王元有 華 偉 劉天晴,*

(1揚州大學化學化工學院,江蘇揚州225002;2揚州工業(yè)職業(yè)技術學院,江蘇揚州225127)

血紅蛋白在Span 80/PEG 400/H2O囊泡體系中的結構性質

王元有1,2華 偉1劉天晴1,*

(1揚州大學化學化工學院,江蘇揚州225002;2揚州工業(yè)職業(yè)技術學院,江蘇揚州225127)

通過紫外-可見吸收光譜、熒光光譜、動態(tài)光散射、圓二色譜、負染-透射電鏡(NS-TEM)和冷凍蝕刻-透射電鏡(FE-TEM)等實驗方法研究了血紅蛋白(Hb)與Span 80/PEG 400/H2O囊泡間的相互作用及其結構特性.結果表明:Hb易于吸附在囊泡表面,使得囊泡的表觀半徑稍有增大;Hb的肽鏈在囊泡表面能夠逐漸伸開,特征熒光峰強度顯著增強,部分氨基酸殘基進一步暴露,α-螺旋結構含量減少,β-折疊和β-轉角結構含量增加,無規(guī)卷曲結構含量基本不變.囊泡體系中Hb的穩(wěn)定性與囊泡的穩(wěn)定性有關.

血紅蛋白;結構;性質;非離子囊泡

1 引言

囊泡是分子有序組合體的一種重要形式,具有類似細胞膜的雙層膜結構特性,因此它不僅可以用作細胞膜模型,也作為腫瘤和病毒的靶向藥物的載體,具有極其廣泛的應用.1-11由非離子表面活性劑所形成的囊泡,不僅在結構和性質上與由脂質體形成的囊泡相似,而且用于制備非離子型囊泡所用的材料具有相對較低的價格,制備簡單、方便,12可進行大批量生產,也可避免不適合溶劑的選擇問題,因此非離子囊泡將具有更為廣闊的應用前景.人們在應用囊泡研究生物膜、藥物釋放、基因載體等過程中,常常僅研究其性質、變化規(guī)律和效果,但囊泡對生命體系中蛋白結構性質的影響和囊泡與蛋白間的相互作用的研究報道較少,這一方面限制了人們對囊泡在生命體系中的功能和作為生物膜模擬模型的可靠性的深入理解和驗證;另一方面,也限制了囊泡的功能性應用的拓展.本文在成功地制備高穩(wěn)定、生物型Span 80/PEG 400/H2O非離子型囊泡基礎上,13通過紫外-可見吸收光譜、熒光發(fā)射光譜、圓二色譜、負染-透射電鏡、冷凍蝕刻-透射電鏡等方法,研究Span 80/PEG 400/H2O囊泡體系中的Hb結構性質及形貌,囊泡與蛋白間的相互作用,分析PEG 400對囊泡與蛋白間相互作用的影響,為生命體系中囊泡與蛋白間的相互作用與影響以及生物膜與蛋白間的相互關系等提供可靠的實驗依據和理論指導,為最終揭示生物膜與蛋白的作用機理提供了重要的范例,對生物膜的功能性研究和應用也具有較深的理論與實際意義.

2 實驗部分

2.1 實驗試劑

血紅蛋白(Hb,BR,國藥集團化學試劑有限公司),Span 80(AR,上海大眾制藥廠),PEG 400(AR,國藥集團化學試劑有限公司).水為二次蒸餾水.

2.2 非離子囊泡的制備

將Span 80、PEG 400和水按一定質量比混合、振蕩,超聲10-15 min(CQX25-06超聲波清洗器,上海必能信超聲有限公司),制得非離子囊泡.通過影像分析(SK-882 Image Analyzer,Sanko Co.,Japan),觀察囊泡的大小、分布和穩(wěn)定時間.

2.3 紫外-可見吸收光譜的測定

配制一系列Span 80/PEG 400/H2O/Hb溶液,恒溫30 min,測定溶液的紫外吸收光譜(UV-2501PC紫外可見分光光度儀,Shimadzu Co.,Japan).

2.4 熒光發(fā)射光譜的測定

在激發(fā)波長為280nm,運用RF-5301型熒光光譜儀(Shimadzu Co.,Japan)分別測定不同組成條件下Hb的熒光發(fā)射光譜.激發(fā)、發(fā)射狹縫寬度均為3 nm.

2.5 冷凍蝕刻-透射電鏡

冷凍蝕刻-透射電鏡的樣品在冷凍蝕刻儀(Balzers BAF-400D)中制得模板后,通過透射電鏡(TEM, TECNAIL,Philip Apparatus Co.USA)觀察囊泡的形貌.14

2.6 負染-透射電鏡15

將含有囊泡的樣品滴在200目Formvar膜的載網上,吸附15 min后,進行磷鎢酸負染.通過透射電鏡(TECNAIL,Philip Apparatus Co.,USA)觀察囊泡的大小和形貌.

2.7 電導率的測定

體系的電導率由DDS-11A型電導率儀(上海第二分析儀器廠)測定.電導率儀每月均由0.01 mol· L-1KCl溶液校正.

2.8 圓二色性測定

蛋白的二級結構參數通過J-810型圓二色譜儀(Jasco Co.,Japan)測定蛋白體系的圓二色性(CD)而獲得.蛋白的二級結構參數由所得蛋白CD圖譜經Jasco標準圖譜配合分析處理給出.掃描速率為100 nm·min-1.

2.9 Hb穩(wěn)定性的測定

測量一系列不同時間、不同血紅蛋白濃度時囊泡體系的紫外-可見吸收光譜、熒光發(fā)射光譜和圓二色譜,通過分析各峰強和位置是否變化,確定蛋白的穩(wěn)定性.

以上實驗均在(25.0±0.1)°C條件下進行.為了使各相互間作用達到穩(wěn)定平衡,體系穩(wěn)定時間至少為30 min.

3 結果與討論

3.1 Hb在Span 80/PEG 400/H2O囊泡體系中的紫外與熒光性質

由于Hb在肽鏈上含有色氨酸殘基的吲哚環(huán)和酪氨酸殘基的苯環(huán),Hb紫外特征吸收峰主要落在276和406 nm.16在Hb/H2O體系中,隨著Hb濃度增加,其紫外-可見特征吸收峰的強度呈線性增加(圖1),這是紫外-可見光譜法測定Hb含量的基本原理. Hb在328 nm處的特征熒光發(fā)射峰強度,隨Hb濃度的增加,先增大到一極值后又減小.這可能是由于隨著Hb濃度增加,Hb可能發(fā)生二聚或團聚現象,導致其熒光強度下降.如果在PEG 400/H2O體系中加入Hb,Hb的紫外特征吸收峰強度和特征熒光發(fā)射峰強度與其在水體系中的性質相比,沒有發(fā)生明顯變化.但在Span 80/PEG 400/H2O囊泡體系中,Hb特征熒光峰強度明顯增加.

PEG 400中含有較多親水基(羥基),呈完全水溶性,可與Hb中親水基(如氨基、羥基、羧基等)形成較強的氫鍵,聚集在Hb表面,但這種聚集沒有導致Hb結構發(fā)生明顯變化.在囊泡體系中,Hb與囊泡間的親水作用、疏水作用和氫鍵作用,導致Hb易于吸附在囊泡表面,Hb的肽鏈在囊泡表面可逐漸展開,部分氨基酸殘基可能更加暴露,特征熒光峰強度顯著地增強.

圖1 三種不同體系中Hb紫外吸收強度(a)和熒光強度(b)與Hb濃度關系Fig.1 Relations of UV-Vis absorption intensity(a)and fluorescence emission intensity(b)of Hb variy with Hb concentrations in three different systems■H2O system,●PEG 400/H2O system,▲niosome system; Insets are UV-Vis absorption spectra(a)and fluorescence spectra(b).107cHb/(mol·L-1):(1)7.00,(2)9.00,(3)0.100,(4)0.300,(5),0.500,(6)0.700,(7)0.900

3.2 Hb/囊泡的聚集形貌

Hb在囊泡表面吸附或聚集的圖像可以從囊泡/蛋白體系的FE-TEM照片(圖2)和NS-TEM照片(圖3、圖4)得到證實.從圖2可以看出,在囊泡體系中加入Hb后,原本均勻的球形囊泡結構呈現不均勻、多分散,不僅囊泡表觀體積增大,而且不規(guī)則球形數目也增多.從圖3、圖4可以看出,在含有一定量的囊泡體系中,隨著Hb濃度或PEG 400濃度的增加,囊泡逐漸相互連接在一起.大部分Hb通過親水作用和氫鍵,17在囊泡膜表面吸附,肽鏈在囊泡膜表面逐漸展開,體系中蛋白相互聚集的程度也不斷增加.隨著PEG 400含量的增加,囊泡與蛋白間的親水作用和氫鍵作用不斷增強,蛋白在囊泡膜表面聚集增多,肽鏈進一步展開.

圖2 囊泡體系(a)和Hb/囊泡體系(b)的冷凍蝕刻-透射電鏡(FE-TEM)照片Fig.2 FF-TEM images of niosome system(a)and Hb/niosome system(b)

3.3 Hb對囊泡半徑和ξ電位的影響

Span 80/PEG 400/H2O非離子囊泡半徑為80-150 nm,其大小主要與溫度、組成、制備方法等因素有關.18隨著PEG 400含量增加,囊泡半徑逐漸減小(圖5).在含有Hb的囊泡體系中,囊泡的表觀半徑稍有增大,表明蛋白Hb吸附在囊泡膜表面.隨著PEG 400含量的增加,PEG 400與Hb間的氫鍵和親水作用能使更多PEG 400聚集在囊泡表面,囊泡表觀半徑稍有增加;但大量PEG 400又能引起囊泡膜的親水性增強而不穩(wěn)定,導致囊泡表觀半徑逐漸減小.圖5還表明,吸附在囊泡表面的Hb,對囊泡能起到屏蔽、保護作用,能顯著減小PEG 400對囊泡半徑及其穩(wěn)定性的影響.

PEG 400對囊泡/Hb體系中Hb、囊泡的動電位和體系電導率均有影響.Span 80/PEG 400/H2O非離子型囊泡自身無電荷,動電位為零,但當該體系中含有Hb時,實驗發(fā)現囊泡呈現負電性、具有動電位(圖6),其電荷性質與蛋白Hb相同,這表明帶有負電性的Hb確實能吸附在非離子囊泡表面,使得非離子囊泡帶電性.從圖6還可以看出,隨著PEG 400含量增加,體系的電導率減小.PEG 400含量增加,體系粘度增強,PEG 400與囊泡間的相互作用增強,使得帶電粒子在電場下運動速率減小,電導率減小, Hb的表觀負電荷和動電位也都減小.另外,PEG 400中羥基與蛋白間形成氫鍵,使Hb發(fā)生部分扭曲和伸長,電荷密度減小,二級結構發(fā)生改變,其電性也可能發(fā)生變化.

3.4 囊泡體系中Hb的園二色性及其二級結構參數

圖3 Hb/囊泡體系NS-TEM照片Fig.3 NS-TEM images of Hb/niosome systemwPEG400=2.0%;106cHb/(mol·L-1):(a)1.00,(b)5.00,(c)8.00,(d)0.10,(e)0.30,(f)0.50

圖4 Hb/囊泡體系NS-TEM照片Fig.4 NS-TEM images of Hb/niosome systemcHb=5.00×10-6mol·L-1;wPEG400/%:(a)1.0,(b)2.0,(c)3.0,(d)4.0,(e)5.0,(f)7.0

在PEG 400/Span 80/H2O囊泡體系中,Hb的二級結構發(fā)生明顯地變化,19,20α-螺旋結構含量減少,β-折疊和β-轉角結構含量增加,無規(guī)卷曲結構含量基本不變(圖7).由于蛋白與囊泡間親水作用、疏水作用和氫鍵作用使Hb能夠吸附于囊泡膜表面,蛋白的肽鏈在囊泡膜表面逐漸伸展.另外,PEG 400具有很強親水性,能夠嵌入到囊泡的膜相中,使得囊泡膜的親水性和粘性增強,蛋白與囊泡間親水作用和氫鍵作用也增強,蛋白在囊泡膜表面的含量增加,引起蛋白肽鏈折疊結構松散,處于蛋白折疊結構內部的部分基團暴露,甚至在囊泡膜表面進一步展開,二級結構發(fā)生改變.

3.5 Hb在PEG 400水溶液和囊泡體系中的穩(wěn)定性

圖5 PEG 400含量對囊泡半徑(Rh)的影響Fig.5 Effect of PEG 400 content on hydrodynamic radius(Rh)of niosome cHb=5.00×10-6mol·L-1

圖6 PEG 400含量對Hb/囊泡體系電導率的影響Fig.6 Effect of PEG 400 content on conductivity ofniosome system cHb=5.00×10-6mol·L-1

圖7 PEG 400含量對囊泡體系中Hb的二級參數的影響Fig.7 Effect of PEG 400 content on secondary parameters of Hb in niosome systemcHb=5.00×10-6mol·L-1

圖8 Hb在囊泡體系中的穩(wěn)定性Fig.8 Stability of Hb in niosome systemcHb=5.00×10-6mol·L-1;■Hb/niosome system,●Hb/PEG 400/H2O system

Hb對囊泡的大小和穩(wěn)定性影響較小,但囊泡的存在有利于Hb性質的穩(wěn)定(圖8).由于Hb能夠吸附于囊泡膜表面,穩(wěn)定了蛋白的結構,部分保護了蛋白.所以,雖然Hb在囊泡體系中與在純水體系中相比其結構發(fā)生一定的變化,但其穩(wěn)定性顯著增加.從圖8還可看出,Hb的穩(wěn)定性隨著PEG 400含量的增加先增加、后下降,這可能與囊泡的穩(wěn)定性有關.具有親水鏈的PEG 400環(huán)繞在囊泡中,部分存在于囊泡的膜相中,使得囊泡具有較高的穩(wěn)定性.另一方面,當體系中PEG 400含量較高時,PEG 400含量增加使得囊泡的親水性增加,囊泡膜厚度減小,囊泡穩(wěn)定性減小,引起Hb結構變化、穩(wěn)定性降低.

4 結論

在PEG 400/Span 80/H2O囊泡體系中,Hb能夠吸附于囊泡膜表面,使得蛋白的肽鏈在囊泡膜表面逐漸伸展,二級結構發(fā)生變化,Hb電性質和穩(wěn)定性也發(fā)生改變.隨著PEG 400含量的增加,囊泡與蛋白間相互作用逐漸增強,蛋白在囊泡膜表面聚集增多.Hb在Hb/囊泡體系中的穩(wěn)定性較在Hb/H2O體系中的穩(wěn)定性高.而當蛋白濃度逐漸增加時,越來越多的囊泡通過蛋白而相互聚集.研究非離子型表面活性劑囊泡體系中的蛋白結構性質,囊泡與蛋白間的相互作用,分析PEG 400對囊泡與蛋白間相互作用的影響,能夠為生命體系中囊泡與蛋白間的相互作用與影響以及生物膜與蛋白間的相互關系等提供實驗依據,也能夠為生物膜的功能性研究和應用提供可靠的理論依據.

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February 28,2011;Revised:May18,2011;Published on Web:June 21,2011.

Structural Property of Hemoglobin in Span 80/PEG 400/H2O Niosome System

WANG Yuan-You1,2HUA Wei1LIU Tian-Qing1,*
(1School of Chemistry and Chemical Engineering,Yangzhou University,Yangzhou 225002,Jiangsu Province,P.R.China;2Department of Chemical Engineering,Yangzhou Polytechnic Institute,Yangzhou 225127,Jiangsu Province,P.R.China)

The structural property of hemoglobin(Hb)was studied in detail by UV-Vis absorption, fluorescence,circular dichroism,negative staining-transmission electron microscopy(NS-TEM),and freeze etching-transmission electron microscopy(FE-TEM)techniques using a Span 80/PEG 400/H2O niosome system.The obtained results show that Hb is adsorbed onto the surface of niosome.The peptide chain of Hb spreads out and the apparent radius of the niosome,the intensities of the UV-Vis absorption peaks,and the fluorescence peaks increase.For the second structural parameter of Hb,the α-helix content decreases but the β-sheet and β-turn content increases.The stability of Hb varies with that of the niosome.

Hemoglobin;Structure;Property;Niosome

O648

*Corresponding author.Email:tqliu@yzu.edu.cn;Tel:+86-514-87975590-9517;Fax:+86-514-87975244. The project was supported by the National Natural Science Foundation of China(20573091).

國家自然科學基金(20573091)資助項目