聶世現(xiàn)，王 鈺，*，黃文靜，季必霞，葉亞峰，劉小平

（1.安徽大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，安徽省生態(tài)工程與生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，安徽合肥230039；2.安徽省農(nóng)科院作物研究所，安徽合肥230031）

高產(chǎn)酒精酵母菌株及甘薯品種篩選

聶世現(xiàn)1，王 鈺1，*，黃文靜1，季必霞1，葉亞峰1，劉小平2

（1.安徽大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，安徽省生態(tài)工程與生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，安徽合肥230039；2.安徽省農(nóng)科院作物研究所，安徽合肥230031）

以酒曲中篩選到的酵母菌A4為出發(fā)菌株，用紫外線對其原生質(zhì)體進(jìn)行物理誘變，經(jīng)過三級(jí)篩選得到突變高產(chǎn)菌株A4-20。以麥芽汁為基質(zhì)發(fā)酵72h后，酒精度為4.93%，較出發(fā)菌株提高了28.7%。經(jīng)過連續(xù)轉(zhuǎn)接10代，A4-20的發(fā)酵性能表現(xiàn)穩(wěn)定。用其對6種高淀粉品種甘薯淀粉進(jìn)行發(fā)酵實(shí)驗(yàn)，得出3個(gè)品種的酒精產(chǎn)量均達(dá)14%以上，其中徐薯22酒精產(chǎn)量達(dá)到最高14.87%，出酒率為38.1%，經(jīng)比較，徐薯22、皖薯3號(hào)和199031-1更適合應(yīng)用于酒精產(chǎn)業(yè)。

原生質(zhì)體，紫外線誘變，甘薯，酒精，發(fā)酵

石油是當(dāng)今世界上主要的能源之一，其儲(chǔ)備有限。20世紀(jì)70年代世界范圍發(fā)生石油危機(jī)，使利用可再生的資源（如高淀粉作物）發(fā)酵生產(chǎn)酒精作為生物能源的研究成為人們關(guān)注的焦點(diǎn)。生物能源與石油相比具有可再生、污染率小、減少溫室效應(yīng)等優(yōu)點(diǎn)，能部分或全部代替汽油。目前，燃料酒精的生產(chǎn)占世界酒精總產(chǎn)量的66%，并且還有進(jìn)一步增加的趨勢［1］。發(fā)酵法是酒精生產(chǎn)的重要方法，發(fā)酵法生產(chǎn)酒精的關(guān)鍵是酵母菌株，酒精酵母的優(yōu)劣不僅直接影響發(fā)酵率的高低，而且會(huì)影響酒精的產(chǎn)量和質(zhì)量。我國酒精生產(chǎn)行業(yè)中普遍存在亟待解決的問題是發(fā)酵強(qiáng)度低，生產(chǎn)成本高，能耗大［2］。因此，高產(chǎn)酒精酵母的選育是提高酒精產(chǎn)率，節(jié)約生產(chǎn)能源的關(guān)鍵。我國是世界上最大的甘薯生產(chǎn)國并有著豐富的甘薯種質(zhì)資源，甘薯作為燃料酒精的原材料必將在我國擁有廣闊的市場前景。高淀粉型甘薯品種不一定是高產(chǎn)燃料乙醇型品種。本文探討了酵母菌A4原生質(zhì)體紫外線誘變篩選方法，旨在篩選出發(fā)酵力強(qiáng)、酒精產(chǎn)量高的優(yōu)良酵母菌株，并用此菌株對不同高淀粉品種甘薯淀粉進(jìn)行發(fā)酵實(shí)驗(yàn)，比較各品種間差異，找出更適合應(yīng)用于酒精產(chǎn)業(yè)的燃料乙醇型甘薯品種，從而促進(jìn)我國甘薯生產(chǎn)燃料酒精的推廣應(yīng)用。

1 材料與方法

1.1 材料與設(shè)備

酵母菌（A4） 本實(shí)驗(yàn)室保藏菌種；麥芽汁 合肥市華潤雪花啤酒廠；YPD培養(yǎng)基 參考文獻(xiàn)［3］；原生質(zhì)體再生培養(yǎng)基 在YPD固體培養(yǎng)基中添加KCl至0.7mol/L；TTC上、下層培養(yǎng)基 參考文獻(xiàn)［4］；預(yù)處理劑 0.1%β-巰基乙醇，其中含0.1mol/L的EDTA-2Na；KCl高滲緩沖液 在緩沖液中添加KCl至0.7mol/L；蝸牛酶液 將1.5%的蝸牛酶溶于高滲緩沖液中，微孔濾膜過濾除菌；α-淀粉酶（最適溫度50～70℃，酶活3700U/g）、糖化酶（酶活10萬U/g） 北京博奧星生物技術(shù)有限公司；高淀粉甘薯品種 徐薯18、徐薯22、青農(nóng)2號(hào)、199031-1、栗子香，本實(shí)驗(yàn)室種植；皖薯3號(hào) 安徽省農(nóng)科院提供。

SCV系列Streamline垂直流超凈工作臺(tái) 新加坡藝思高科技有限公司；MLS-3750全自動(dòng)高壓蒸汽滅菌鍋 日本三洋公司；SP-721E型可見光分光光度計(jì) 上海光譜儀器有限公司；微孔濾膜 上海生工生物工程有限公司。

表1 誘變后的再生菌經(jīng)TTC篩選的結(jié)果

表2 10%酒精度下各菌株的產(chǎn)氣情況

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 出發(fā)菌株的原生質(zhì)體制備［5-6］將活化好的菌種接種于盛有50mL YPD液體培養(yǎng)基的錐形瓶中，28℃，200r/min搖床培養(yǎng)10h，取5mL菌液3500r/min離心5min，用磷酸-檸檬酸緩沖液洗2次，無菌加入0.1%β-巰基乙醇，28℃靜置10min，用高滲緩沖液洗滌3次，取1mL菌液離心棄上清液，加入1.5%的蝸牛酶液，30℃水浴1.5h，2000r/min離心10min，高滲緩沖液洗滌2次后稀釋至10-4待用。

1.2.2 原生質(zhì)體紫外誘變 取稀釋至10-4后的原生質(zhì)體懸液5mL于無菌平皿中，置于20W紫外燈下距離30cm照射不同時(shí)間后涂布于高滲平板和普通平板，同時(shí)作對照組，于28℃避光培養(yǎng)72h，待長出菌落后計(jì)算其存活率［7］。

1.2.3 酵母菌的篩選 參考文獻(xiàn)［8］。一級(jí)篩選：TTC平板法；二級(jí)篩選：耐酒精性測定；三級(jí)篩選：麥芽汁發(fā)酵法。

1.2.4 遺傳穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)［7］鑒于誘變菌株的性狀常不穩(wěn)定，連續(xù)繼代培養(yǎng)時(shí)可能出現(xiàn)退化現(xiàn)象。為了檢測正突變菌株遺傳性狀是否穩(wěn)定，將正突變菌株傳代培養(yǎng)10代，測定其酒精產(chǎn)量。

1.2.5 甘薯淀粉提取方法 取鮮甘薯洗凈，切成小塊放于勻漿機(jī)中加水打成勻漿，用4層紗布過濾漿液并加水反復(fù)揉洗，靜置使過濾液中淀粉沉淀，取沉淀淀粉烘干待用。

1.2.6 甘薯淀粉發(fā)酵實(shí)驗(yàn) 取200mL料液（甘薯淀粉∶水=1∶3）于錐形瓶中，以10～40U/g的量加入α-淀粉酶65℃水浴1h，沸水浴10min使其液化完全，以300U/g的量加入糖化酶60℃水浴1h，調(diào)pH為4.5，加入1%的酵母提取物和5%的菌種于30℃條件下發(fā)酵96h，每24h測其失重量，發(fā)酵結(jié)束后檢測發(fā)酵液各指標(biāo)，本實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.7 發(fā)酵液的檢測方法 酒精濃度測定：蒸餾法［9］；還原糖、總糖測定：DNS法［10］；CO2失重的測定：直接稱重法；原料出酒率計(jì)算：原料出酒率（%）=酒精產(chǎn)量（95%）/原料耗用量×100%。

2 結(jié)果與討論

2.1 酵母菌的篩選

2.1.1 一級(jí)篩選 原生質(zhì)體懸液經(jīng)紫外燈（20W）不同時(shí)間（7個(gè)梯度）照射誘變處理后，涂布于再生培養(yǎng)基培養(yǎng)。將誘變后的再生菌落用TTC平板法進(jìn)行一級(jí)篩選。產(chǎn)酒精能力強(qiáng)的酵母菌落呈深紅色，次之為粉紅色、微紅色或不顯色［11］。以出發(fā)菌株為對照，顯色后顏色比出發(fā)菌株深者為正突變，結(jié)果（見表1）可看出，經(jīng)30s和40s照射處理的效果較好，共得到32株酵母菌，隨機(jī)編號(hào)為A4-1～A4-32，轉(zhuǎn)斜面保存作為二級(jí)篩選的出發(fā)菌株。

2.1.2 二級(jí)篩選 在酒精發(fā)酵時(shí)，產(chǎn)物酒精的濃度過高會(huì)對酵母造成一定的毒害作用，抑制酵母的生長及發(fā)酵活性。所以，酵母的發(fā)酵能力在很大程度上取決于它們自身酒精耐受力的大小。本實(shí)驗(yàn)通過杜氏管發(fā)酵，測定酵母菌在外加10%酒精的發(fā)酵液中的產(chǎn)氣速度和產(chǎn)氣量。若無氣泡產(chǎn)生表示無發(fā)酵現(xiàn)象，說明菌株不耐10%的酒精；若有氣泡產(chǎn)生表示有發(fā)酵現(xiàn)象，氣泡產(chǎn)生的早晚、產(chǎn)氣速度和產(chǎn)氣量多少反映菌株耐酒精的程度。對不同酵母菌株的酒精耐性進(jìn)行比較，結(jié)果見表2。

由表2可看出，A4-5、A4-8、A4-9、A4-10、A4-18、A4-19、A4-20、A4-23、A4-24和A4-25，產(chǎn)氣時(shí)間較早，速度較快，產(chǎn)氣量較多，將其選出作為三級(jí)篩選的出發(fā)菌株。

表3 突變菌株麥芽汁培養(yǎng)基發(fā)酵結(jié)果

表4 不同品種甘薯淀粉發(fā)酵結(jié)果

2.1.3 三級(jí)篩選 將二級(jí)篩選出的10株突變菌株活化后接種于麥芽汁發(fā)酵培養(yǎng)基中，在30℃進(jìn)行發(fā)酵實(shí)驗(yàn)（重復(fù)3次），發(fā)酵終止時(shí)測酒精產(chǎn)量和發(fā)酵液的殘?zhí)橇?，結(jié)果見表3。

由表3可看出，A4-9、A4-18、A4-19、A4-20、A4-24突變菌株酒精產(chǎn)量明顯增加，A4-20尤為明顯，酒精產(chǎn)量達(dá)到4.93%，殘?zhí)橇枯^低，CO2失重量最大。CO2釋放量與產(chǎn)酒精率有很大關(guān)系，總失重值愈大，產(chǎn)酒精量愈多［12］。表 3中 A4-10，A4-23和A4-25突變株酒精產(chǎn)量沒有增加，甚至降低。這可能是不同酵母菌株的生長代謝過程有差異，對可發(fā)酵性糖的利用方式有區(qū)別，這3株菌可能更多的是利用發(fā)酵性糖進(jìn)行細(xì)胞的生長繁殖，從而減少發(fā)酵性糖轉(zhuǎn)化為酒精的量。另外，這3株酵母菌發(fā)酵糖產(chǎn)酒精的穩(wěn)定性較差。

2.1.4 遺傳穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn) 將A4-20連續(xù)傳代10次，測定其發(fā)酵酒精產(chǎn)率，并與初代進(jìn)行比較。經(jīng)測定，初代酒精度為4.9%，第10代酒精度為4.8%。結(jié)果表明，A4-20的發(fā)酵性能無明顯變化，表現(xiàn)穩(wěn)定，酒精產(chǎn)率穩(wěn)定在4.9%左右。

2.2 燃料乙醇型甘薯品種篩選

為了測定A4-20在高淀粉品種甘薯發(fā)酵中的酒精產(chǎn)量，將A4-20接種于發(fā)酵液中，其發(fā)酵結(jié)果見表4。

由表4可知，徐薯22、皖薯3號(hào)、199031-1酒精產(chǎn)量均達(dá)14%以上，其中徐薯22酒精產(chǎn)量達(dá)到最高14.87%，出酒率為38.1%。SPSS17.0單因素方差分析結(jié)果顯示，6個(gè)甘薯品種酒精度差異顯著（P＜0.05），進(jìn)一步Duncan檢驗(yàn)結(jié)果表明，徐薯22酒精度與其它品種相比差異顯著（P＜0.05）。但徐薯22和皖薯3號(hào)殘還原糖和殘總糖相對較高，說明A4-20對其可發(fā)酵性糖利用不徹底。淀粉率是評價(jià)淀粉型甘薯的重要指標(biāo)，淀粉率越高甘薯中淀粉含量越高，高淀粉品種甘薯在酒精產(chǎn)業(yè)中更具有市場前景。由表4可知，皖薯 3號(hào)淀粉率最高達(dá) 24.35%，而199031-1只有19.48%。雖然徐薯18和栗子香淀粉率達(dá)到24.17%和23.91%，但是其酒精產(chǎn)量僅達(dá)13.8%和13.6%，與其它品種相比產(chǎn)量相對較低。盡管栗子香酒精產(chǎn)量和出酒率在6個(gè)品種中最低，但是其殘還原糖和殘總糖量最低，由此可知A4-20對栗子香的可發(fā)酵性糖利用最徹底。青農(nóng)2號(hào)在6個(gè)供試品種中各方面指標(biāo)均處于中等水平。SPSS17.0軟件Pearson相關(guān)性分析可知發(fā)酵酒精度和淀粉率無顯著相關(guān)性（r=-0.621，P=0.189）。

3 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)對酵母菌A4原生質(zhì)體進(jìn)行了紫外線誘變并通過三級(jí)篩選得到發(fā)酵性能穩(wěn)定的突變菌株A4-20，發(fā)酵麥芽汁72h，酒精產(chǎn)率4.93%，比出發(fā)菌株的酒精產(chǎn)率提高了28.7%。用其對6種高淀粉品種甘薯淀粉進(jìn)行發(fā)酵實(shí)驗(yàn)，得出3個(gè)品種酒精產(chǎn)量均達(dá)14%以上，其中徐薯22酒精產(chǎn)量最高，綜合比較酒精產(chǎn)量和淀粉率兩個(gè)指標(biāo)，在6個(gè)燃料乙醇型高淀粉品種甘薯中徐薯22、皖薯3號(hào)和199031-1更適合應(yīng)用于酒精產(chǎn)業(yè)。但是本實(shí)驗(yàn)也存在一定不足，如A4-20對徐薯22和皖薯3號(hào)的可發(fā)酵性糖利用不徹底造成了原料的浪費(fèi)。為進(jìn)一步提高酒精產(chǎn)量和原料利用率，我們將進(jìn)一步改進(jìn)發(fā)酵條件。

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Screening of high yield alcohol yeast and sweet potato varieties

NIE Shi-xian1，WANG Yu1，*，HUANG Wen-jing1，JI Bi-xia1，YE Ya-feng1，LIU Xiao-ping2
（1.Provincial Key Laboratory of Eco-engineering and Bio-technique，College of Life Science，Anhui University，Hefei 230039，China；2.Crop Research Institute，Anhui Academy of Agricultural Sciences，Hefei 230031，China）

The current study was to select A4 from distillers yeast as original strain.Strain A4-20 was screened as a high-alcohol-yield strain by UV-mutation of protoplast and three steps screening method.Through wort fermentation for 72h，the alcohol content reached 4.93%，which was 28.7%higher than the original stain.After switched over 10 generations，and the fermentation by A4-20 was not significant difference.Using A4-20 fermented the starch of 6 high starch varieties of sweet potato，the results showed that the alcohol concentration of three varieties reached more than 14%.The highest alcohol concentration and yield of liquor in Xushu 22 was 14.87%and 38.1%，respectively.Xushu 22，Wanshu 3 and 199031-1 were comparatively suitable for alcohol industry.

protoplast；UV-mutation；sweet potato；alcohol；fermentation

TS262.2

A

1002-0306（2011）02-0159-04

2010-02-04 *通訊聯(lián)系人

聶世現(xiàn)（1984-），男，碩士研究生，研究方向：細(xì)胞工程。

安徽省教育廳重點(diǎn)項(xiàng)目（KJ2008A077）。