鄧志匯，崔堂兵

（1.華南理工大學(xué)輕工與食品學(xué)院，廣東廣州510640；2.華南理工大學(xué)生物科學(xué)與工程學(xué)院，廣東廣州510006）

利用活性真菌轉(zhuǎn)化簡單兒茶素為酯型兒茶素

鄧志匯1，崔堂兵2

（1.華南理工大學(xué)輕工與食品學(xué)院，廣東廣州510640；2.華南理工大學(xué)生物科學(xué)與工程學(xué)院，廣東廣州510006）

研究從茶樹的鮮葉、莖部和茶樹土壤中分離出活性真菌，通過利用天然微生物的轉(zhuǎn)化能力，使簡單兒茶素轉(zhuǎn)化為功能性較強(qiáng)的復(fù)雜型酯型兒茶素。實驗結(jié)果表明：篩選出了具有轉(zhuǎn)化能力的活性菌種，能有效地將簡單兒茶素轉(zhuǎn)化為酯型兒茶素，而且其轉(zhuǎn)化能力良好。并對此種活性真菌進(jìn)行形態(tài)學(xué)和生理生化的初步檢測，判斷其屬于絲狀真菌藻狀菌綱，毛霉目，內(nèi)囊霉科，內(nèi)囊霉屬。

簡單兒茶素，酯型兒茶素，活性真菌，生物轉(zhuǎn)化

茶葉中的主要功能成分是兒茶素類，兒茶素包括簡單兒茶素和酯型兒茶素。酯型兒茶素是一種具有較強(qiáng)保健功能的物質(zhì)，是茶多酚的主要成分，約占綠茶兒茶素類總量的10%～15%。它對人類健康有著積極的作用，如抗氧化、抗菌、抗腫瘤、抗病毒、抑制低密度脂蛋白與血糖上升等功效。由于這些保健功能，酯型兒茶素經(jīng)濟(jì)價值比較高。但是目前國內(nèi)外從茶多酚中提取酯型兒茶素所采用的化學(xué)萃取方法存在得率不高、費時、純度不理想、化學(xué)污染大等問題。相比之下，微生物轉(zhuǎn)化法具有微生物資源豐富、種類繁多、底物特異性強(qiáng)的優(yōu)點。據(jù)國內(nèi)外報道，一些真菌具有一定的生物轉(zhuǎn)化作用，而茶樹的茶葉、莖和根部土壤中存在一些內(nèi)生真菌，能把其他的兒茶素類轉(zhuǎn)化成為酯型兒茶素。因此，本研究擬從茶樹根際土壤、樹葉和莖中分離得到真菌，以簡單兒茶素作為底物在一定條件下轉(zhuǎn)化得到價值較高的酯型兒茶素，從而為制備酯型兒茶素提供一條新的手段［1-3］。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

綠茶 八馬鐵觀音韻香一號品種，福建省安溪；硫酸慶大霉素注射液 廣東三才醫(yī)藥集團(tuán)有限公司；沒食子酸、焦性沒食子酸 均為分析純。

薄層層析硅膠板 規(guī)格：25mm×75mm，厚度：0.20～0.25mm，青島海洋化工廠公司；超聲波細(xì)胞破碎儀 美國SONICS公司；SHP-450D型全自動新型生化培養(yǎng)箱 上海森信實驗儀器有限公司；NSKY-200B全溫培養(yǎng)振蕩器 上海蘇坤實業(yè)有限公司；QHZ-984恒溫?fù)u床 倉市華利達(dá)實驗設(shè)備有限公司；centrifuge 5804R臺式超速大型容量離心機(jī) eppendorf。

1.2 實驗方法

1.2.1 內(nèi)生菌的分離及純化 茶樹鮮葉處理：茶樹的鮮葉先用75%的酒精清洗，然后用無菌水漂洗5次，把酒精沖洗干凈。再把茶葉放進(jìn)研缽研磨成漿，取1mL的研磨液，加已裝有9mL無菌水的試管中，得到10-1的鮮葉樣品。再從其中取1mL加入含有9mL無菌水的試管，得到10-2的鮮葉樣品。用同樣方法制備，得到10-3的茶葉樣品［4］。分別向已經(jīng)制好的PDA培養(yǎng)基中滴入2～3滴硫酸慶大霉素注射液，用接種耙將上述樣品均勻涂布至培養(yǎng)基的表面。最后將得到的三個樣品采用劃斜線分離菌種的方法，接種至含有硫酸慶大霉素的PDA培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿之中，28℃培養(yǎng)5～7d。

茶樹的莖樣品的處理：剪取一段茶樹莖部，用75%的酒精清洗，然后用無菌水漂洗5次，把酒精沖洗干凈，切成5～6小段。分別向已經(jīng)制作好的PDA培養(yǎng)基滴入2～3滴硫酸慶大霉素注射液，用接種耙將上述樣品均勻涂布至培養(yǎng)基的表面。最后將切分好的小莖分為兩份，分別放到含有硫酸慶大霉素的PDA培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿之中，28℃培養(yǎng)3～5d。

茶樹的根際土壤的處理：首先使其充分溶于含有100mL無菌水的錐形瓶當(dāng)中，然后在錐形瓶中取1mL的液體加入含有9mL無菌水的試管，得到10-1的土壤樣品。再從10-1的茶葉樣品中取1mL加入含有9mL無菌水的試管，得到10-2的土壤樣品。同樣的方法分別得到10-3、10-4、10-5的土壤樣品。接下來的步驟與茶樹葉片的處理方法一樣［5］。

待內(nèi)生菌培養(yǎng)出來以后，根據(jù)其形態(tài)大小的差異，進(jìn)行分離純化。具體方法是，將培養(yǎng)好的內(nèi)生菌分類，把不同的菌體分別接入試管斜面（PDA培養(yǎng)基，28℃）進(jìn)行培養(yǎng)純化。若在試管斜面培養(yǎng)中出現(xiàn)不同的菌體，則再將兩種不同的菌體接入兩個不同的試管斜面中繼續(xù)培養(yǎng)，直到得到純化的菌種為止。

1.2.2 茶多酚粗提物的提取 采用超聲波提取法：首先將樣品茶葉用食物攪拌機(jī)粉碎成為細(xì)小顆粒，過100目的篩網(wǎng)，再將篩選后的顆粒，按1∶45的料液比配制成溶液。用超聲波細(xì)胞破碎儀80Hz粉碎15min，在10000r/min，4℃的條件下離心10min，取上清液［6］。

1.2.3 酯型兒茶素的轉(zhuǎn)化 將配制好的沙氏培養(yǎng)液20mL加入100mL的三角瓶中，加入1mL沒食子酸和1mL焦性沒食子酸，再加入茶多酚底物，將pH調(diào)至4.5，121℃ 30min消毒［7］。

在無菌操作的條件下，分別將已經(jīng)純化好的菌種接種至上述100mL的三角瓶當(dāng)中。以不接菌種作為對照。把三角瓶全部放置在搖床中用28℃，160r/min培養(yǎng)5～7d。

1.2.4 兒茶素轉(zhuǎn)化的薄層層析 轉(zhuǎn)化結(jié)束后，離心（4500r/min，10min）分離菌絲體和發(fā)酵液。各菌液分別用30mL氯仿萃取菌絲體和發(fā)酵液，振蕩0.5h，合并萃取液，減壓蒸發(fā)除去溶劑，殘留物用V（氯仿）∶V（甲醇）=1∶1的混合溶媒溶解，移至1.5mL離心管內(nèi)，用于分析。

薄層色譜（TLC）法的精密度足以將本實驗的轉(zhuǎn)化產(chǎn)物迅速分析出來，且操作方便，因此，本實驗采用薄層色譜法進(jìn)行轉(zhuǎn)化產(chǎn)物的分析，將已預(yù)制的硅膠板放至烘箱中用105℃活化1h，再放入干燥器內(nèi)靜置冷卻到室溫后，用上述得到的各種菌種的轉(zhuǎn)化液進(jìn)行點樣，于層析缸中進(jìn)行層析。層析劑：異丁醇∶醋酸∶水=40∶10∶50。層析過程在4℃冰箱中進(jìn)行。層析結(jié)束后取出層析板，用電吹風(fēng)吹干。最后，用碘顯影法進(jìn)行顯色，將碘單質(zhì)固體倒進(jìn)空的層析缸當(dāng)中，把吹干的層析板放進(jìn)去，蓋緊蓋子。利用碘升華的碘蒸氣顯色，待顯影出初步輪廓后取出，在0.1%三氯化鐵溶液中浸泡30s，再用蒸餾水沖干凈。照相并用記號筆標(biāo)出點樣點，計算出各斑點的比移值Rf值，根據(jù)斑點面值的大小，采用統(tǒng)一歸一法計算轉(zhuǎn)化率。

轉(zhuǎn)化率公式如下［8］：

式中：P1為酯型兒茶素在轉(zhuǎn)化液中薄板上的面積；P2為酯型兒茶素在標(biāo)準(zhǔn)品薄板上的面積。

1.2.5 生理生化實驗［9］革蘭氏染色實驗；孢子染色；糖類酵解實驗；尿酶實驗；接觸酶實驗。

1.2.6 形態(tài)學(xué)鑒定活性真菌［10］利用顯微鏡觀察活性菌種和其孢子的生理形態(tài)。

2 結(jié)果與討論

2.1 從茶樹根際土壤、樹葉和莖中分離純化出的內(nèi)生菌

從茶樹根際土壤、樹葉和莖中根據(jù)其生長狀態(tài)的不同（包括顏色、大小、形狀）分離出十幾種樣品，并分別對其進(jìn)行試管斜面的純化培養(yǎng)。

2.2 薄層層析結(jié)果分析

圖1所示，土壤篩選出的菌種將簡單兒茶素轉(zhuǎn)化為酯型兒茶素，其中酯型兒茶素的Rf值為0.259，轉(zhuǎn)化率為22.22%。茶多酚標(biāo)準(zhǔn)品中酯型兒茶素的Rf值為0.246，簡單兒茶素的Rf值為0.75［11］，這證明了菌體轉(zhuǎn)化液中，簡單兒茶素的濃度大大減少了，而酯型兒茶素的濃度有一定程度的增加。說明了菌種利用簡單兒茶素轉(zhuǎn)化成為酯型兒茶素，即是我們所需要的具有強(qiáng)轉(zhuǎn)化能力的活性菌種。

圖1 活性菌種轉(zhuǎn)化效果

在圖2中，土壤篩選出的另一種內(nèi)生菌種也能將簡單兒茶素轉(zhuǎn)化為酯型兒茶素，其中酯型兒茶素的Rf值為0.225，轉(zhuǎn)化率為12.5%。這意味著轉(zhuǎn)化液中簡單兒茶素的濃度變少了，而酯型兒茶素的含量有所增加，所以證明其具有一定的轉(zhuǎn)化能力，但其轉(zhuǎn)化能力不強(qiáng)。這是弱轉(zhuǎn)化菌種。

如圖3所示，對照中不能將簡單兒茶素轉(zhuǎn)化為酯型兒茶素，其中酯型兒茶素的Rf值為0.25，轉(zhuǎn)化率為0.51%。無論簡單兒茶素條帶的面積還是酯型兒茶素條帶的面積與標(biāo)準(zhǔn)品都沒有明顯區(qū)別，證明其簡單兒茶素的濃度和酯型兒茶素的濃度并沒有太大的變化，故判斷其不具有轉(zhuǎn)化能力。

圖2 弱轉(zhuǎn)化能力菌轉(zhuǎn)化效果

圖3 對照分析

表1 活性菌種、弱轉(zhuǎn)化能力菌種及對照對簡單兒茶素的轉(zhuǎn)化結(jié)果

綜合分析三個菌種，發(fā)現(xiàn)活性菌種的轉(zhuǎn)化能力比較強(qiáng)，轉(zhuǎn)化率為22.22%，而沒接菌種的培養(yǎng)液和轉(zhuǎn)化能力較弱的菌種，其轉(zhuǎn)化率分別只有0.51%和12.5%，遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于活性菌種的轉(zhuǎn)化率。

2.3 生理生化實驗及形態(tài)學(xué)檢測結(jié)果

生理生化的實驗結(jié)果表明活性菌種基本符合真菌的特征（表2）。從PDA培養(yǎng)基的培養(yǎng)菌落形態(tài)可以觀察到，活性菌落類似絲狀真菌，菌種呈白色絨毛狀，中央有絮狀突起邊緣不整齊。成熟的菌種還帶有少許灰色。因此，由菌落形態(tài)推斷出菌種有可能是絲狀真菌。

表2 活性菌種生理生化測試結(jié)果

菌絲和孢子囊孢子在顯微鏡下的觀察結(jié)果見圖4?；钚哉婢木z呈放射性生長，菌絲之間沒有橫膈膜。菌絲分裂出大量的孢子囊孢子，呈圓形或者卵形。孢壁較粗糙，較深色。孢壁單層，孢子與聯(lián)孢壁絲之間具有間隔。而分離出來的孢子囊孢子又直接長出放射性的營養(yǎng)菌絲。產(chǎn)孢子囊孢子的內(nèi)生菌根菌通常處在于根際土壤之中。

根據(jù)活性菌種的在PDA培養(yǎng)基的菌落特征和顯微鏡下的觀察，可得活性菌種是絲狀真菌。查真菌鑒定手冊，可以推斷出藻狀菌綱、毛霉目、內(nèi)囊霉科、內(nèi)囊霉屬。關(guān)于這種具有強(qiáng)轉(zhuǎn)化簡單兒茶素活性的真菌的其他性質(zhì)，包括轉(zhuǎn)化動力學(xué)、發(fā)酵最佳參數(shù)以及毒性方面的研究，有待深入進(jìn)行。

圖4 活性菌種的菌絲

3 結(jié)論

3.1 從茶樹的根際土壤、茶樹的莖葉中分離并純化出十多種顏色、大小和形狀不相同的內(nèi)生菌。

3.2 從茶樹的根際土壤和茶樹的莖葉中分離純化的內(nèi)生菌中篩選出具有轉(zhuǎn)化簡單兒茶素為酯型兒茶素的活性菌種，并具有最大轉(zhuǎn)化率（22.22%）。

3.3 根據(jù)篩選出的活性菌種的生理生化特性，PDA培養(yǎng)的生長形態(tài)和生長狀況還有顯微鏡下活性菌種的菌絲和鏡檢下活性菌體產(chǎn)生的孢子囊孢子的形態(tài)判斷其基本的類型為藻狀菌綱、毛霉目、內(nèi)囊霉科、內(nèi)囊霉屬。

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Microbial transformation of tea epicatechins into epigallocatechin gallate by the active fungi

DENG Zhi-hui1，CUI Tang-bing2
（1.College of Light Industry and Food Sciences，South China University of Technology，Guangzhou 510640，China；2.School of Bioscience and Bioengineering，South China University of Technology，Guangzhou 510006，China）

The research on the transformation of simply tea catechins（epicatechin）into ester type catechins（epigallocatechin gallate）with the selected active fungi from tea fresh leaves，tea stem and the earth around the tea were carried out.The results showed the selected active fungi had the activity of transformation for epicatechins into epigallocatechin gallate.The active fungi was proven as a fungus specie of Phycomycetes Mucorales Endogonaceae and Endogone based on the morphologic physiololgy and biochemical tests.

epicatechin；epigallocatechin gallate；active fungi；microbial transformation

TS201.2

A

1002-0306（2011）02-0169-03

2010-03-12

鄧志匯（1986-），男，碩士研究生，研究方向：食品科學(xué)。

國家863項目（2007AA100404）。