王 芳，何 吉，朱發(fā)明，劉晉輝，秦 斐，陳 舒，徐 罡，呂行軍，嚴(yán)力行

浙江省血液中心 血液安全研究衛(wèi)生部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，杭州 310006

·論著·

應(yīng)用Solexa技術(shù)檢測(cè)臍血CD34+細(xì)胞體外誘導(dǎo)的巨核細(xì)胞mRNA表達(dá)

王 芳，何 吉，朱發(fā)明，劉晉輝，秦 斐，陳 舒，徐 罡，呂行軍，嚴(yán)力行

浙江省血液中心 血液安全研究衛(wèi)生部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，杭州 310006

目的應(yīng)用Solexa技術(shù)研究人臍帶血CD34+細(xì)胞體外誘導(dǎo)巨核細(xì)胞的mRNA表達(dá)。方法采用密度梯度離心法和免疫磁珠分選系統(tǒng)獲取人臍帶血CD34+細(xì)胞。100 ng/ml 促血小板生成素誘導(dǎo)培養(yǎng)12 d后，應(yīng)用抗CD41+單克隆抗體免疫磁珠法分選獲得巨核細(xì)胞和非巨核細(xì)胞。應(yīng)用Solexa技術(shù)檢測(cè)巨核細(xì)胞和非巨核細(xì)胞的mRNA表達(dá)差異。結(jié)果獲取的Tag初始數(shù)量巨核細(xì)胞和非巨核細(xì)胞分別為 3 773 147 和 3 533 805 個(gè)。整個(gè)清晰的Tag數(shù)量分別為 3 291 132和 2 967 947 個(gè)，明顯獨(dú)特的tag數(shù)量分別為 197 769 和 245 318 個(gè)。其中上調(diào)基因表達(dá)數(shù)量為1161個(gè)，下調(diào)為902個(gè)。上調(diào)Tag表達(dá)數(shù)量為2717個(gè)，下調(diào)為1519個(gè)。結(jié)論巨核細(xì)胞和非巨核細(xì)胞 mRNA表達(dá)存在顯著差異，差異基因編碼產(chǎn)物與細(xì)胞發(fā)育、黏附、凋亡、代謝、細(xì)胞內(nèi)及細(xì)胞間的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)以及免疫應(yīng)答等功能相關(guān)，進(jìn)一步深入將有助于探討巨核細(xì)胞的表達(dá)機(jī)制、信號(hào)傳導(dǎo)及調(diào)控機(jī)制。

巨核細(xì)胞；mRNA表達(dá)；體外擴(kuò)增；Solexa測(cè)序

造血干細(xì)胞分化成巨核細(xì)胞進(jìn)而產(chǎn)生血小板，涉及到巨核細(xì)胞系各期細(xì)胞的形成、血小板的入胞和出胞等，是一個(gè)復(fù)雜的過程，到目前為止其分子機(jī)制仍不明確。本研究采用人臍血干細(xì)胞體外促血小板生成素(thrombopoietin, TPO)誘導(dǎo)擴(kuò)增分化為巨核細(xì)胞，應(yīng)用Solexa測(cè)序技術(shù)檢測(cè)巨核細(xì)胞和非巨核細(xì)胞的mRNA表達(dá)差異，探討巨核細(xì)胞的表達(dá)機(jī)制、信號(hào)傳導(dǎo)及調(diào)控機(jī)制。

材料和方法

材料臍帶血由浙江大學(xué)附屬婦產(chǎn)醫(yī)院提供；IMEM培養(yǎng)基、RPMI 1640購(gòu)自美國(guó)Gibco公司； TPO、無(wú)血清培養(yǎng)基(Stem SpanTMSFEM)購(gòu)自加拿大Stem Cell公司；鼠抗人CD41a一抗購(gòu)自捷克Exbio公司；CD34細(xì)胞免疫磁珠分選試劑盒購(gòu)自德國(guó)美天尼公司；羊抗鼠IgG免疫磁珠購(gòu)自美國(guó)DYNAL公司；光學(xué)顯微鏡購(gòu)自Nikon公司；RNA抽提試劑盒(QIAamp RNA Blood Mini Kit)購(gòu)自德國(guó)Qiagen公司；Solexa測(cè)序及軟件分析由杭州華大基因研發(fā)中心提供。

CD34+細(xì)胞的體外分離、純化、擴(kuò)增培養(yǎng)和誘導(dǎo)分化臍帶血標(biāo)本與0.9%生理鹽水以1∶1充分混勻，形成單細(xì)胞懸液層加到比重為1.077 g/ml的淋巴細(xì)胞分離液上，離心收集中間的單個(gè)核細(xì)胞層，用RPMI 1640培養(yǎng)液離心洗滌2次。利用免疫磁珠分選系統(tǒng)，分選CD34+造血祖細(xì)胞。將富集的細(xì)胞用含100 ng/ml TPO無(wú)血清培養(yǎng)基混勻后，1×105/ml接種到培養(yǎng)瓶中，置37℃、5%飽和CO2濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12 d，第7天半量換液。

巨核細(xì)胞的免疫分離法將培養(yǎng)的細(xì)胞按1×106個(gè)細(xì)胞懸液中加入1 μg鼠抗人CD41a抗體，2～8℃孵育10 min，然后用含0.1%牛血清白蛋白的Buffer(pH 7.4)洗滌，300×g離心8 min，棄去上清，重新懸浮細(xì)胞。再加入羊抗鼠免疫磁珠(每1×107個(gè)細(xì)胞中25 μl)顛倒旋轉(zhuǎn)混勻后2～8℃孵育30 min，每10分鐘混勻1次。再將試管放置于磁鐵中2 min，收集上清中的非巨核細(xì)胞，取去磁鐵，用Buffer重懸細(xì)胞。重復(fù)操作3次。

總RNA提取采用RNA抽提試劑盒，嚴(yán)格按照試劑盒內(nèi)說明書操作。應(yīng)用Agilent 2100生物分析儀進(jìn)行總RNA的質(zhì)量檢驗(yàn)。

Solexa測(cè)序?qū)⒊樘岷玫腞NA用干冰送至華大基因研發(fā)中心進(jìn)行表達(dá)譜樣品制備、Solexa測(cè)序、信息分析。

RT-PCR驗(yàn)證將抽提的巨核細(xì)胞和非巨核細(xì)胞RNA進(jìn)行RT-PCR，選擇血小板反應(yīng)蛋白1(thrombospondin-1，THBS1)、同源異形盒基因A9(homeobox A9，HOXA9)進(jìn)行驗(yàn)證。THBS1終反應(yīng)體積10 μl，MgCl2終濃度1.5 mmol/L，引物終濃度為0.625 μmol/L，dNTP終濃度為200 μmol/L，Taq DNA聚合酶1.0 U。循環(huán)條件：95℃預(yù)變性5 min，95℃變性30 s，63℃退火1 min，72℃延伸30 s，30個(gè)循環(huán)，最后72℃延伸10 min。產(chǎn)物片斷為307 bp。HOXA9終反應(yīng)體積10 μl，MgCl2終濃度1.5 mmol/L，引物終濃度為0.625 μmol/L，dNTP終濃度為200 μmol/L, Taq DNA聚合酶1.0 U。循環(huán)條件：95℃預(yù)變性5 min，95℃變性30 s，60℃退火1 min，72℃延伸30 s，35個(gè)循環(huán)，最后72℃延伸10 min。產(chǎn)物片斷為264 bp。

結(jié) 果

總RNA提取結(jié)果巨核細(xì)胞RNA濃度為30 ng/μl；非巨核細(xì)胞RNA濃度為47 ng/μl，RNA純度合格，無(wú)降解。

Solexa技術(shù)檢測(cè)表達(dá)譜基本信息Solexa技術(shù)檢測(cè)MK和非MK細(xì)胞表達(dá)譜的基本情況顯示，獲取的Tag初始數(shù)量MK和非MK細(xì)胞分別為 3 773 147和 3 533 805 個(gè)，整個(gè)清晰的Tag數(shù)量分別為 3 291 132 和 2 967 947個(gè)，明顯獨(dú)特的Tag數(shù)量分別為 197 769 和 245 318 個(gè)，未知的Tag數(shù)量分別為4496和4204個(gè)，分別占清晰Tag的2.27%和1.71%。

基因在MK和非MK間表達(dá)的相關(guān)性基因在MK和非MK間表達(dá)存在一定的相關(guān)性，其中MK和非MK間基因的Spearman 等級(jí)相關(guān)系數(shù)為0.898，Pearson相關(guān)系數(shù)為0.6，根據(jù)散點(diǎn)分布的集中性和軸向性，可以判斷實(shí)驗(yàn)的重復(fù)性較好。

差異表達(dá)基因分析結(jié)果采用Solexa技術(shù)檢測(cè)，以假發(fā)現(xiàn)率≤0.001，探針的相對(duì)富集強(qiáng)度|log2Ratio|≥1作為判斷基因表達(dá)差異顯著的閾值。其中基因表達(dá)數(shù)量上調(diào)為1161個(gè)，下調(diào)數(shù)量為902個(gè)。Tag表達(dá)量上調(diào)為2717個(gè)，下調(diào)為1519個(gè)。差異基因功能分類主要有局部黏附、干細(xì)胞譜系、細(xì)胞外基質(zhì)-受體相互作用、DNA復(fù)制轉(zhuǎn)錄、凋亡、腫瘤發(fā)生、細(xì)胞周期發(fā)育、新陳代謝、白細(xì)胞跨膜遷移、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、細(xì)胞黏附分子、細(xì)胞骨架、免疫應(yīng)答13類。

RT-PCR驗(yàn)證結(jié)果THBS1在巨核細(xì)胞表達(dá)高于非巨核細(xì)胞，THBS1的相對(duì)富集強(qiáng)度 log2Ratio (MK/非MK)=2.645 997；HOXA9在巨核細(xì)胞表達(dá)低于非巨核細(xì)胞，HOXA9的相對(duì)富集強(qiáng)度 log2Ratio (MK/非MK)=-10.4315(圖1)。

討 論

Solexa技術(shù)是一種大規(guī)模高通量的測(cè)序分析技術(shù)[1-4]，它利用單分子陣列測(cè)序，此種測(cè)序法利用邊合成邊測(cè)序的原理，在每個(gè)循環(huán)過程里，將4種熒光標(biāo)記的核苷和聚合酶加入到單分子陣列中，利用生物發(fā)光蛋白，通過堿基加到引物后端時(shí)所釋放出的焦磷酸鹽來(lái)提供檢測(cè)信號(hào)，熒光信號(hào)被圖像傳感器采集，圖像傳感器快速掃描整個(gè)陣列檢測(cè)特定的結(jié)合到每個(gè)片斷上的堿基。通過上述的結(jié)合，檢測(cè)可以重復(fù)幾十個(gè)循環(huán)，這樣就有可能決定核苷酸片斷中的幾十個(gè)堿基。

Solexa表達(dá)譜分析技術(shù)是基于新一代測(cè)序技術(shù)的全基因組表達(dá)譜分析方法，該方法首先從每個(gè)mRNA的3’端酶切得到一段21bp的Tag片段(特異性標(biāo)記該基因),然后通過高通量測(cè)序，得到大量的Tag序列，不同的Tag序列的數(shù)量就代表了相應(yīng)基因的表達(dá)量；通過生物信息學(xué)分析得到Tag代表的基因、基因表達(dá)水平以及樣品間基因表達(dá)差異等信息[5-8]。與傳統(tǒng)的基因芯片技術(shù)比較，利用高通量測(cè)序進(jìn)行表達(dá)譜研究的優(yōu)勢(shì)很明顯，Solexa表達(dá)譜分析技術(shù)可直接測(cè)定每個(gè)基因的特異性表達(dá)標(biāo)簽序列，通過計(jì)數(shù)表達(dá)標(biāo)簽序列的數(shù)目來(lái)確定該基因的表達(dá)量，大大提高了定量分析的準(zhǔn)確度。整體表達(dá)差異分布符合正態(tài)分布，不會(huì)因?yàn)椴煌螌?shí)驗(yàn)引起不必要的誤差。Solexa表達(dá)譜分析技術(shù)可重復(fù)性高，不同批次的表達(dá)譜度量準(zhǔn)確，能夠更準(zhǔn)確地進(jìn)行表達(dá)差異分析；靈敏度高，對(duì)于表達(dá)差異不大的基因能夠靈敏的檢測(cè)其表達(dá)差異；性價(jià)比高；由于該技術(shù)不用事先設(shè)計(jì)探針，而是直接測(cè)序的方式，因此無(wú)需了解物種基因信息，可以直接對(duì)任何物種進(jìn)行包括未知基因在內(nèi)的全基因組表達(dá)譜分析，因此性價(jià)比很高。高通量測(cè)序，已有數(shù)據(jù)表明，當(dāng)測(cè)序通量達(dá)到200萬(wàn)個(gè)表達(dá)標(biāo)簽時(shí)，即可得到樣本中接近全部表達(dá)基因的表達(dá)量數(shù)據(jù)，而目前每個(gè)樣本分析可以得到300萬(wàn)～600萬(wàn)個(gè)表達(dá)標(biāo)簽，可同時(shí)發(fā)現(xiàn)新的轉(zhuǎn)錄本、基因組表達(dá)調(diào)控區(qū)域等[5-6]。因此，目前Solexa表達(dá)譜分析技術(shù)已逐步取代基因表達(dá)系列分析和傳統(tǒng)的基因表達(dá)譜技術(shù)。

近年發(fā)現(xiàn)造血干細(xì)胞體外擴(kuò)增的巨核細(xì)胞輸注到患者體內(nèi)后，能加速患者血小板的恢復(fù)，縮短血小板缺乏期，這為化療或移植后的血小板減少癥提供一個(gè)潛在的新的治療途徑。本研究采用Solexa表達(dá)譜分析技術(shù)分析人臍帶血造血干細(xì)胞分化的巨核細(xì)胞mRNA表達(dá)譜，分別獲取了MK和非MK細(xì)胞 3 773 147和 3 533 805個(gè)初始Tag，整個(gè)清晰的Tag數(shù)量分別為 3 291 132和 2 967 947個(gè)，明顯獨(dú)特的tag數(shù)量分別為 197 769和 245 318個(gè)。同時(shí)表達(dá)譜顯示約有2%的tag屬于未知的序列，提示Solexa表達(dá)譜分析技術(shù)更易發(fā)現(xiàn)新的轉(zhuǎn)錄組。本研究發(fā)現(xiàn)1661個(gè)上調(diào)、902個(gè)下調(diào)基因和2717個(gè)上調(diào)、1519個(gè)下調(diào)標(biāo)簽，這些差異基因編碼產(chǎn)物與細(xì)胞發(fā)育、黏附、凋亡、代謝、細(xì)胞內(nèi)及細(xì)胞間的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)以及免疫應(yīng)答等功能相關(guān)，主要有局部黏附、干細(xì)胞譜系、細(xì)胞外基質(zhì)-受體相互作用、DNA復(fù)制轉(zhuǎn)錄、凋亡、腫瘤發(fā)生、細(xì)胞周期發(fā)育、新陳代謝、白細(xì)胞跨膜遷移、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、細(xì)胞黏附分子、細(xì)胞骨架、免疫應(yīng)答等13類。與非MK細(xì)胞相比，MK細(xì)胞中ZNF576、IRX3顯著上調(diào)，其在轉(zhuǎn)錄調(diào)控中發(fā)揮重要作用，而CD34等干細(xì)胞特異性表面抗原顯著下調(diào)，THBS1、SELP、CD61、VWF、GP5等與MK細(xì)胞分化相關(guān)的基因顯著上調(diào)，這些基因涉及細(xì)胞與基質(zhì)及細(xì)胞間黏附、細(xì)胞周期及發(fā)育、細(xì)胞骨架形成及調(diào)控等功能，CCR4等趨化因子及受體、IL6ST和CSF3R等參與免疫反應(yīng)及其調(diào)控，同時(shí)還有大量新陳代謝及信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)相關(guān)基因明顯差異表達(dá)，另外，IRAK2、CAPN2等凋亡相關(guān)基因在MK細(xì)胞中表達(dá)豐度高于非MK細(xì)胞，而BCL2、TNFRSF10D等抑制凋亡的基因表達(dá)豐度則低于非MK，表明TPO誘導(dǎo)的凋亡與巨核細(xì)胞分化相關(guān)，這與Ryu等[9]的結(jié)果一致。本研究在差異表達(dá)的基因中選擇了log2Ratio (MK/非MK)為2.6的THBS1和log2Ratio (MK/非MK)為-10.4的HOXA9進(jìn)行驗(yàn)證。THBS1在調(diào)節(jié)細(xì)胞的黏附、移行、增生和分化、誘導(dǎo)血小板聚集和抑制血管生成方面發(fā)揮重要作用，在巨核細(xì)胞中表達(dá)高于非巨核細(xì)胞；HOXA9存在于早期造血干/祖細(xì)胞，參與造血干/祖細(xì)胞分化的調(diào)控；在巨核細(xì)胞中表達(dá)低于非巨核細(xì)胞。

M:Marker;1:巨核細(xì)胞；2：非巨核細(xì)胞M :Marker; 1: megakaryocyte; 2: non-megakaryocyte

Solexa測(cè)序發(fā)現(xiàn)的潛在調(diào)控基因以及未知序列今后仍需要進(jìn)一步深入的研究，以闡明轉(zhuǎn)錄本增強(qiáng)或降低對(duì)巨核細(xì)胞增殖和分化過程的影響。

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AnalysisofmRNAExpressionProfilesofMegakaryocytesfromHumanCordBloodCD34+CellsExVivoExpandedUsingSolexaSequencing

WANG Fang, HE Ji, ZHU Fa-ming, LIU Jin-hui, QIN Fei,CHEN Shu, XU Gang, Lü Xing-jun, YAN Li-xing

Blood Center of Zhejiang Province, Key Laboratory of Blood Safety Research, Ministry of Health, Hangzhou 310006, China

YAN Li-xing Tel: 0571-85167801, E-mail: ylx@zjb.org.cn

ObjectiveTo investigate the mRNA expression profiles of megakaryocytes (MKs) from human cord blood CD34+cellsexvivoexpanded using Solexa technique.MethodsCD34+Cells were isolated using density gradient centrifugation and magnetic activated cell sorting. Cultures were stimulated with recombinant human thrombopoietin (100 ng/ml). After 12 days, the MKs fraction was separated from the non-MKs fraction using an anti-CD41 monoclonal antibody by immunomagnetic sorting. The mRNA expression of MKs and non-MKs was detected by Solexa sequencing.ResultsWe obtained 3 773 147 and 3 533 805 Tags from MKs and non-MKs, respectively. The amounts of unambiguous tags were 3 291 132 and 2 967 947 and those of distinct tags were 197 769 and 245 318. The expression of 1161 genes was up-regulated and that of 902 genes down-regulated. The expression of 2717 tags was up-regulated and that of 1519 tags down-regulated.ConclusionsMKs and non-MKs have remarkably different mRNA expression profiles. The differential gene-encoded products may be involved in cellular development, adhesion, apoptosis metabolism, intra- and inter-cellular signal transduction, and immune response. Further studies on this topic may clarify the expression mechanism, signal transduction, and regulation mechanisms.

megakaryocyte; mRNA expression;exvivoexpansion; Solexa sequencing

ActaAcadMedSin, 2011,33(5):529-532

嚴(yán)力行 電話：0571-85167801，電子郵件：ylx@zjb.org.cn

R392.12

A

1000-503X(2011)05-0529-04

10.3881/j.issn.1000-503X.2011.05.010

2010-10-29)