曹國振， 左婉紅， 馬文波， 李 媛， 葉文才， 朱林燕， 徐 兵， 王立偉△， 陳麗新△

(暨南大學1醫(yī)學院，2藥學院，廣東 廣州 510632；3南方醫(yī)科大學南方醫(yī)院血液科, 廣東 廣州 510515)

人急性淋巴細胞白血病細胞容積激活性氯電流的研究*

曹國振1▲， 左婉紅1▲， 馬文波1， 李 媛1， 葉文才2， 朱林燕1， 徐 兵3， 王立偉1△， 陳麗新1△

(暨南大學1醫(yī)學院，2藥學院，廣東 廣州 510632；3南方醫(yī)科大學南方醫(yī)院血液科, 廣東 廣州 510515)

目的研究人急性淋巴細胞白血病細胞系(Molt4細胞)容積激活性氯電流。方法采用膜片鉗全細胞方式記錄細胞外低滲液(160 mOsmol/L)激活的Molt4細胞容積激活性氯電流，分析該電流的特性。結(jié)果Molt4細胞在等滲溶液中背景電流較小且穩(wěn)定，低滲溶液誘導激活容積激活性氯電流，該電流呈現(xiàn)較明顯的外向優(yōu)勢，在鉗制電壓0 mV～±120 mV及脈沖波寬200 ms條件下，沒有觀察到明顯的電壓依賴性失活和時間依賴性失活。該電流具有容積敏感性，可被細胞外高滲刺激所抑制。氯通道阻斷劑他莫昔芬顯著抑制容積激活性氯電流, 對內(nèi)向電流和外向電流的抑制作用無顯著差異。結(jié)論Molt4細胞膜存在容積敏感性氯通道；低滲刺激可激活該通道產(chǎn)生容積激活性氯電流；該通道對氯通道阻斷劑他莫昔芬敏感。

氯通道； Molt4細胞系； 膜片鉗術(shù)

調(diào)節(jié)性細胞容積減小(regulatory volume decrease, RVD)是指細胞在低滲刺激時, 細胞發(fā)生膨脹、容積增大激活了細胞的容積調(diào)節(jié)功能,導致胞內(nèi)的溶質(zhì)(主要是離子)及水份外流,使已膨脹的細胞容積向正常容積轉(zhuǎn)化的過程。在這個過程中可以激活氯通道開放并產(chǎn)生容積激活性氯電流。我們前文報道細胞容積調(diào)節(jié)廣泛參與多種細胞的生理活動，并研究了容積激活性氯電流在細胞容積調(diào)節(jié)中的作用[1-4]。目前人們對血液細胞容積激活性氯電流的作用及特點尚不十分清楚。本實驗以人急性淋巴細胞白血病細胞系Molt4細胞作為研究對象，通過降低細胞外滲透壓使細胞發(fā)生低滲性腫脹，觀察容積激活性氯電流的變化，并分析其特性，這有助于了解淋巴細胞氯通道在細胞容積調(diào)節(jié)中的作用，并為以后深入了解氯通道在白血病細胞增殖及凋亡中的作用奠定基礎(chǔ)。

材 料 和 方 法

1細胞培養(yǎng)

人急性T 淋巴細胞白血病細胞株Molt4培養(yǎng)于10 %新生牛血清、1×105U/L 青霉素和 100 mg/L 鏈霉素的RPMI- 1640(Roswell Park Memorial Institute-1640) 培養(yǎng)液中， 于5%CO2、飽和濕度、37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每2 d傳代1次。取對數(shù)生長期細胞，將細胞懸液接種在包被多聚賴氨酸的玻片上，待細胞貼壁1 h后進行實驗。

2主要試劑及溶液

等滲灌流液(isotonic solution，Iso)含(mmol/L):70 NaCl, 0.5 MgCl2,2 CaCl2, 10 HEPES和140 D - 甘露醇。用D - 甘露醇調(diào)節(jié)滲透壓至300 mOsmol/L。低滲灌流液(47% hypotonic solution)滲透壓為160 mOsmol/L，除不含D - 甘露醇外，其它成分和濃度與等滲液相同，因為該液體滲透壓(160 mOsmol/L)比等滲液滲透壓(300 mOsmol/L)低47%，故又稱47%低滲液(47% hypotonic solution)。高滲灌流液滲透壓為440 mOsmol/L, 比等滲液滲透壓高47%，又稱47% 高滲液(47% hypertonic solution)。除溶液中D -甘露醇為280 mmol/L 外,余同等滲液。各灌流液分別用Tris(三羥甲基氨基甲烷)液調(diào)pH 至7.4。在離子置換實驗中，低滲液中的氯化鈉被等量的葡萄糖酸鈉或碘化鈉置換。電極內(nèi)液含(mmol/L):70 N -methyl - D - glucamine chloride(NMDG - Cl) , 1.2 MgCl2, 10 HEPES, 1 EGTA, 140 D - 甘露醇 和2 ATP。用Tris調(diào)至pH 7.25, 滲透壓調(diào)至300 mOsmol/L。用冰點滲透壓計(Osmomat030, Gonotec) 檢測各溶液滲透壓。RPMI-1640、小牛血清、胰蛋白酶購自Gibco。他莫昔芬(tamoxifen) 購自Sigma, 實驗當天用甲醇將他莫昔芬配制成50 mmol/L原液，在臨用前用灌流液稀釋至所需濃度。

3單個白血病細胞容積激活性氯電流的記錄

采用全細胞膜片鉗方式記錄細胞氯電流。用EPC - 7 膜片鉗放大器(List Electronic)記錄單個的Molt4細胞全細胞電流。使用外徑為1.5 mm 、內(nèi)徑為0.86 mm的硼硅酸鹽毛細玻璃管,在微電極拉制器( PB - 7)上分兩步拉制微電極。微電極充灌電極內(nèi)液后尖端電阻5 - 10 MΩ。電流和電壓信號用CED 1401( Cambridge)數(shù)字化( 采樣頻率3kHz), 實驗數(shù)據(jù)用EPC(CED, Cambridge) 軟件分析。電壓鉗制模式有2 種：(1)細胞被鉗制在0、-40、+40、-80、+80 mV，并不斷反復循環(huán)，每個鉗制脈沖波寬200 ms，間隔4 s，在每個鉗制脈沖開始10 ms 后取值；(2)鉗制電壓-120 mV～120 mV，步增20 mV，每個鉗制脈沖波寬300 ms。實驗時細胞玻片安放在灌流槽中,為適應(yīng)灌流環(huán)境，預先用等滲液灌流細胞5 min, 然后記錄細胞在等滲灌流液中的背景電流，用細胞外灌流47%低滲液的方法，誘導并記錄全細胞容積激活性氯電流的變化。當容積激活性氯電流達到最大值并穩(wěn)定時，在灌流液中加入氯通道阻斷劑他莫昔酚，等待氯電流達到最小值并平穩(wěn)，計算電流抑制率。所有實驗在室溫下(20- 24 ℃)進行。

計算氯通道阻斷劑對全細胞電流抑制率公式:抑制率(%) = [(Chypotonic solution-Cisotonic solution)-(Ctamoxifen-Cisotonic solution)] /(Chypotonic solution-Cisotonic solution)×100%。其中Chypotonic solution:灌流47%低滲液電流峰值； Cisotonic solution: 灌流等滲液時背景電流； Ctamoxifen:加入阻斷劑他莫昔芬后的全細胞容積激活性電流值。

4統(tǒng)計學處理

結(jié) 果

1低滲刺激誘導的Molt4細胞氯電流

細胞被鉗制在0 mV, 以0 mV、±40 mV和±80 mV順序循環(huán)往復, 每一電位持續(xù)200 ms, 兩電位之間間隔4s。在等滲條件下，背景電流較小而且相對穩(wěn)定。然而，當細胞受到47%低滲刺激時，在(59.12±11.01) s氯電流開始增大( 圖1A )，該電流在3-5 min內(nèi)達到峰值，然后保持相對穩(wěn)定，電流最大值比背景電流增大約50-60倍。

Figure 1. Chloride currents activated by the hypotonic bath solution in Molt4 cells.A:the typical time course of current recordings;B:the typical current traces at the maximal activation in hypotonic solutions. Iso: isotonic bath solution; Hypo:47% hypotonic bath solution;Hyper: 47% hypertonic bath solution. Membrane potentials were repeatedly clamped at 0,±40 and±80 mV in A and between -120 and +120 mV in 20 mV steps in B, respectively.

2Molt4細胞容積激活性氯電流的特性

在鉗制電壓±120 mV、鉗制脈沖波寬300 ms時, 低滲刺激誘導的Molt4細胞氯電流沒有出現(xiàn)明顯的電壓依賴性失活和時間依賴性的失活,見圖1B。如圖2所示，低滲刺激誘導的氯電流的外向電流較大[(122.66 ±19.90)pA/pF，+80 mV]，而內(nèi)向電流較小[(-88.11±18.35)pA/pF，-80 mV],表現(xiàn)為較明顯的外向優(yōu)勢(Plt;0.01)。該電流的翻轉(zhuǎn)電位為(-2.30± 0.37) mV, 接近本實驗條件氯離子平衡電位理論值(-0.9 mV)。

進一步研究發(fā)現(xiàn)，低滲激活的氯通道是容積敏感性的。當容積激活性氯電流達到峰值并平穩(wěn)后，將細胞外的47%低滲溶液置換為47%高滲溶液, 電流迅速減小，見圖1A。

3氯通道阻斷劑抑制Molt4細胞容積激活性氯電流

結(jié)果顯示，細胞外灌流他莫昔酚(20 μmol/L)顯著抑制47%低滲液激活的Molt4全細胞氯電流,見圖3A，他莫昔酚作用前后細胞氯電流有顯著差異(Plt;0.01)，見圖3B、3C。在鉗制電壓為-80 mV時，他莫昔酚對內(nèi)向電流的抑制率達75.66%±6.15%(Plt;0.01)，在鉗制電壓為+80 mV時，抑制外向電流達78.11%±6.56%(Plt;0.01)。他莫昔酚對內(nèi)向電流的抑制作用和對外向電流的抑制作用無顯著差異(Pgt;0.05)，見圖4。他莫昔芬對電流的抑制是可逆的，去除灌流液中的他莫昔芬，容積激活性氯電流部分恢復。

Figure 2. Current-voltage relationship of volume-activated chloride currents in Molt4 cells±s.n= 19.**Plt;0.01 vs isotonic solution. Iso: isotonic solution; Hypo: 47% hypotonic solution.

Figure 3. Inhibition of the hypotonicity-activated chloride current by the chloride channel blocker tamoxifen in Molt4 cells. Iso: isotonic solution; Hypo: 47% hypotonic solution.A:the typical time course of current recordings;B and C:the current traces at the maximal activation in hypotonic solutions and after treatment with tamoxifen,respectively. Membrane potentials were repeatedly clamped at 0,±40 and±80 mV.

Figure 4. The effects of tamoxifen on the outward(at +80 mV) and inward(at -80 mV) currents activated by the hypotonic bath solution in Molt4 cells±s.n=5.**Plt;0.01 vs control.

4容積激活性氯通道的離子選擇性

當?shù)蜐B激活的氯電流達到最大并平穩(wěn)后，將含70 mmol/L 氯化鈉的低滲灌流液換成含等量葡萄糖酸鈉或碘化鈉的低滲液。結(jié)果顯示，低滲液中的氯化鈉被葡萄糖酸鈉置換后，電流減小，基線下移，見圖5A,而低滲液中的氯化鈉被碘化鈉置換后，電流增大，基線上移(未顯示結(jié)果)。分析所記錄的結(jié)果表明，Molt4細胞容積激活性氯通道對碘離子和葡萄糖酸離子的相對通透性(PI/PCl、Pgluconate/PCl；設(shè)定PCl為1)分別為1.05±0.05(Plt;0.05)和0.31±0.05(Plt;0.01)，即此通道對陰離子通透性的大小為碘離子gt; 氯離子gt;葡萄糖酸離子，見圖5B。

Figure 5. Anion permeability of volume- activated chloride channels in Molt4 cells±s.n=5.*Plt;0.05, **Plt;0.01 vs Cl-. Hypo: 47% hypotonic solution.

討 論

分布在血液中的血液細胞，能直接感受血液滲透壓的變化，血液滲透壓的微小變化可能導致細胞發(fā)生滲透性容積變化，低滲使細胞膨脹，高滲致細胞皺縮，細胞須有較強的容積調(diào)節(jié)能力，才能維持本身正常的形態(tài)和體積。細胞在受到低滲刺激發(fā)生膨脹而激活容積調(diào)節(jié)功能,導致胞內(nèi)的溶質(zhì)(主要是離子)及水外流,使已膨脹的細胞容積回縮，向正常容積轉(zhuǎn)化。在這個過程中，氯通道開放起重要作用，滲透性容積增大可以激活氯通道開放而產(chǎn)生氯電流，即容積激活性氯電流。Nilius等[5]很早在內(nèi)皮細胞記錄到了低滲激活的氯通道電流,發(fā)現(xiàn)該電流可明顯減輕細胞在低滲刺激下腫脹的程度。到目前為止, 容積激活性氯通道已被證實廣泛分布在多種哺乳動物的細胞膜上。容積激活性氯通道在細胞容積調(diào)節(jié)中起重要作用。

本實驗通過全細胞膜片鉗記錄方法，探討了人急性淋巴細胞白血病細胞系Molt4細胞在低滲刺激下容積激活性氯電流的特性。結(jié)果表明， Molt4細胞膜有容積敏感性氯通道，可被細胞外低滲刺激激活和被高滲刺激抑制。當細胞接受低滲刺激而膨脹時，細胞膜上的氯通道開放，氯離子外流，相反，當細胞處于高滲環(huán)境中而皺縮時，細胞膜氯通道關(guān)閉，氯離子外流減少。表明在低滲刺激時氯離子外流伴隨水外流，而使?jié)q大的細胞容積趨于減小。而在高滲刺激時氯離子和水外流減少而使細胞容積趨于增大。Molt4細胞膜上的容積激活性的氯電流呈現(xiàn)明顯的外向優(yōu)勢，沒有明顯的時間依賴性失活和電壓依賴性失活。Molt4細胞膜容積激活性氯通道對氯通道阻斷劑他莫昔芬很敏感，他莫昔芬可以阻斷已開放的氯通道，顯著抑制容積激活性氯電流, 對內(nèi)向電流和外向電流的抑制作用無顯著差異。另外， Molt4細胞膜容積激活性氯通道對陰離子的通透性為碘離子gt;氯離子gt;葡萄糖酸離子。結(jié)果表明，Molt4細胞氯通道的特性與其它種類細胞相似，然而其容積敏感性氯電流的產(chǎn)生在幾分鐘后才能達到峰值，這提示Molt4細胞對低滲刺激的敏感性似乎低于其它種類細胞[6],其細胞膜上的氯通道需要較長時間或者較大的容積變化才能被充分激活。

細胞膜的氯通道參與細胞的多種生理活動，如細胞容積調(diào)節(jié)、細胞周期、增殖、凋亡和遷移等[7,8]，某些抗癌藥物誘導的腫瘤細胞凋亡中有氯通道的參與。阻斷氯通道可以降低細胞容積的調(diào)節(jié)能力，干擾細胞的功能[8]，阻斷氯通道可以不同程度地逆轉(zhuǎn)某些抗癌藥物對細胞誘導凋亡的作用[9]。

研究容積敏感性氯通道的特點和機制不僅有助于我們很好地理解生理狀況下細胞容積調(diào)節(jié)的機制，有助于更好地理解抗癌藥物的作用機制，而且有助于尋找腫瘤治療的新靶點。

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Volume-activatedchloridecurrentsinhumanacutelymphoblasticleukemiaMolt4cells

CAO Guo-zhen1, ZUO Wan-hong1, MA Wen-bo1, LI Yuan1, YE Wen-cai2, ZHU Lin-yan1, XU Bing3, WANG Li-wei1, CHEN Li-xin1

(1SchoolofMedicine,2CollegeofPharmacy,JinanUniversity,Guangzhou510632,China;3DepartmentofHematology,SouthernMedicalUniversityNanfangHospital,Guangzhou510515,China.E-mail:wangliweic@sohu.com;chenlixinw@sohu.com)

AIM: To characterize the chloride current activated by extracellular hypotonic stress in human acute lymphoblastic leukemia Molt4 cells.METHODSThe technique of whole-cell patch clamp recording was used to detect the volume-activated Cl-current in Molt4 cells. The characteristics of the current were investigated.RESULTSThe background Cl-current was weak and stable under isotonic condition. However, a large Cl-current was induced by exposure of the cells to 47% hypotonic solution. The current showed a characteristic of outward rectification. No voltage-dependent inactivation and time-dependent inactivation were observed. The current was sensitive to the change of cell volume and was inhibited by extracellular hypertonic solution. Extracellular tamoxifen, which is one of the chloride channel blockers, significantly inhibited the current. The effects of tamoxifen were almost equal for both inward and outward currents (Pgt;0.05).CONCLUSIONThere are volume-activated chloride channels on the cell membrane of Molt4 cells. Exposure of the cells to a hypotonic solution activates the chloride channels and induces a volume-activated chloride current. The volume-activated Cl-channels are sensitive to tamoxifen in Molt4 cells.

Chloride channels; Molt4 cell line; Patch-clamp techniques

1000-4718(2011)04-0677-05

R733.71

A

10.3969/j.issn.1000-4718.2011.04.11

2010-12-14

2011-02-28

國家自然科學基金資助項目(No.30771106;No.30870567; No.30871267;No.90913020;No.U0932004); 廣東省自然科學基金資助項目(No. 07005974)

△通訊作者 王立偉 Tel: 020-85220260;E-mail: wangliweic@sohu.com;陳麗新 Tel: 020-85228865;E-mail: chenlixinw@sohu.com

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