups than in NC group (P=0.001，P=0.000), APA group (P=0.000，P=0.000), and CPA group (P=0.000，P=0.000), and was also significantly different between NC group and APA group (P=0.039) and between APA group and CPA group (P=0.037). However, no significant difference was found between NFA group and sub-CPA group (P=0.325). As shown by the electron microscopy, ANs had some partially similar microscopic features, while different AN subtypes showed differences in the type and amount of secretory granules.ConclusionACTH-R determination and ultrastructural observation of tumor cells may be helpful for subtyping ANs.

adrenocortical neoplasm; sub-type; adrenocorticotropin-receptor; ultrastructure

ActaAcadMedSin，2011，33(6)：679-684

李漢忠 電話：010-65296035，電子郵件：lihzhpumch@163.com

R446.8；R586.2

A

1000-503X(2011)06-0679-06

10.3881/j.issn.1000-503X.2011.06.019

中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)院科研基金(2009321)Supported by the Research Fund of CAMS and PUMCH(2009321)

2011-11-02)