田雪蓮，陸偉東，田雪珊，卯 霞

（曲靖師范學(xué)院云貴高原生物多樣性研究所，云南曲靖655011）

蛹蟲(chóng)草水提液對(duì)CU2+誘發(fā)蠶豆根尖微核率的影響

田雪蓮，陸偉東*，田雪珊，卯 霞

（曲靖師范學(xué)院云貴高原生物多樣性研究所，云南曲靖655011）

通過(guò)蠶豆根尖細(xì)胞微核實(shí)驗(yàn)，研究蛹蟲(chóng)草水提液對(duì)Cu2+誘發(fā)蠶豆根尖微核的影響。結(jié)果顯示，當(dāng)蛹蟲(chóng)草提取液濃度為5mg/mL以上時(shí)，對(duì)蠶豆根尖細(xì)胞自然誘導(dǎo)的微核產(chǎn)生有顯著的抑制作用，對(duì)Cu2+誘導(dǎo)的蠶豆根尖細(xì)胞微核亦有顯著的抑制作用，抑制率均可達(dá)50%以上。結(jié)論：蛹蟲(chóng)草水提液可有效地抑制蠶豆根尖細(xì)胞微核的產(chǎn)生，且抑制作用隨著蛹蟲(chóng)草水提液濃度的增大而增強(qiáng)，表明蛹蟲(chóng)草水提取液具有抑制Cu2+遺傳毒性的作用。本實(shí)驗(yàn)為蛹蟲(chóng)草作為功能性食品開(kāi)發(fā)利用提供新的應(yīng)用范圍。

蛹蟲(chóng)草，Cu2+，微核，遺傳毒性

生物對(duì)環(huán)境中的銅有富集性，水生低等生物可以初步富集銅，通過(guò)食物鏈的富集，最終使大量銅進(jìn)入人體；農(nóng)作物可通過(guò)根吸收土壤中的銅，其中一部分也可經(jīng)食物進(jìn)入人體。盡管銅是生命所必需的微量元素，但銅和銅鹽的毒性強(qiáng)，若攝入過(guò)量可引起惡心、嘔吐、溶血性黃疸、腎功能衰竭、中樞神經(jīng)系統(tǒng)抑制等［1］。近幾年蛹蟲(chóng)草作為一味藥食兩用真菌備受關(guān)注，研究表明蛹蟲(chóng)草具有抗腫瘤、抗病源微生物、保護(hù)肝腎及呼吸系統(tǒng)、清除人體自由基、提高機(jī)體免疫力、調(diào)節(jié)內(nèi)分泌與抗疲勞等作用［2］，并可有效抑制由于紫外線照射所誘發(fā)的染色體畸變的產(chǎn)生［3］，目前尚未見(jiàn)蛹蟲(chóng)草提取液對(duì)金屬離子導(dǎo)致的細(xì)胞遺傳毒性影響的相關(guān)報(bào)道。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

蛹蟲(chóng)草 Pm0205F菌株系，由曲靖師范學(xué)院資環(huán)學(xué)院微生物實(shí)驗(yàn)室提供；蠶豆 曲靖市茨營(yíng)鄉(xiāng)；硫酸銅 分析純，天津光復(fù)精細(xì)化工研究所；薩氏培養(yǎng)基 2%葡萄糖，0.5%麥芽糖，0.5%酵母浸膏，1%蛋白胨，pH自然，水1000mL；微核染色劑。

LDZX-30型立式壓力蒸汽滅菌器，HPX-9082型數(shù)顯電熱培養(yǎng)箱，DK-S26型電熱恒溫水浴鍋，Leica顯微鏡，ZHWY-2102型恒溫振蕩器，TGL-16G型高速臺(tái)式離心機(jī)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 蛹蟲(chóng)草提取液的制備 配制薩氏培養(yǎng)基，接種蛹蟲(chóng)草菌種，在24℃下培養(yǎng)7d，得蛹蟲(chóng)草發(fā)酵液。將蛹蟲(chóng)草發(fā)酵液離心，反復(fù)洗滌，收集菌絲體，60℃下恒溫干燥至恒重。取干燥至恒重的菌絲體于研缽研碎，精確稱取1.0000g，加入50mL左右的水，攪拌均勻并在50℃恒溫提取30min，定容至100mL后過(guò)濾得提取液，濃度為10mg/mL即為蛹蟲(chóng)草提取原液A液，同時(shí)將提取液分別稀釋為5mg/mL的B液和2mg/mL的C液。

1.2.2 蠶豆選種 選擇飽滿均一、健康無(wú)損傷的蠶豆種子，自來(lái)水沖洗干凈后，用0.5%次氯酸鈉消毒30min，再用蒸餾水沖洗數(shù)次，用直徑12cm的培養(yǎng)皿在24±0.5℃下對(duì)蠶豆進(jìn)行水培，每6h換水一次。

1.2.3 硫酸銅溶液的配制 用蒸餾水配制30μg/mL CuSO4溶液待用。

1.2.4 染毒處理 待根尖長(zhǎng)至約0.5～1cm，選取15個(gè)生長(zhǎng)良好的蠶豆為一組。取三組蠶豆，分別向其中加入10mL CuSO4溶液+1mL A液、10mL CuSO4溶液+1mL B液、10mL CuSO4溶液+1mL C液，進(jìn)行培養(yǎng)。同時(shí)設(shè)置陽(yáng)性對(duì)照組為10mL CuSO4溶液+ 1mL蒸餾水、陰性對(duì)照組為加入11mL蒸餾水。將以上各組處理培養(yǎng)10h，然后用蒸餾水沖洗三次，移置原瓷盤(pán)中修復(fù)培養(yǎng)24h。染毒后，用蒸餾水洗滌3次，經(jīng)固定、染色，任取5個(gè)根尖制片，鏡檢，統(tǒng)計(jì)細(xì)胞微核率（micronucleus，MCN）。

1.2.5 統(tǒng)計(jì)分析 實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)為5次測(cè)得的平均值。方差分析由Excel（2003）統(tǒng)計(jì)分析軟件得出。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同濃度蛹蟲(chóng)草水提取液對(duì)蠶豆根尖細(xì)胞微核率的影響

用不同濃度的蛹蟲(chóng)草水提取液處理蠶豆根尖細(xì)胞，通過(guò)測(cè)算細(xì)胞微核率分析蛹蟲(chóng)草水提取液濃度對(duì)遺傳毒性的影響，見(jiàn)表1。

表1 蛹蟲(chóng)草水提取液對(duì)蠶豆根尖細(xì)胞微核率的影響

圖1 蛹蟲(chóng)草提取液與蠶豆根尖細(xì)胞微核抑制率的關(guān)系

蛹蟲(chóng)草提取液三個(gè)不同濃度與蒸餾水對(duì)比，通過(guò)單因素方差分析可以看到，A液、B液與蒸餾水之間的差異極顯著，也就是說(shuō)蛹蟲(chóng)草提取液沒(méi)有促進(jìn)蠶豆根尖細(xì)胞微核的產(chǎn)生，相反有很強(qiáng)的抑制微核能力。當(dāng)蛹蟲(chóng)草提取液稀釋至2mg/mL的濃度時(shí)，其抑制微核產(chǎn)生的能力與蒸餾水相比，差異不顯著，說(shuō)明蛹蟲(chóng)草提取液的濃度不宜過(guò)低。

通過(guò)抑制率的計(jì)算發(fā)現(xiàn)，當(dāng)蛹蟲(chóng)草提取液濃度為10mg/mL和5mg/mL時(shí)，其蠶豆根尖細(xì)胞微核抑制率為50%以上，當(dāng)濃度為2mg/mL時(shí)，抑制率不到30%。

2.2 不同濃度蛹蟲(chóng)草水提液對(duì)Cu2+誘導(dǎo)的蠶豆根尖細(xì)胞微核率的影響

表2 蛹蟲(chóng)草水體液對(duì)Cu2+誘導(dǎo)的蠶豆根尖細(xì)胞微核率的影響

經(jīng)單因素方差分析表明，當(dāng)蛹蟲(chóng)草提取液濃度為10mg/mL時(shí)，不僅與陽(yáng)性對(duì)照組有極顯著差異，還與陰性對(duì)照組有極顯著差異；當(dāng)蛹蟲(chóng)草提取液濃度為5mg/mL時(shí)，與陽(yáng)性對(duì)照組有極顯著差異，同時(shí)與陰性對(duì)照組有顯著差異；當(dāng)蛹蟲(chóng)草提取液濃度為2mg/mL時(shí)，與陽(yáng)性對(duì)照組有極顯著差異，而與陰性對(duì)照組差異不顯著。

由此看出，蛹蟲(chóng)草提取液對(duì)Cu2+誘導(dǎo)的蠶豆根尖細(xì)胞微核率的影響是非常顯著的，說(shuō)明蛹蟲(chóng)草有抑制重金屬Cu2+遺傳毒性的作用。

由圖2顯示，隨著蛹蟲(chóng)草提取液濃度的降低，抑制率也降低，且當(dāng)濃度為5mg/mL和10mg/mL時(shí)的抑制率差異不大。而當(dāng)濃度為2mg/mL時(shí)，其抑制率僅為5mg/mL的1/2。因此在考慮蛹蟲(chóng)草提取液最佳使用濃度時(shí)可考慮選用濃度為5mg/mL。

圖2 蛹蟲(chóng)草提取液與Cu2+誘導(dǎo)的蠶豆根尖細(xì)胞微核抑制率的關(guān)系

3 結(jié)論與討論

上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，蛹蟲(chóng)草具有抑制重金屬離子遺傳毒性的作用。當(dāng)蛹蟲(chóng)草提取液濃度為5mg/mL以上時(shí)，對(duì)蠶豆根尖細(xì)胞自然誘導(dǎo)的微核產(chǎn)生有明顯的抑制作用，抑制率可達(dá)50%以上；當(dāng)蛹蟲(chóng)草提取液濃度為5mg/mL以上時(shí)，對(duì)Cu2+誘導(dǎo)的蠶豆根尖細(xì)胞微核亦有顯著的抑制作用，且抑制率可達(dá)66%以上。當(dāng)蛹蟲(chóng)草提取液濃度為2mg/mL時(shí)，其對(duì)蠶豆根尖細(xì)胞自然誘導(dǎo)微核的抑制率降低為29%，對(duì)Cu2+誘導(dǎo)的微核抑制率為33%，僅為A液、B液的一半。綜合上述情況可以初步斷定，蛹蟲(chóng)草提取液對(duì)蠶豆根尖細(xì)胞微核抑制最適宜濃度為5mg/mL。本實(shí)驗(yàn)為蛹蟲(chóng)草的藥用價(jià)值和食用價(jià)值提供新的應(yīng)用范圍。但由于蛹蟲(chóng)草提取液成分比較復(fù)雜，至于其中究竟是某種或某幾種有效成分對(duì)微核的形成起到了抑制作用還有待進(jìn)一步研究。相信隨著研究方法和技術(shù)的不斷改進(jìn)，蛹蟲(chóng)草會(huì)更合理、高效地被利用，為人類健康做出更大貢獻(xiàn)。

［1］張朝華，賈存英.銅與缺銅對(duì)機(jī)體的影響［J］.微量元素與健康研究，2003，20（1）：58-59.

［2］林群英，宋斌，李泰輝.蛹蟲(chóng)草研究進(jìn)展［J］.微生物學(xué)通報(bào)，2006，33（4）：154-157.

［3］朱蘊(yùn)蘭，邵穎，陳安徽，等.蛹蟲(chóng)草多糖對(duì)紫外線誘發(fā)蠶豆根尖細(xì)胞微核的影響［J］.食品科學(xué)，2009，30（1）：177-180.

Effects of water extract of cordyceps militaris on Cu2+induced micronucleus rate of viciafaba root-tip cells

TIAN Xue-lian，LU Wei-dong*，TIAN Xue-shan，MAO Xia
（Yunnan-Guizhou Plateau Institute of Biodiversity，Qujing Normal University，Qujing 655011，China）

Micronucleus test was designed to study effects of water extract of cordyceps militaris on micronucleus rate of vicia faba root-tip cells induced by Cu2+.The results showed when the concentration of water extract of cordyceps militaris was 5mg/mL，the micronucleus formation（MCN%）in root tip cell which was created naturally or induced with Cu2+was significant different，the inhibition rate on micronucleus formation was more than 50%.ln conclusion，the water extract of corcyceps militaris can effectively inhibit the creation of root tip cells micronucleus of Vicia faba and the inhibitory action of the water extract of cordyceps militaris can be strengthened along with the increasing concentrations of itself，which indicated the water extract of cordyceps militaris had an inhibitory effect on hereditary toxicity.

cordyceps militaris；Cu2+；micronucleus；genotoxicity

TS201.1

A

1002-0306（2011）02-0149-03

2010-09-29 *通訊聯(lián)系人

田雪蓮（1977-），女，碩士，實(shí)驗(yàn)師，研究方向：應(yīng)用真菌。

曲靖師范學(xué)院科學(xué)研究基金（2009ZD003）。