黎婉園，夏楓耿，陳中，張素娟

1(廣州市微生物研究所，廣東廣州510250)

2(華南理工大學(xué)輕工與食品學(xué)院，廣東廣州，510641)

3(安心生物制品有限公司，廣東廣州，510240)

利用納豆菌和乳酸菌共同發(fā)酵奶液的研究

黎婉園1，2，夏楓耿1，陳中2，張素娟3

1(廣州市微生物研究所，廣東廣州510250)

2(華南理工大學(xué)輕工與食品學(xué)院，廣東廣州，510641)

3(安心生物制品有限公司，廣東廣州，510240)

利用納豆菌和乳酸菌共同發(fā)酵奶液，對發(fā)酵過程中發(fā)酵乳的外觀、口感、酸度、微生物數(shù)量以及納豆激酶酶活力的變化進(jìn)行了研究。結(jié)果表明:接種納豆菌8h后再接種乳酸菌進(jìn)行發(fā)酵的樣品，在外觀、口感、乳酸菌以及納豆激酶酶活力方面都有效好效果。

納豆菌，乳酸菌，納豆激酶，發(fā)酵奶液

乳酸菌飲品是以牛乳、羊乳為原料，以乳酸菌作為發(fā)酵劑，經(jīng)過發(fā)酵而成的具有獨(dú)特口感和風(fēng)味的乳飲品，乳酸菌是一些中溫菌［1］，包括保加利亞乳桿菌、干酪乳桿菌、乳酸鏈球菌、雙歧桿菌、嗜熱鏈球菌，乳酸菌對乳類進(jìn)行發(fā)酵后，乳類中的乳糖最終被分解產(chǎn)生乳酸，蛋白質(zhì)分解為多肽和氨基酸，有利于人體對乳糖和蛋白質(zhì)的吸收和利用。納豆激酶(Nattokinase，NK)是由納豆菌產(chǎn)生，納豆菌是好氧的革蘭氏陽性菌，芽孢桿菌屬，枯草芽孢桿菌的一個亞種［2］。近年來研究表明納豆菌發(fā)酵產(chǎn)生的納豆激酶是一種具有強(qiáng)烈溶栓功能的蛋白酶、其酰胺水解活性、纖溶活性及溶栓作用已經(jīng)被證實(shí)，同時納豆激酶的抗腫瘤、降血壓、抗菌、預(yù)防骨質(zhì)疏松、抗氧化、調(diào)節(jié)腸功能等作用也備受關(guān)注［3］。

目前市售的乳酸飲品主要分為單一型和混合型兩大類，單一發(fā)酵類型的是由乳酸菌和乳類發(fā)酵而成，混合型是在單一發(fā)酵的基礎(chǔ)上添加谷物、果粒、蔬菜等，本文研究利用納豆菌和乳酸菌協(xié)同發(fā)酵奶液，對不同的發(fā)酵配方進(jìn)行包括pH值、乳酸菌數(shù)量、納豆菌數(shù)量、納豆激酶酶活力變化的跟蹤研究。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

1.1.1 菌種

納豆菌、乳酸鏈球菌、保加利亞乳桿菌、干酪乳桿菌、雙歧桿菌、嗜熱鏈球菌由廣東省種質(zhì)資源庫廣州市微生物研究所分庫提供。

1.1.2 培養(yǎng)基、試劑

纖維蛋白原、凝血酶、尿激酶、牛血清白蛋白為標(biāo)準(zhǔn)試劑，購自中國藥品生物制定檢定所。

營養(yǎng)肉湯，MRS液體培養(yǎng)基，購自廣東環(huán)凱微生物科技有限公司。

1.1.3 發(fā)酵奶液配方

奶粉10%，砂糖5%，葡萄糖1%，水。

1.2 方法

1.2.1 納豆菌種子液制備

保存的納豆桿菌菌種由斜面接種到裝有100 mL營養(yǎng)肉湯中，35℃下，180 r/min搖床培養(yǎng)16 h，制得納豆菌種子液［4］。

1.2.2 乳酸菌種子液的制備

保存的乳酸鏈球菌、保加利亞乳桿菌、干酪乳桿菌、雙歧桿菌、嗜熱鏈球菌，分別由斜面接種到100 mL的MRS培養(yǎng)基中，放在35℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)16 h，制得乳酸菌種子液。

1.2.3 發(fā)酵牛奶的方法

把經(jīng)搖床培養(yǎng)的納豆菌和乳酸菌種子液按照1%的接種量于不同的時間接種到已經(jīng)配制好的牛奶液中，放在35℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng) 2，4，6，8，10，12，14，16，18 h進(jìn)行各項指標(biāo)的測定。

1.2.4 酸度的測定方法［5］

參照GB/T5009.46乳與乳制品衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)的分析方法。

1.2.5 菌落計數(shù)方法［6－7］

納豆菌數(shù)量依照GB/T 4789.2食品微生物檢驗菌落總數(shù)測定，乳酸菌數(shù)量依照GB/T 4789.35測定。

1.2.6 納豆激酶活力的測定［8］

纖維蛋白平板法，參照并改良Astrup法制備雙層纖維蛋白平板，下層為2.5%的瓊脂。上層為一支纖維蛋白原先溶于3 mL、37℃無菌水中，再溶于20 mL已滅菌的巴比妥納緩沖液中;另取0.6 g瓊脂糖溶于40 mL巴比妥納緩沖液中滅菌冷卻至60℃，二者迅速混勻，加入人凝血酶300 μL(20 U/mL)，搖勻倒入4個Φ9 mm已凝固的瓊脂平板上層，靜置1 h，用3 mm打孔器打孔。將尿激酶標(biāo)準(zhǔn)品(20、40、60、80、100、120、140、160 U/mL)各7 μL點(diǎn)樣于新配制的纖維蛋白平板上，放置10 min，移入37℃培養(yǎng)箱，保溫17 h后取出。測定溶栓圈的垂直直徑，并以垂直直徑乘積(cm2)為橫坐標(biāo)，以尿激酶濃度(U/mL)為縱坐標(biāo)作圖，得標(biāo)準(zhǔn)曲線Y=aX+b。

測定時取納豆激酶樣品用巴比妥納緩沖液稀釋至適當(dāng)濃度，取7 μL點(diǎn)樣于纖維蛋白平板上，并以80 U/mL尿激酶作為標(biāo)準(zhǔn)對照，測量其形成透明圈2條相互垂直的直徑，并計算其面積。據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計算樣品活力Y值(U/mL)。其中樣品的X值=樣品溶栓圈直徑乘積(cm2)/校正系數(shù)f;f=樣品平板尿激酶對照溶栓圈直徑乘積(cm2)/標(biāo)準(zhǔn)曲線中相對應(yīng)的尿激酶溶栓圈直徑乘積(cm2)。

2 結(jié)果與討論

在不同的時間加入乳酸菌和納豆菌有5種組合，同時設(shè)立乳酸菌和納豆菌陽性對照組共7組進(jìn)行試驗，每組平衡10個樣品，見表1。

表1 試驗分組

對實(shí)驗設(shè)計的7個試驗組進(jìn)行各項指標(biāo)的測定。

2.1 發(fā)酵時間對外觀、口感的影響

表2 色澤、口感的變化

分析表2可以看出，利用乳酸菌對奶類進(jìn)行發(fā)酵，會使蛋白質(zhì)變性，出現(xiàn)凝固的現(xiàn)象，有酸甜的口感，利用納豆菌對奶液發(fā)酵也會出現(xiàn)凝固的現(xiàn)象，但酸甜度沒有明顯的變化，第1組同時接種納豆菌和乳酸菌，發(fā)酵速度較快，液體和固體分層現(xiàn)象出現(xiàn)得比較早，從外觀和口感上與第6組單獨(dú)使用乳酸菌發(fā)酵的結(jié)果比較接近;第7組單獨(dú)使用納豆菌進(jìn)行發(fā)酵時，外觀上看與乳酸菌發(fā)酵的沒有區(qū)別，但液體凝固時間較晚而且沒有酸甜的口感，酸味基本沒有。分析第2，3，4，5組發(fā)現(xiàn)，先接種納豆菌發(fā)酵，隨后在不同的時間接種乳酸菌，隨著乳酸菌接種時間的推遲，發(fā)酵時間也相應(yīng)地加長，液體和固體分層的現(xiàn)象也相應(yīng)地推遲，同時接種乳酸菌和納豆菌，由于乳酸菌生長速度較快，會抑制納豆菌的生長。

2.2 酸度的變化

分析圖1看出，樣品的酸度隨著發(fā)酵時間的延長，酸度不斷增加，第7組單獨(dú)使用納豆菌進(jìn)行奶液發(fā)酵時，酸度沒有明顯的增加，從第3，4，5組可以看出，加入乳酸菌后，酸度明顯增加，乳酸菌是發(fā)酵中主要的產(chǎn)酸菌種，加入時間的推遲，酸度的升高也相應(yīng)推遲，要到達(dá)相同的酸度，發(fā)酵時間要加長。

圖1 酸度變化曲線

2.3 乳酸菌和納豆菌菌落總數(shù)的測定

表3 乳酸菌和納豆菌菌落總數(shù)的變化 CFU/mL

分析表3可以看出，第1組，當(dāng)乳酸菌和納豆菌同時加入時，由于乳酸菌的生長迅速，成為優(yōu)勢菌落，產(chǎn)酸、耗氧以及消耗掉大部分的營養(yǎng)物質(zhì)，使納豆菌無法生長。當(dāng)乳酸菌延遲加入時，發(fā)現(xiàn)納豆菌可以生長，但納豆菌生長速度較乳酸菌緩慢而且納豆菌是好氧菌，納豆菌和乳酸菌都能夠較好生長的是第5組，當(dāng)納豆菌發(fā)酵8 h后才加入乳酸菌，一起發(fā)酵到16 h，對此組樣品進(jìn)行納豆菌和乳酸菌計數(shù)時發(fā)現(xiàn)，兩種菌都能有較好的生長，都能得到比較高的菌落數(shù)。

2.4 發(fā)酵時間對酶活力的影響

2.4.1 尿激酶標(biāo)準(zhǔn)曲線(圖3)

圖3 尿激酶標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.4.2 納豆激酶酶活力的變化

從表3可知，在發(fā)酵早期(0～6 h)，納豆菌數(shù)量沒有明顯的增長，所以測試納豆激酶的酶活力從8 h開始。

分析表4數(shù)據(jù)可以看出，推遲乳酸菌接種遲，有利于納豆菌的生長，同時隨著發(fā)酵時間的延長，納豆激酶的酶活力也在增加，16 h進(jìn)入生長的高峰期，一直持續(xù)到18 h。根據(jù)表4的數(shù)據(jù)可得出圖4。

表4 納豆激酶酶活力的變化

圖4 納豆激酶活力曲線

3 結(jié)論

試驗主要研究利用乳酸菌和納豆菌共同對奶液進(jìn)行發(fā)酵，分別對乳酸菌和納豆菌按照不同時間接種而形成的不同組別進(jìn)行的各項指標(biāo)檢測并分析結(jié)果。試驗表明單獨(dú)接種納豆菌對奶液發(fā)酵，納豆菌在奶液中能很好生長，并使奶液凝固，產(chǎn)生較高的納豆激酶酶活力，但沒有酸甜的口感。利用納豆菌和乳酸菌共同發(fā)酵奶液，根據(jù)不同菌種不同的接種時間有不同的結(jié)果出現(xiàn)，如先接種乳酸菌，由于乳酸菌繁殖較快，會成為優(yōu)勢菌種并且產(chǎn)酸抑制納豆菌的生長，如先接種納豆菌，讓納豆菌在奶液中生長到8 h再接種乳酸菌，則能夠讓納豆菌較好生長產(chǎn)生一定的納豆激酶，同時又能使后接種的乳酸菌正常生長，產(chǎn)生酸甜口感。納豆菌彌補(bǔ)了乳酸菌發(fā)酵乳功能上的不足，乳酸菌則改善了納豆菌發(fā)酵奶液不產(chǎn)酸而導(dǎo)致的口感上的不佳。利用納豆菌和乳酸菌共同發(fā)酵奶液，得到營養(yǎng)功能、營養(yǎng)成分更符合人們需要的產(chǎn)品。

［1］ 楊郁，張麗靖 納豆菌和乳酸菌的耐酸性比較研究［J］．食品研究與開發(fā)，2008(3):78－80．

［2］ Martin M，Kouhei M．Natto and its active ingredient nattokinase a potent and safe thrombolytic agent［J］．Alternative ＆ Complementary Therapies，2002(6):157 －164．

［3］ Zheng Z L，Zuo Z Y，Liu Z G，et al．Construction of a 3D model of nattokinase，a novel fibrinolytic enzyme from Bacillus natto．a(chǎn) novel nucleophilic catalytic mechanism fornattokinase［J］．Journal of Molecular Graphics and Modelling，2005，23:373 －380．

［4］ 明飛平，趙培靜，納豆芽孢桿菌液體發(fā)酵條件的優(yōu)化研究［J］．現(xiàn)代食品科技，2009，25(6):625 －628．

［5］ GB/T5009．46．乳與乳制品衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)的分析方法［S］．

［6］ GB/T4789．2．食品微生物檢測菌落總數(shù)測定［S］．

［7］ GB/T4789．35．食品微生物檢驗 乳酸菌檢驗［S］．

［8］ 楊明，董超．纖維蛋白平板法測定納豆激酶方法的改進(jìn)［J］．中國釀造 2008(7):77 －80．

［9］ 丁有學(xué)，劉蘭，袁力勇．納豆激酶的研究進(jìn)展［J］．中國生物制品學(xué)雜志，2008(12):1 129－1 131．

［10］ 王聰，孔繁東，祖國仁．納豆激酶的研究現(xiàn)狀與展望［J］．食品研究開發(fā)，2004，25(6):17 －20．

［11］ 梁淑娃，黃曉曼，夏楓耿，等．納豆激酶液體深層發(fā)酵技術(shù)的研究［J］．現(xiàn)代食品科技，2007，23(6):1 －3．

Research About Fermentation Milk with Bacillus natto and Lactobacillus

Li Wan-yuan1，2，Xia Feng-geng1，Chen Zhong2，Zhang Su-juan3
1(Guangzhou Microbe Research Institute，Guangzhou 510250，China)
2(School of Light Industry and Food Science，South China University of Technology，Guangzhou 510641，China)
3(Guangzhou Anxin Biological Products Co．，Ltd．，Guangzhou 510240，China)

This research was about fermentation milk with Bacillus natto and lactobacillus，studied the changes of color and texture，acidity，microbial counts and Nattokinase during the fermentation．The result showed that the sample that was fermented with Bacillus natto fermentation 8 h before lactobacillus is the best．

Bacillus natto，Lactobacillus，Nattokinase，fermentation milk

碩士，高級實(shí)驗師。

*廣州市重大科技專項計劃項目(2009A1－E021－5):酶制劑的大規(guī)模制備。

2011－03－28，改回日期:2011－07－12