劉鈺瑜，姚衛(wèi)民，徐道華，崔 燎

卡托普利(captopril，CPT)屬于血管緊張素Ⅰ轉(zhuǎn)換酶抑制藥，通過作用于腎素—血管緊張素—醛固酮(renin-angiotensin aldosterone system，RAAS)系統(tǒng)，阻斷血管緊張素Ⅱ的強(qiáng)烈縮血管作用而抗高血壓。RAAS在心血管疾病與骨質(zhì)疏松之間可能存在著相關(guān)聯(lián)的分子機(jī)制。體內(nèi)外實驗發(fā)現(xiàn)CPT具有抗骨質(zhì)疏松作用，可增加維甲酸性骨質(zhì)疏松小鼠股骨的骨鈣和骨羥脯氨酸的含量，對去卵巢大鼠的生物力學(xué)性能有改善作用，也有促進(jìn)成骨細(xì)胞分化的作用［1-2］，但目前關(guān)于ACEI能否用于骨質(zhì)疏松的防治尚無定論。本實驗通過體外細(xì)胞培養(yǎng)，觀察CPT對成骨細(xì)胞樣細(xì)胞增殖、分化和Ⅰ型膠原mRNA表達(dá)的作用，為探討CPT的防治骨質(zhì)疏松作用提供進(jìn)一步體外實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試劑和儀器 DMEM培養(yǎng)基(Gibco公司);胰蛋白酶、MTT、前列腺素E2(Sigma公司);卡托普利標(biāo)準(zhǔn)品(ALEXIS公司);堿性磷酸酶檢測試劑盒(北京中生生物公司)、Access RT-PCR試劑盒(Invitrogen公司)。NAPCO二氧化碳恒溫培養(yǎng)箱(5420-1，Precision Scientific美國);XD-101倒置相差顯微鏡(江南光電股份有限公司);酶標(biāo)儀:Bio-ELX-800型，USA;9600Gen Amp PCR System(美國PE公司);DYY-5型穩(wěn)壓穩(wěn)流電泳儀，WD-9403C型紫外分析儀(北京六一儀器廠)。RT-PCR選用β-肌動蛋白(β-actin)為內(nèi)參照，引物由上海生物工程公司合成，序列見Tab 1。

Tab 1 Primer sequence of COLL-Ⅰand β-actin

1.2 方法

1.2.1 MTT法測定MC3T3-E1細(xì)胞的增殖 細(xì)胞以2×104/cm2的密度接種入96孔板，第一孔為空白調(diào)零。細(xì)胞接種24h后加入不同濃度的卡托普利，使終濃度分別是:10-12、10-11、10-10mol·L-1;陽性對照組用前列腺素E2(終濃度是10-7mol·L-1);同時以溶劑作為對照組。于加藥后12、24、36 h進(jìn)行檢測，實驗結(jié)束前4 h加20 μl的MTT(5 g·L-1)，繼續(xù)在37℃，5%CO2條件下孵育4 h，吸取培養(yǎng)液后加二甲基亞砜0.15 ml，振搖至結(jié)晶完全溶解，于酶標(biāo)儀檢測其吸光度，檢測波長570 nm，參考波長630 nm。

1.2.2 PNPP法測定MC3T3-E1細(xì)胞堿性磷酸酶(ALP)活性 細(xì)胞接種24 h后加藥，加藥方法同前。于藥物作用d 3、d 5、d 7測定細(xì)胞堿性磷酸酶含量。測定時，去掉培養(yǎng)液，PBS沖洗，然后加入堿性磷酸酶檢測試劑盒中新鮮配制的底物100 μl，37℃放置0.5 h，然后用0.1 mol·L-1的 NaOH 100 μl終止反應(yīng)，在酶標(biāo)儀于405 nm波長下測定OD值。樣品OD值在ALP標(biāo)準(zhǔn)曲線上讀取酶活性值(U·L-1)。

1.2.3 逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)測定Ⅰ型膠原mRNA的表達(dá) 細(xì)胞按2×104·cm-2接種于6孔板，24 h后加入不同濃度的藥物，卡托普利的終濃度為 10-13、10-12、10-11、10-10mol·L-1，前列腺素E2的終濃度是10-7mol·L-1。培養(yǎng)7 d后，按照TRIzol試劑盒說明進(jìn)行總RNA的抽提。反應(yīng)條件為50℃逆轉(zhuǎn)錄30 min，94℃預(yù)變性2 min，94℃變性30 s，54℃退火 30 s，70℃延伸 45 s，35 個循環(huán)，最后一個循環(huán)72℃延伸8 min。PCR產(chǎn)物于2%瓊脂糖凝膠電泳，溴化乙錠染色，紫外燈下觀察并拍照。以Bandscan程序?qū)D片行總灰度掃描，與對應(yīng)的β-actin的電泳帶總灰度的比值為半定量結(jié)果(相對值)。1.3統(tǒng)計學(xué)處理 計量資料以±s表示。SPSS11.0軟件行方差分析并進(jìn)行Bonferroni組間比較。

2 結(jié)果

2.1 卡托普利對MC3T3-E1細(xì)胞增殖的影響 用不含血清的培養(yǎng)液培養(yǎng)細(xì)胞，隨著培養(yǎng)時間的延長，各組細(xì)胞數(shù)目逐漸下降。與對照組相比，在24 h，卡托普利10-12和10-11mol·L-12個濃度可促進(jìn)細(xì)胞的增殖。在36 h，卡托普利10-12和10-11mol·L-1濃度仍可促進(jìn)細(xì)胞的增殖，但作用不如24 h明顯。與對照組相比，前列腺素E2在用藥后36 h對細(xì)胞增殖有明顯的促進(jìn)作用。見Tab 2。

Tab 2 Effects of captopril on cell growth in MC3T3-E1 cells(±s，n=8)

Tab 2 Effects of captopril on cell growth in MC3T3-E1 cells(±s，n=8)

*P ＜0.05，＊＊P ＜0.01 vs control

Group 12 h 24 h 36 h Control 0.197±0.023 0.130±0.008 0.116±0.017 PGE210-7mol·L-1 0.218±0.017 0.159±0.009 0.169±0.015＊＊Captopril 10-12mol·L-1 0.196±0.016 0.171±0.013＊＊ 0.148±0.014*Captopril 10-11mol·L-1 0.220±0.018 0.201±0.018＊＊ 0.172±0.019＊＊Captopril 10-10mol·L-10.201±0.015 0.161±0.019 0.128±0.019

2.2 卡托普利對 MC3T3-E1細(xì)胞堿性磷酸酶(ALP)活性的影響 用含1%胎牛血清的培養(yǎng)液培養(yǎng)細(xì)胞隨著培養(yǎng)時間的延長，各組細(xì)胞ALP含量逐漸增高，在d 5時達(dá)最高值，隨后下降。與對照組相比，卡托普利在d 3和d 5能提高細(xì)胞堿性磷酸酶活性。在d 3，卡托普利10-11和10-10mol·L-1兩個濃度可提高細(xì)胞堿性磷酸酶活性。在d 5，卡托普利10-11mol·L-1濃度仍可提高成骨細(xì)胞堿性磷酸酶活性，但作用不如3 d時明顯。與對照組相比，前列腺素E2在d 3至d 5對細(xì)胞堿性磷酸酶活性均有明顯的提高作用，見Tab 3。

2.3 卡托普利對MC3T3-E1細(xì)胞Ⅰ型膠原(Type I Collagen，COLL-Ⅰ)基因表達(dá)水平的影響 與對照組相比，加藥后7 d，10-7mol·L-1前列腺素和10-12mol·L-1～10-10mol·L-1濃度的卡托普利可促進(jìn)MC3T3-E1細(xì)胞表達(dá)COLL-Ⅰ，其中10-11mol·L-1濃度的卡托普利有較強(qiáng)的促進(jìn)COLL-Ⅰ表達(dá)的作用，但是該作用較陽性藥物前列腺素弱，見Fig 1。

Tab 3 Effects of captopril on the ALP activities(U·L－1)in MC3T3-E1 cells(±s，n=8)

Tab 3 Effects of captopril on the ALP activities(U·L－1)in MC3T3-E1 cells(±s，n=8)

＊＊P＜0.01 vs control

Group 3 d 5 d 7 d Control 234.7±36.2 272.0±30.6 145.9±6.3 PGE210-7mol·L-1 440.4±61.2＊＊ 677.8±142.0＊＊ 620.0±250.1＊＊Captopril 10-12mol·L-1 264.8±57.6 326.3±113.0 190.9±29.8 Captopril 10-11mol·L-1 383.0±72.3＊＊ 427.4±72.6＊＊ 197.7±23.6 Captopril 10-10mol·L-1 358.2±36.5＊＊401.3±89.4 195.4±34.7

Fig 1 Effects of captopril on the COLL-ⅠmRNA expression in MC3T3-E1 cells

3 討論

目前研究表明高血壓與骨質(zhì)疏松密切相關(guān)，很多心血管疾病的患者，往往同時伴有骨質(zhì)疏松，所以我們在使用心血管系統(tǒng)藥物治療這些人群心血管疾病的同時，須注意到藥物對骨量的影響。在臨床用藥中也發(fā)現(xiàn)很多作用于心血管系統(tǒng)的藥物有改變骨量的作用，并影響到病人骨折的發(fā)生率。RAAS在心血管疾病與骨質(zhì)疏松之間可能存在著相關(guān)聯(lián)的分子機(jī)制。在轉(zhuǎn)基因小鼠實驗看到，表達(dá)人類腎素基因的小鼠腎素高表達(dá)后，小鼠血壓正常，但是由于RAAS的激活，導(dǎo)致骨量減少，所以認(rèn)為該系統(tǒng)對骨骼系統(tǒng)的影響，導(dǎo)致骨質(zhì)疏松的發(fā)生甚至可不依賴于高血壓的發(fā)生而獨立出現(xiàn)［3］。體內(nèi)實驗證實成骨細(xì)胞和破骨細(xì)胞都可以合成和表達(dá)血管緊張素轉(zhuǎn)化酶、血管緊張素受體等RAAS的各組分［4］，雖然骨骼系統(tǒng)局部的RAAS對骨量的影響還沒有完全闡明［5］，但體外實驗已經(jīng)證實血管緊張素Ⅱ可以抑制成骨細(xì)胞的分化和骨形成［6］。目前一般認(rèn)為RAAS可調(diào)節(jié)骨吸收，血管緊張素Ⅰ和血管緊張素Ⅱ被認(rèn)為是強(qiáng)烈的骨吸收促進(jìn)劑，一些血管緊張素轉(zhuǎn)化酶抑制藥通過減少血管緊張素Ⅱ的生成減少骨吸收，而且體外實驗研究表明這類藥物抑制骨吸收的作用并不是直接地抑制破骨細(xì)胞，而是通過作用于成骨細(xì)胞，從而發(fā)揮抑制破骨細(xì)胞作用的［7］。體內(nèi)實驗中我們發(fā)現(xiàn)血管緊張素轉(zhuǎn)化酶抑制藥卡托普利(5 mg·kg-1·d-1)能改善老年去卵巢大鼠的生物力學(xué)性能［1］，卡托普利(6.25 mg·kg-1·d-1)可增加維甲酸性骨質(zhì)疏松小鼠股骨的骨鈣和骨羥脯氨酸的含量［2］。為進(jìn)一步探討卡托普利的促成骨作用，本實驗觀察卡托普利對成骨樣細(xì)胞的作用，并與陽性藥物前列腺素E2進(jìn)行比較。成骨細(xì)胞(osteoblast)是骨形成過程中最重要的功能細(xì)胞，它不僅分泌骨基質(zhì)參與成骨，同時也參與破骨細(xì)胞骨吸收功能的調(diào)節(jié)，因此在骨代謝過程中起著極為重要的作用。結(jié)果顯示前列腺素E2可促進(jìn)MC3T3-E1細(xì)胞增殖，前列腺素E2是一個已被公認(rèn)的促進(jìn)成骨細(xì)胞增殖的工具藥［8］，可通過激活蛋白酶 C，促進(jìn) DNA合成［9］。卡托普利有類似前列腺素E2的促進(jìn)MC3T3-E1細(xì)胞增殖的作用，成骨細(xì)胞數(shù)量的不斷增加可以產(chǎn)生豐富的膠原，從而通過鈣化基質(zhì)的形成產(chǎn)生更多的骨組織?？ㄍ衅绽碳ぜ?xì)胞增殖外，還可促進(jìn)堿性磷酸酶的表達(dá)。堿性磷酸酶的表達(dá)是成骨細(xì)胞分化的主要特征之一，是成熟成骨細(xì)胞的標(biāo)志，其活性的高低可反映成骨細(xì)胞的成熟狀況，還在新骨形成中發(fā)揮著鈣結(jié)合蛋白的作用?？ㄍ衅绽纱龠M(jìn)細(xì)胞表達(dá)堿性磷酸酶，說明其有促進(jìn)成骨細(xì)胞分化的作用。前列腺素E2也有很強(qiáng)的促進(jìn)堿性磷酸酶表達(dá)的作用。有研究表明低濃度的前列腺素E2可通過促進(jìn)cAMP的合成提高ALP的活性［10］?？ㄍ衅绽麑Τ晒羌?xì)胞Ⅰ型膠原基因的表達(dá)有促進(jìn)作用，Ⅰ型膠原蛋白是成骨細(xì)胞分化的特征之一，是構(gòu)成骨骼有機(jī)基質(zhì)的主要成分，占骨有機(jī)基質(zhì)90%以上，Ⅰ型膠原在成骨細(xì)胞增殖早期已經(jīng)開始表達(dá)，并隨著基質(zhì)成熟而逐漸增加，其表達(dá)與骨形成活性密切相關(guān)。在礦化期大量形成的Ⅰ型膠原可作為羥基磷灰石結(jié)晶的異質(zhì)晶核，在生物礦化中起一定作用，從而維持骨組織的完整和強(qiáng)度。有研究表明前列腺素E2對膠原合成有促進(jìn)作用［11］，本實驗用前列腺素E2作為陽性藥也證實了這點，同時提示卡托普利對Ⅰ型膠原基因表達(dá)也有促進(jìn)作用，但比前列腺素E2弱。

綜上所述，本實驗初步證實卡托普利有促進(jìn)成骨細(xì)胞樣細(xì)胞增殖、分化和促進(jìn)Ⅰ型膠原基因表達(dá)，為卡托普利用于骨質(zhì)疏松的防治提供體外實驗的依據(jù)。

［1］Liu Y Y，Yao W M，Wu T，et al.Captopril improves osteopenia in ovariectomized rats and promotes bone formation in osteoblasts［J］.J Bone Miner Metab，2011，29(2):149-58.

［2］陳 方，吳 鐵，崔 燎，等.卡托普利抗小鼠維甲酸性骨質(zhì)疏松的作用探討［J］.中國藥理學(xué)通報，2002，18(5):572-575.

［2］Chen F，Wu T，Cui L，et al.A study on captopril antagonized osteoporosis induced by retinoic acid in mice and its dose-response effects［J］.Chin Pharmacol Bull，2002，18(5):572-5.

［3］Asaba Y，Ito M，F(xiàn)umoto T，et al.Activation of renin-angiotensin system induces osteoporosis independently of hypertension［J］.J Bone Miner Res，2009，24(2):241-50.

［4］Izu Y，Mizoguchi F，Kawamata A，et al.AngiotensinⅡtype 2 receptor blockade increases bone mass［J］.J Biol Chem，2009，284(8):4857-64.

［5］Nakagami H，Osako M K，Shimizu H，et al.Potential contribution of action of renin angiotensin system to bone metabolism［J］.Curr Hypertens Rev，2007，3(2):129-32.

［6］Schurman S J，Bergstrom W H，Shoemaker L R，et al.AngiotensinⅡreduces calcium uptake into bone［J］.Pediatr Nephrol，2004，19(1):33-5.

［7］Hatton R，Stimpel M，Chambers T J.Angiotensin Ⅱ is generated from angiotensin I by bone cells and stimulates osteoclastic bone resorption in vitro［J］.J Endocrinol，1997，152(1):5-10.

［8］Tang L Y，Kimmel D B，Jee W S，et al.Functional characterization of prostaglandin E2inducible osteogenic colony forming units in cultures of cells isolated from the neonatal rat calvarium［J］.J Celllul Physiol，1996，166(1):76-83

［9］Chyun Y S，Raisz L G.Stimulation of bone formation by prostaglandin E2［J］.Prostaglandins，1984，27(1):97-103.

［10］Hakeda Y，Nakatani Y，Hiramatsu M，et al.Inductive effects of prostaglandins on alkaline phosphatase in osteoblastic cells，clone MC3T3-E1［J］.J Biochem(Tokyo)，1985，97(1):97-104.

［11］Raisz L G，F(xiàn)all P M，Gabbitas B Y，et al.Effects of prostaglandin E2on bone formation in cultured fetal rat calvariae:role of insulinlike growth factor-I［J］.Endocrinology，1993，133(4):1504-10.