李新尚 馮錦虹 林 靜 趙 今

沒食子作為維吾爾藥防齲特色和代表藥物之一，有其獨(dú)特的療效，在新疆民間被百姓做為預(yù)防齲病的常用藥物，以往防齲作用的研究多采用簡(jiǎn)單的湯、丸、散和膏等粗糙劑型，而現(xiàn)有的一些研究不夠系統(tǒng)深入，尚未得到認(rèn)可和廣泛應(yīng)用。本研究組前期的研究表明沒食子主要化學(xué)成分—沒食子鞣質(zhì)及其有效提取物可以有效抑制變形鏈球菌的生長(zhǎng)，抑制齲病的發(fā)展，其毒副作用較氟化物輕微，有望成為一種新型防齲藥物[1]。牙齒脫礦的過程是致齲的重要方面，目前其在礦化領(lǐng)域研究尚未見報(bào)道，本研究的目的是通過掃描電鏡觀察維藥沒食子對(duì)牙釉質(zhì)表面的礦化作用，探討沒食子在礦化方面防齲的作用機(jī)制，為沒食子的臨床應(yīng)用研究奠定理論和實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

1.材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料 沒食子(Aleppo gall)(由新疆哈博維藥廠提供)，熒光光度計(jì)(RF-5301pc型，日本島津公司)，控溫磁力攪拌器(85-2型，江蘇金壇市醫(yī)療儀器廠)，氟化鈉(天津市達(dá)凈化材料精細(xì)化工廠，分析純)，疊氮鈉(天津市福晨化學(xué)試劑廠，分析純)，氯化鈣(天津市致遠(yuǎn)化學(xué)試劑有限公司，分析純)，硝酸鈣、氫氧化鈉、磷酸二氫鉀、氯化鉀(天津市盛鑫精細(xì)化工有限公司，分析純)，醋酸(天津市永昴精細(xì)化工有限公司，分析純)、HEPES(solarbio)，PH調(diào)節(jié)計(jì)(PB-10型，sartorius)，體視顯微鏡(Nikon，日本)，超聲波清洗機(jī)(KQ-200KDE型，昆山市超聲儀器有限公司)。

1.2 釉質(zhì)的預(yù)備 選擇新鮮拔除的牛切牙，除去表面有機(jī)污染物，分離冠根，冠部超聲清洗，干燥，體視顯微鏡下觀察無齲損、氟斑、裂痕。用硬組織切割機(jī)將牙冠切成10mm×10mm×2 mm大小的釉質(zhì)塊，唇面釉質(zhì)用拋光機(jī)及碳化硅砂紙?jiān)诹魉乱来文テ?、拋光。選擇釉質(zhì)塊120個(gè)，超聲清洗，自然干燥，釉質(zhì)塊表面開窗9mm×9mm大小，其余部位涂布兩層抗酸指甲油。將120個(gè)釉質(zhì)樣本隨機(jī)分為脫礦實(shí)驗(yàn)組和再礦化實(shí)驗(yàn)組，每組各60例。脫礦液及再礦化液具體配置如下，脫礦液：2.2mmol/LCa(NO3)2，2.2mmol/LKH2PO4、50mmol/L醋酸，1.0mmol/L NaN3，0.1mg/L NaF，用5mol/L的KOH調(diào)至pH為4.5。再礦化 液 :1.5mmol/L CaCl2，0.9mmol/L KH2PO4，130mmol/L KCl，1mmol/L NaN3，20mmol/L HEPES，pH=7.0。

1.3 脫礦實(shí)驗(yàn) 將預(yù)備好的60例釉質(zhì)標(biāo)本用嵌體蠟固定在自制的環(huán)形玻棒上，放入盛有脫礦溶液的玻璃器皿中，設(shè)置釉質(zhì)表面與溶液的比20mm2/10ml，磁攪拌儀攪拌(100r/min)，60個(gè)釉質(zhì)樣本，隨機(jī)分為3組(20個(gè)/組)，設(shè)為氟化鈉組(陽性對(duì)照)、沒食子組、去離子水組(陰性對(duì)照)，將各組標(biāo)本放入脫礦液中，加入各組干預(yù)藥物，觀察各組藥物對(duì)脫礦過程的影響作用。通過MIC實(shí)驗(yàn)，設(shè)置沒食子和去離子水濃度為4mol/L，氟化鈉濃度1mol/L，37℃脫礦作用3d。脫礦前后均選取樣本做掃描電鏡觀察，分析藥物作用效果的差異。

1.4 再礦化實(shí)驗(yàn) 首先將，牛牙樣本制備為人工齲標(biāo)本，具體方法為將預(yù)備好的60例釉質(zhì)標(biāo)本用嵌體蠟固定在自制的環(huán)形玻棒上，放入盛有脫礦溶液的玻璃器皿中，釉質(zhì)表面與溶液的比率為20mm2/10ml，磁攪拌儀攪拌(100r/min)，37℃脫礦3天，形成人工齲樣本。

隨后將人工齲樣本后隨機(jī)分為3組(20個(gè)/組)，即:氟化鈉組(陽性對(duì)照)、沒食子組，去離子水組(陰性對(duì)照)。沒食子和去離子水濃度為4mol/L，氟化鈉濃度為 1mol/L，再礦化液用2mol/LNaOH將pH調(diào)至7.0.然后各組分別進(jìn)行pH循環(huán)實(shí)驗(yàn)，共循環(huán)12d，其每天的具體方案[2]見附表。

附表 再礦化pH循環(huán)實(shí)驗(yàn)方案

2.結(jié)果

2.1 脫礦組掃描電鏡觀察 由電鏡圖可見，正常牙齒表面較為平整(圖1)，去離子水干預(yù)脫礦后，牙齒表面凹凸不平(圖2)，氟化鈉處理后，可見牙齒表面雖有不平但可見細(xì)密的顆粒(圖3)。沒食子處理后，表面也可見細(xì)密的顆粒(圖4)。電鏡圖示去離子水不具有抑制釉質(zhì)脫礦的作用，氟化鈉及沒食子能使脫礦釉質(zhì)表面顆粒再附著，具有抑制脫礦的作用。

2.2 再礦化組掃描電鏡觀察 掃描電鏡結(jié)果顯示，正常釉質(zhì)表面較為平坦(圖5)。經(jīng)脫礦后形成人工齲模型可見表面大小不等的凹坑(圖6)。在人工齲的基礎(chǔ)上，經(jīng)氟化鈉干預(yù)的再礦化循環(huán)后，可見細(xì)密的顆粒附著，牙齒表面較為平坦(圖7)。經(jīng)沒食子作用的再礦化循環(huán)后，可見顆粒附著，牙面已恢復(fù)較為平整，沒食子有著色作用，電鏡片顏色較為發(fā)暗(圖8)。經(jīng)去離子水作用的再礦化循環(huán)后，可見牙面較脫礦后圖平整度有所恢復(fù)，凹坑變小(圖9)。電鏡圖片顯示氟化鈉及沒食子具有促進(jìn)再礦化作用，但外觀不如氟化物組那樣規(guī)則、均勻(圖 7-8)。

圖1 正常牙釉質(zhì)表面電鏡圖

圖2 去離子水干預(yù)后脫礦釉質(zhì)表面電鏡圖

圖3 氟化鈉干預(yù)脫礦后釉質(zhì)表面電鏡圖

圖4 沒食子干預(yù)脫礦后釉質(zhì)表面電鏡圖

圖5 正常牙釉質(zhì)表面電鏡圖

圖6 脫礦后牙釉質(zhì)表面電鏡圖

圖7 氟化鈉作用于PH循環(huán)后電鏡圖

圖8 沒食子作用于PH循環(huán)后電鏡圖

圖9 去離子水作用于PH循環(huán)后電鏡圖

3.討論

齲病已被公認(rèn)為世界上一種最常見的慢性感染性疾病[3]。世界衛(wèi)生組織已將其列為僅次于心血管疾病和腫瘤，位居危害人類的第三位疾病。如何尋找有效地、毒副作用輕微的防齲藥物，逐漸成為研究的熱點(diǎn)。沒食子屬于新疆本土天然藥物，取材方便、價(jià)格低廉，前期研究證實(shí)其對(duì)變形鏈球菌有抑制作用[4]。實(shí)驗(yàn)從該藥礦化領(lǐng)域角度進(jìn)行研究，如果明確藥物療效，將會(huì)推動(dòng)沒食子走向臨床，造福于廣大的齲病患者。本實(shí)驗(yàn)采用新鮮的離體牛牙作為人牙的替代者，因?yàn)榕Ｑ酪撰@取、其結(jié)構(gòu)與理化性質(zhì)與人牙非常接近，用它代替人牙已經(jīng)成為國(guó)內(nèi)外學(xué)者廣為接受的選擇[5]。實(shí)驗(yàn)前期研究發(fā)現(xiàn)沒食子對(duì)致齲密切的變形鏈球菌具有一定的抑制作用[6]，本實(shí)驗(yàn)采用體外脫礦及再礦化化學(xué)模型—pH循環(huán)，模擬了受致齲因素作用，釉質(zhì)周圍pH值迅速下降，隨后在唾液緩沖系統(tǒng)中緩慢回升的過程[7]。較為真實(shí)的再現(xiàn)了口內(nèi)環(huán)境。

牙齒每天都在進(jìn)行脫礦和再礦化的過程，保持一個(gè)動(dòng)態(tài)平衡。平衡一旦打破，將會(huì)導(dǎo)致牙體硬組織脫礦的加重或減輕[8]。脫礦是由于菌斑下的致齲菌在代謝過程中產(chǎn)酸，造成局部微環(huán)境的pH值下降，導(dǎo)致硬組織脫礦，羥磷灰石晶體溶解破壞，無機(jī)鈣、磷移出所致[9]。再礦化是鈣、磷和其它礦物離子沉積于正?；虿糠置摰V的牙釉質(zhì)內(nèi)或釉質(zhì)表面的過程。在此過程中，如果脫礦占主導(dǎo)作用，將會(huì)導(dǎo)致牙體硬組織缺損。反之，如果再礦化占主導(dǎo)作用，牙體硬組織處于一個(gè)被修復(fù)的過程。藥物只要對(duì)脫礦過程有抑制或?qū)υ俚V化過程有促進(jìn)作用，那么這個(gè)藥物就對(duì)牙體礦化方面有積極作用，進(jìn)而抑制齲病的發(fā)生發(fā)展。實(shí)驗(yàn)采用掃描電鏡觀察結(jié)果證實(shí)在脫礦試驗(yàn)中，相同的脫礦條件下，氟化鈉及沒食子作用后牙表面可見明顯的顆粒附著，去離子水未見，說明源于氟化鈉及沒食子具有抑制釉質(zhì)脫礦的作用。再礦化實(shí)驗(yàn)中，氟化鈉、沒食子、去離子水作用后，牙體表面平整度都有不同程度的恢復(fù)。去離子水作為陰性對(duì)照，本身不具有再礦化的作用，牙體表面較脫礦后有所恢復(fù)，說明是單純?cè)俚V化液的作用，沒食子及氟化鈉明顯優(yōu)于去離子水，沒食子顆粒沉積的平整度較氟化鈉略差一點(diǎn)，兩者圖片非常接近。兩實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致，說明沒食子對(duì)釉質(zhì)礦化效果較氟化鈉接近，是氟化鈉良好的替代藥物。

目前關(guān)于藥物防齲現(xiàn)有研究，其抑齲的機(jī)制均不甚明了。通過掃描電鏡觀察維藥沒食子，從形態(tài)學(xué)角度證實(shí)了其在礦化方面的積極作用。但其產(chǎn)生、發(fā)展的機(jī)制仍不清楚，通過實(shí)驗(yàn)觀察，其再礦化及脫礦抑制主要發(fā)生在表層和表層下,故推測(cè)沒食子礦化的作用機(jī)制可能是鞣酸與溶液中的鈣離子發(fā)生反應(yīng)形成絡(luò)合物,通過釉質(zhì)表面微孔道滲透進(jìn)齲損內(nèi)部,促進(jìn)鈣離子沉積,從而引導(dǎo)部分溶解晶體增長(zhǎng)促進(jìn)了再礦化及抑制脫礦，尚需進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)加以證實(shí)。

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