鄧開野，譚梅唇

(1.仲愷農(nóng)業(yè)工程學(xué)院輕工食品學(xué)院，廣東廣州510225; 2.廣西大學(xué)，廣西南寧530004)

透明質(zhì)酸產(chǎn)生菌分批發(fā)酵工藝條件的研究

鄧開野1，譚梅唇2

(1.仲愷農(nóng)業(yè)工程學(xué)院輕工食品學(xué)院，廣東廣州510225; 2.廣西大學(xué)，廣西南寧530004)

采用10L小型發(fā)酵罐，對變異菌株的分批發(fā)酵生產(chǎn)HA的培養(yǎng)條件進行了研究。分別考察了初糖濃度、pH、培養(yǎng)溫度、氧的傳遞、HA合成前體UMP的添加對發(fā)酵的影響。結(jié)果表明，高的初糖濃度對菌體的生長和HA的合成產(chǎn)生抑制作用，發(fā)現(xiàn)5%的初糖濃度比較合適。比較理想的小罐分批發(fā)酵條件為:攪拌轉(zhuǎn)速為200r/min、pH7.0、培養(yǎng)溫度37℃、通氣量2L/min。HA合成前體UMP的添加可以促進菌體的繁殖和大幅度地提高HA的產(chǎn)量。

透明質(zhì)酸，分批發(fā)酵，工藝條件

菌種 實驗室篩選和誘變出的產(chǎn)生透明質(zhì)酸的變異株;種子培養(yǎng)基 2%淀粉葡萄糖水解液，蛋白胨1%，酵母膏 1%，NaNO30.4%，MgSO4·7H2O 0.1%，KH2PO40.2%，調(diào)pH7.0，121℃滅菌20min;發(fā)酵培養(yǎng)基 4%淀粉葡萄糖水解液，蛋白胨1%，酵母膏1%，硝酸鈉0.5%，MgSO4·7H2O 0.1%，KH2PO40.2%，調(diào)pH7.0，121℃滅菌20min。

1.2 實驗方法

1.2.1 斜面與種子培養(yǎng)方法 將篩分的菌種，于斜面培養(yǎng)基上劃線傳代。將斜面試管放在恒溫箱中，在37℃條件下培養(yǎng)14～16h。培養(yǎng)結(jié)束后，用接種針在斜面培養(yǎng)基中挑取生長狀態(tài)良好的菌落2～3環(huán)，接入250mL三角燒瓶中，燒瓶內(nèi)裝50mL種子培養(yǎng)基，把接菌后密封好的250mL三角燒瓶，置于以200r/min旋轉(zhuǎn)的搖床中培養(yǎng)16h，培養(yǎng)溫度37℃。

1.2.2 搖瓶培養(yǎng)方法 培養(yǎng)結(jié)束后，按10%的接種量計算，從250mL三角燒瓶中吸取0.2mL已培養(yǎng)好的菌液，接入500mL三角燒瓶中，內(nèi)裝發(fā)酵體培養(yǎng)基20mL。再將此500mL三角瓶置于轉(zhuǎn)速為200r/min的搖床中振蕩培養(yǎng)，在37℃條件下培養(yǎng)24h。

1.2.3 發(fā)酵罐培養(yǎng) 采用10L的發(fā)酵罐(江蘇達森發(fā)酵設(shè)備有限公司)，配有單只圓盤平槳，配有德國梅特勒公司的儀表(溶氧探頭和pH探頭，可自動控制pH)，自動控溫等。加入5L發(fā)酵培養(yǎng)基，121℃滅菌30min。接種量為10%(v/v)，發(fā)酵過程中采用2mol/L NaOH自動控制pH，初始淀粉的葡萄糖水解液的濃度為 5%，攪拌轉(zhuǎn)速 200r/min，通氣量為2.4L/min，發(fā)酵溫度為37℃。

1.2.4 測定方法

1.2.4.1 吸光度(OD值)的測定 發(fā)酵液50mL，在4000r/min條件下離心15min后，在上清液中，加入3倍體積的乙醇，析出的沉淀加入與發(fā)酵液同體積的0.1mol/L NaCl溶液，置于磁力攪拌器中，在196nm處測定發(fā)酵液的吸光度，該吸光度值的大小可以指示發(fā)酵液中透明質(zhì)酸含量的高低。

1.2.4.2 菌體含量的測定 菌體量的測定:采用干重法。將發(fā)酵液離心后取沉淀，加稀酸溶解碳酸鈣，再離心取沉淀，80℃干燥24h后，稱取重量，計算細胞濃度。

1.2.4.3 乳酸含量測定 對羥基聯(lián)苯法［2］。

1.2.4.4 葡萄糖含量測定 采用3，5二硝基水楊酸法［3］。

2 結(jié)果與討論

2.1 初糖濃度對HA發(fā)酵的影響

2.1.1 初糖濃度對變異菌株菌體生長的影響 圖1為不同初始淀粉的葡萄糖水解液濃度下，菌體的生長過程曲線，圖2為底物消耗曲線。從圖1和圖2可見，菌體可以在較大的范圍內(nèi)生長，初糖濃度為3%～8%時，菌體均能很好地生長，最終菌體濃度可以達到1.71～4.75g/L。但較低初糖濃度時，菌體的生長延遲期較短，可以高速度生長，菌體進入快速糖耗階段的時間隨初糖濃度的升高而延遲，當初糖濃度為8%時，在發(fā)酵初始的10h內(nèi)，幾乎沒有底物的消耗，因此可以認為初糖濃度高對菌體生長有抑制作用。

圖1 不同初糖濃度對菌體生長的影響

2.1.2 初糖濃度對HA合成的影響 由表1可以看出，在初糖濃度為8%時，吸光度值最大為2.869，表明發(fā)酵液中HA的含量最多。結(jié)合圖1可見，菌體的生長和產(chǎn)物合成的延遲期一致。初糖濃度高，菌體量多，發(fā)酵結(jié)束時所獲得的HA產(chǎn)量也越高。但高的初糖濃度對菌體生長有抑制作用，發(fā)酵遲滯期延長，而當初糖濃度低時，菌體量和HA產(chǎn)量又偏少。所以實驗在分批發(fā)酵過程中，采用5%濃度淀粉葡萄糖轉(zhuǎn)化液為發(fā)酵的初糖濃度。

圖2 不同初糖濃度對葡萄糖消耗的影響

表1 初糖濃度對發(fā)酵結(jié)果的影響

圖3為該菌株發(fā)酵過程中乳酸的變化曲線。由圖3可知，在淀粉的葡萄糖水解液的初始葡萄糖濃度為3%、4%、5%、8%時，微生物可將底物的70%～80%轉(zhuǎn)化為乳酸，乳酸相應(yīng)產(chǎn)量可達23.8、41.9、61.4、75.12g/L。發(fā)酵過程中，乳酸的合成和菌體的生長趨勢一致，說明菌體生長旺盛，則乳酸的產(chǎn)量也高。在不同的乳酸濃度下同時測定發(fā)酵液中HA的量，結(jié)果如圖4所示，表明當乳酸濃度達到40g/L時，HA的合成基本停止。可以認為在此濃度之上，乳酸對HA的合成形成了強烈的抑制，而在此濃度之下，乳酸的抑制作用則大為減弱。通過以上分析，發(fā)現(xiàn)淀粉的葡萄糖水解液的初始糖濃度，對該菌種的生產(chǎn)性能有很大的影響:高的初糖濃度對菌體生長和產(chǎn)物的形成產(chǎn)生抑制，而發(fā)酵過程中產(chǎn)生的乳酸，隨著初糖濃度的增加而增加，發(fā)酵液中乳酸的量的增加反過來又對HA的合成產(chǎn)生抑制。而當初糖濃度小于5%時，菌體量和HA產(chǎn)量又明顯減少，當初糖濃度較高時，發(fā)酵時間延長，所以本研究認為利用該選育菌株發(fā)酵生產(chǎn)HA，采用初始葡萄糖濃度為5%的淀粉水解液較為適宜。

圖3 不同初糖濃度下乳酸的變化

圖4 不同的乳酸濃度對HA合成的影響

2.2 pH對發(fā)酵的影響

2.2.1 pH對變異菌株菌體生長的影響 本實驗采用了不同pH的培養(yǎng)基進行發(fā)酵，結(jié)果見圖5。pH為7.0時細胞生長最好，細胞量達到最大，同時在中性偏酸，即pH在6～7的范圍內(nèi)，菌體能較好地生長。搖瓶發(fā)酵研究發(fā)現(xiàn)，如不對pH進行控制，pH將迅速下降到5.0左右，菌體的生長和代謝極其有限。pH為8.0時，菌體生長極為緩慢，pH過高，以致于限制了微生物的生長。

圖5 不同pH對菌體生長的影響

2.2.2 pH對HA合成的影響 由表2可見，pH為7.0時，發(fā)酵液的吸光度值最大，表明發(fā)酵液中HA的含量最多。當把培養(yǎng)基的pH調(diào)到8.0時，吸光度值最小，發(fā)酵液中HA含量最少，這與不同pH對菌體生長影響有相同的趨勢。由圖6可以看出，本研究篩選得到的突變菌株可以在中性或弱酸性的條件下生長，利用葡萄糖的速度基本一致，在pH6.5時，耗糖速度略快些，而pH8.0時，耗糖的速度慢。

綜合分析以上實驗結(jié)果，可見要使突變菌株正常進行發(fā)酵，需將pH控制在6.5～7.0范圍內(nèi)。

表2 不同pH對發(fā)酵結(jié)果的影響

圖6 不同pH下淀粉水解液中葡萄糖的利用曲線

2.3 溫度對HA發(fā)酵的影響

2.3.1 溫度對菌體生長的影響 本研究考察了不同的發(fā)酵溫度對菌體生長的影響情況，結(jié)果如圖7所示。結(jié)果表明，隨著溫度的升高，細胞生長速度加快。33℃時，細胞量僅為2.2g/L，39℃時細胞含量最多，可達到3.94g/L。

圖7 溫度對菌體生長的影響

2.3.2 溫度對HA合成的影響 由表3可見，溫度為33℃時，發(fā)酵液中HA的量不多，而在39℃時，HA的量最小?？梢姼邷仉m然對菌體生長有利，但不利于HA的合成，由于在高溫時，菌體將培養(yǎng)基中的營養(yǎng)成分大部分用來菌體生長，而到了產(chǎn)物合成階段，已經(jīng)沒有養(yǎng)分可以利用，所以嚴重影響了產(chǎn)物的合成。而發(fā)酵溫度為35℃時，發(fā)酵液的吸光度值最大，表明HA的含量最高。因此，35℃是較為合適的小罐發(fā)酵溫度。

表3 溫度對發(fā)酵結(jié)果的影響

2.4 氧的供給對HA發(fā)酵的影響

2.4.1 攪拌轉(zhuǎn)速對HA生產(chǎn)的影響 表4表明，采用10L小型發(fā)酵罐進行發(fā)酵時，轉(zhuǎn)速小于200r/min時，發(fā)酵液的吸光度值隨著轉(zhuǎn)速的增加而增加，表明發(fā)酵液中HA的含量也隨著攪拌速度的增加而增加，這是因為，HA的形成使發(fā)酵液的粘度顯著增高。而采用高的攪拌速度，HA含量反而下降，造成這一結(jié)果的原因可能是較大的攪拌速度對菌體細胞產(chǎn)生傷害，導(dǎo)致細胞合成HA的能力下降。分析上述結(jié)果認為，小罐的分批發(fā)酵可采用200r/min的攪拌速度。

表4 攪拌速度對HA發(fā)酵的影響

2.4.2 通氣量對HA發(fā)酵的影響 由表5可知，通過增加通氣量來提高發(fā)酵液中溶解氧的濃度，改善氧傳遞的效果呈現(xiàn)遞減的趨勢。當氣流速度大時，再依靠增加通氣量的手段來提高氧的傳質(zhì)效率的效果并不明顯，還起到反作用。結(jié)果表明，通氣量低，對合成HA有利，所以，分批發(fā)酵時，采用2L/min的通氣量較為理想。

表5 通氣量對HA發(fā)酵的影響

2.5 分批發(fā)酵培養(yǎng)條件的優(yōu)化與控制

綜合上述實驗結(jié)果，各單因素實驗得到的較優(yōu)條件是:初糖濃度5%，pH7.0，培養(yǎng)溫度35℃，攪拌轉(zhuǎn)速200r/min，通氣量2L/min，利用該較優(yōu)條件進行發(fā)酵，結(jié)果如表6所示。

表6 發(fā)酵條件對發(fā)酵的影響

由表6可見，較優(yōu)條件下發(fā)酵，并不能得到最好的結(jié)果，也就是說各項較優(yōu)條件并不能表現(xiàn)為簡單的加和，較優(yōu)條件時所測得的發(fā)酵液吸光度值低于單因素實驗中所得的結(jié)果。所以，研究改變溫度，將最后實驗條件確定為:初糖濃度5%，pH7.0，培養(yǎng)溫度37℃，攪拌轉(zhuǎn)速200r/min，通氣量2L/min。

2.6 尿苷-磷酸(UMP)對發(fā)酵的影響

在配制好發(fā)酵培養(yǎng)基后，在接種時，把0.8g/L的UMP，加入到培養(yǎng)基中進行培養(yǎng)。本研究考察了兩種初始葡萄糖濃度情況下對HA合成的影響。待發(fā)酵結(jié)束后，測量發(fā)酵液中的菌體含量和196nm處的吸光度，結(jié)果見表7。

表7 加入UMP對發(fā)酵的影響

由表7可見，加入UMP可以明顯地提高HA的產(chǎn)量。在低葡萄糖初始濃度下，產(chǎn)量提高了7%左右，而菌體量的變化不大。在5%的初始葡萄糖濃度下，HA的產(chǎn)量提高了近30%，而菌體量提高的幅度也較為明顯。產(chǎn)量完全提高的原因可能是由于鏈球菌的三羧酸循環(huán)不完全，外源UMP的加入為HA的合成提供了前體，并直接參與HA合成的次級代謝反應(yīng)，從而促進HA的產(chǎn)量和菌體量的提高。

3 結(jié)論

3.1 采用10L小型發(fā)酵罐，對所篩選誘變后獲得的變異菌株的分批發(fā)酵生產(chǎn)HA的培養(yǎng)條件進行了研究。分別考察了初糖濃度、pH、培養(yǎng)溫度、氧的傳遞等對發(fā)酵的影響。結(jié)果表明，高的初糖濃度對菌體的生長和HA的合成產(chǎn)生抑制作用，發(fā)現(xiàn)5%的初糖濃度比較合適。

3.2 采用單因素的實驗結(jié)果，對發(fā)酵條件進行了優(yōu)化。獲得的比較理想的小罐分批發(fā)酵條件為:攪拌轉(zhuǎn)速為200r/min、pH7.0、培養(yǎng)溫度37℃、攪拌轉(zhuǎn)速200r/min、通氣量2L/min。

3.3 考察了HA的合成前體加入到發(fā)酵培養(yǎng)基中，對發(fā)酵的影響，結(jié)果表明，HA合成前體UMP的添加可以促進菌體的繁殖和大幅度地提高HA的產(chǎn)量。

［1］汪蠑，張云開，韋航，等.透明質(zhì)酸徽生物發(fā)酵法生產(chǎn)工藝條件的研究［J］.廣西農(nóng)業(yè)科學(xué)，2001(4):190-192.

［2］Barker S B，Summerson W H.The Colorimetric determination of lactic acid in biological material［J］.J Biol Chem，1949，138: 535-554.

［3］Miller G L.Dinitrosalicylic acid reagent for determination of reducing sugar［J］.Anal Chem，1960，31(3):426-428.

Study on the technology of batch fermentation for hyaluronic acid producing strain

DENG Kai-ye1，TAN Mei-chun2
(1.College of Light Industry and Food Technology，Zhongkai University of Agriculture and Engineering，Guangzhou 510225，China;2.Guangxi University，Nanning 530004，China)

Batch fermentation condition was determined by using 10L fermenter.The effective factors to the fermentation were discussed，such as initial glucose concentration，pH value，temperature，oxygen impressing，adding synthesized precursor.The results showed that the higher initial glucose concentration could restrain the bacterial growth and HA synthesizing，and 5% initial glucose concentration was suitable.The ideal batch fermentation conditions were stirring speed 200r/min，pH7.0，cultural temperature 37℃，aeration volume 2L/min.The adding of precursor could promote the reproduce of bacterial and enhance the HA yield.

hyaluronic acid;batch fermentation;process conditions

TS201.3

A

1002-0306(2011)03-0221-04

在搖瓶發(fā)酵過程中，發(fā)現(xiàn)pH變化很大，如不能對其進行很好地控制，發(fā)酵液的pH會迅速降低(5.0左右)，使得搖瓶發(fā)酵過程中，HA在發(fā)酵液中的積累不是很多，在紫外分光光度計上，吸光度值平均只有2.256左右。由于小型發(fā)酵罐的易操作性，可以通過控制溶氧濃度、溫度、pH等來控制發(fā)酵，同時分批操作也是工業(yè)化生產(chǎn)的基礎(chǔ)，因此，對分批發(fā)酵過程及條件的研究有助于揭示微生物發(fā)酵的本質(zhì)，了解發(fā)酵的規(guī)律。實驗采用10L小型發(fā)酵罐，考察了該菌種分批發(fā)酵的生產(chǎn)條件，研究了發(fā)酵條件對HA產(chǎn)量的影響，提出了較為適宜的分批發(fā)酵培養(yǎng)條件，為建立HA分批發(fā)酵動力學(xué)模型和對發(fā)酵過程的優(yōu)化和控制打下了基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

2010-03-15

鄧開野(1968-)，女，博士，副教授，研究方向:發(fā)酵工程。