高瑞萍，彭見林，劉 輝，趙國華，*

(1.西南大學(xué)食品科學(xué)學(xué)院，重慶400715; 2.重慶市農(nóng)產(chǎn)品加工技術(shù)重點實驗室，重慶400715)

脂肪酸分析方法研究進展

高瑞萍1，2，彭見林1，2，劉 輝1，2，趙國華1，2，*

(1.西南大學(xué)食品科學(xué)學(xué)院，重慶400715; 2.重慶市農(nóng)產(chǎn)品加工技術(shù)重點實驗室，重慶400715)

脂肪酸的過量攝入會引發(fā)一些慢性疾病，如肥胖、糖尿病、心血管疾病等，嚴重危害人體健康。而適量不飽和脂肪酸的攝入，包括 α-亞麻酸(α-linolenic acids，ALA)、花生四烯酸(arachidonic acid，AA)、二十碳二烯酸(eicosapentaenoic acid，EPA)等不僅有益于身體健康，還能改善機體功能。國外對脂肪酸的分析已相當(dāng)成熟，應(yīng)用了許多現(xiàn)代分析技術(shù)。鑒于脂肪酸在食品領(lǐng)域的重要性，重點對國外脂肪酸(fatty acids，F(xiàn)As)的分析方法進行綜述，包括萃取和分析等方面的內(nèi)容。以期為加快國內(nèi)脂肪酸分析技術(shù)的發(fā)展提供有益參考。

脂肪酸，游離脂肪酸，萃取技術(shù)，分析方法

1 脂肪萃取技術(shù)(fatty acid extraction techniques)

脂肪抽提是脂肪酸分析過程中最關(guān)鍵的步驟。常用的脂肪抽提技術(shù)包括索氏抽提(soxhlet)、加壓液體萃取、水蒸氣蒸餾(steam distillation)等。

1.1 微波輔助索氏抽提(microwave-integrated Soxhlet，MIS)

索氏抽提(Soxhlet extraction)是最常用的脂肪提取技術(shù)。但其存在萃取時間較長、溶劑消耗大和可重復(fù)性差等缺點。Virot等［2］通過微波輔助對索氏抽提進行改進，可用來抽提含油種子、肉、焙烤等產(chǎn)品中的脂肪。主要利用聚四氟乙烯/石墨攪拌棒使微波產(chǎn)生的熱量傳播到周圍環(huán)境中，尤其適用于己烷作為抽提劑的抽提。此法可從花生、葵花籽等食物中提取脂肪，通常萃取32min后，食品基質(zhì)中總脂肪即可分離濃縮，而傳統(tǒng)的索氏抽提需要8h。該方法應(yīng)用微波作為不連續(xù)熱源具有以下優(yōu)點:有效加熱、較快的能量轉(zhuǎn)化、減小設(shè)備尺寸、對熱控制能做出較快的反應(yīng)、更快速啟動、增加得率、減少過程步驟［3］。

表1 不同食品基質(zhì)中脂肪酸萃取技術(shù)

1.2 同時蒸餾萃取(Simultaneous distillationextraction，SDE)技術(shù)

該方法適用于分析含香氣成分較少的樣品。Larrayoz等［4］成功應(yīng)用SDE萃取山羊奶酪中的中鏈和長鏈脂肪酸。Careri等［5］用SDE來提取帕爾馬奶酪中的FFA。優(yōu)化出實驗條件時間為3h，樣品和溶劑加熱溫度分別為125℃和55℃。Alewijn等［6］研究了一種快速而簡單的SDE萃取奶酪中脂肪衍生物和低揮發(fā)性組分的方法。應(yīng)用乙腈作為提取劑，45℃下提取10min，在三種奶酪中分析到存在23種FAs，其中大部分是中鏈FAs。

1.3 自動酸水解萃取(aotomated acid hydrolysisextraction，AHE)技術(shù)

AOAC996.01方法是萃取谷物中總脂肪、飽和脂肪酸、單不飽和脂肪酸、多不飽和脂肪酸的分析方法。但是該方法存在步驟繁瑣、溶劑使用量大、操作時間長等缺點。AHE是在密閉體系中聯(lián)合使用自動酸水解和洗滌樣品，然后通過溶劑回流和自動索氏抽提油脂。Robinson等［7］通過比較AOAC996.01和AHE得出AHE具有減少溶劑使用量、減少操作者與試劑接觸、減少操作時間和縮小誤差等優(yōu)點。由于AHE系統(tǒng)是自動和密閉的，樣品較少接觸和暴露在空氣中。另外，六個樣品能在一個體系中同時進行分析，每個樣品消耗較少的溶劑，80%的溶劑能被回收和再利用［8］。

1.4 加壓液體萃取技術(shù) (pressurized liquid extraction，PLE)

PLE萃取是將固體樣品裝入一個提取容器中，然后原料在高壓(3.5～20MPa)下用有機溶劑提取，加熱溫度超過沸點。和傳統(tǒng)的分析方法比較，PLE具有提取時間短、提取率高、自動化、減少人體接觸溶劑和較少溶劑的使用量等優(yōu)點，是一種在常規(guī)分析食品等基質(zhì)中油脂/脂肪酸最有效的方法［9］。Poerschmann等［10］應(yīng)用PLE提取海洋浮游植物中的脂肪酸，并與超聲波輔助(ultrasound-assisted，USE)和經(jīng)典索氏抽提進行比較。在PLE中提取壓力為10MPa，應(yīng)用的溶劑為甲醇和石油醚，兩種溶劑提取的最佳溫度分別為85℃和150℃，萃取時間都為10min。結(jié)果表明，PLE大大降低了總抽提時間、溶劑的量和對樣品和溶劑的操作。

1.5 超臨界 CO2萃取技術(shù)(supercritical carbon dioxide extraction，SCCE)

超臨界CO2萃取技術(shù)是利用CO2處于超臨界狀態(tài)而萃取分離各種有機物的一種先進技術(shù)。由于其無毒、無污染、分離簡單，因而被廣泛應(yīng)用于天然油脂的提取、分離。張文葉等［11］利用超臨界CO2流體萃取技術(shù)萃取山胡蘿卜籽油，萃取壓力為25MPa、溫度為40℃、時間為80min，得油率為36.65%。鄭美瑜［12］用超臨界 CO2流體連續(xù)萃取魚油中的 EPA、DHA，實驗得出壓力為12.5MPa、溫度為45～90℃、魚油量4mL/min、CO2流量為40L/min時的萃取效果最佳。Cao等［13］采用超臨界CO2萃取、微波輔助流體萃取(microwave-assisted reflux extraction，MWRE)、超聲波輔助萃取(ultrasound-assisted extraction，USE)、溶劑流體萃取(solvent reflux extraction，SRE)四種方法提取微孔草種子油，其中MWRE、USE、SRE中氯仿作為萃取溶劑，結(jié)果四種方法浸提率分別為34.0%、13.12%、7.35%、12.16%。經(jīng)反相HPLC分析得39種脂肪酸衍生物的檢測限為0.014～14.29μmol/L、線性相關(guān)性＞0.9992。結(jié)果表明 SCCE是一種比MWRE、USE和SRE更有效、更適合于萃取食品和藥品樣品中脂肪酸的方法。

2 脂肪酸分析方法

2.1 氣相色譜法

毛細管 GC(Capillary GC)是最常用的分析FAMEs的技術(shù)。GC是一種分析油、脂肪和加工油和脂肪中甲基酯化的脂肪酸的較好的技術(shù)。Guil-Guerrero等［15］分析19種種子油中γ-亞油酸(18∶3，ω-6)和十八碳四烯酸(18∶4，ω-3)，采用兩種類型的毛細管柱:一種是較高極性的SP-2330柱聯(lián)合FID檢測器，另一種是甲基硅酮HP-1柱聯(lián)合MS檢測器來檢測雙鍵，測得γ-亞油酸含量為1.77%～5.02%，十八碳四烯酸含量為3.03%～12.94%。Cherif等［16］應(yīng)用極性DB-WAX柱測定地中海海岸的螃蟹中的脂肪酸組成，結(jié)果得螃蟹肉和肝臟中飽和脂肪酸含量分別為22.58%～13.49%和25.25%～26.24%，主要的飽和脂肪酸為棕櫚酸(16∶0)和硬脂酸(18∶0)，油酸(18∶1)為主要的不飽和脂肪酸，花生四烯酸(20:4n-6)為主要的PUFA。Fernández-García等［17］研究了不同的西班牙半熟化和熟化的乳酪脂類分解程度和類型，應(yīng)用極性FFAP(CP-Wax 58)柱(30m×0.32mm×0.25μm)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)除中鏈脂肪酸(C10∶0～C14∶0)外，乳酪中的FFAs的濃度有很大的不同，結(jié)果也證明隨著熟化時間增加，F(xiàn)FAs的濃度也增加。Poveda＆Cabezas［18］研究西班牙不同地區(qū)的山羊乳酪的FFAs的組成，發(fā)現(xiàn)含量最多的FFAs是油酸、棕櫚酸、硬脂酸和肉豆蔻酸，占總FFAs的85%。

表2 GC測定樣品中的脂肪酸

表3 HPLC測定樣品中的脂肪酸

2.2 HPLC

HPLC是常用分析和分離脂肪酸的方法。和GC相比，HPLC允許脂肪酸轉(zhuǎn)化為不同的衍生物，所以HPLC方法被用來分析飽和脂肪酸和不飽和脂肪酸，利用柱前衍生，增加檢測的靈敏度和選擇性。衍生能夠克服因拖尾、形成較小極性物質(zhì)而降低檢測的靈敏度等。但也有步驟冗長和繁瑣的清洗過程等缺點，例如液-液萃取，在衍生化之前需要對生物材料中脂肪酸進行定量分離，需要較長的時間，生物活性PUFAs如γ-亞麻酸、EPA、AA和DHA不能完全分離［25］。衍生化試劑2-NPH HCl用來測定食品和飲料中的脂肪酸［26］。所有的脂肪酸，包括飽和、不飽和脂肪酸對2-NPH HCl敏感。這些組分在230nm處有較強的吸光度，所以允許使用UV檢測器。同時，酸介質(zhì)中在400nm處具有最大吸光度。用這種衍生試劑的好處是過量的試劑和反應(yīng)副產(chǎn)物不會干擾HPLC分析，這是由于在400nm處它們不吸收可見光［27］。

2.3 近紅外光譜技術(shù)(Near-Infrared Reflectance Spectroscopy，NIRS)

近年來，隨著脂肪酸研究的深入，不斷有新的分析方法應(yīng)用到脂肪酸的研究中。其中NIRS由于具有方便、快速、高效、準確、無污染、低成本、不破壞樣品、不消耗化學(xué)試劑和一次可測定多種樣品等特點，在脂肪酸分析中得到廣泛應(yīng)用。

Patil等［33］應(yīng)用近紅外透射光譜技術(shù)(Near-Infrared Transmittance Spectroscopy，NTTS)分析 612種完整大豆粒中脂肪酸組成，光譜范圍 850～1048nm，結(jié)果得出油酸r2、SEP分別為0.89、1.61，亞油酸r2和SEP分別為0.86、1.50，棕櫚酸r2和SEP分別為0.89、0.17，結(jié)果較好。但對亞麻酸r2和SEP分別為0.78、0.36，硬脂酸r2和SEP分別為0.63、0.11，結(jié)果相對較差。Coppa等［34］用NIRS預(yù)測114個牛奶樣品中脂肪酸組分，結(jié)果得出，NIRS對測定微波干燥的牛奶中飽和脂肪酸、單不飽和脂肪酸、反式脂肪酸、反式/順式C18∶1、硬脂酸、花生酸效果較好，外部驗證決定系數(shù)(coefficient of determination in external validation，R2V)＞0.88;但對亞油酸、亞麻酸、總n-6和n-3脂肪酸效果較差，R2V＜0.81。NIRS比較適合測液態(tài)奶中飽和脂肪酸、單不飽和脂肪酸、棕櫚酸、油酸。Pérez-Marín等［35］應(yīng)用NIRS分析豬活體、胴體、帶皮的脂肪、不帶皮的脂肪中棕櫚酸、硬脂酸、油酸、亞油酸，結(jié)果表明NIRS在線監(jiān)測和控制活豬和胴體中的脂肪具有較好的效果。Peng等［36］用NIRS分析固態(tài)發(fā)酵基質(zhì)中單細胞油，得出R2＞0.9552，預(yù)測標準誤差平方根小于0.5772%，結(jié)果表明NIRS是一種用來分析固態(tài)發(fā)酵基質(zhì)中脂肪酸的快速、無損、方便的技術(shù)。

3 展望

隨著人們對油脂中有害脂肪酸(如反式脂肪酸)和生物活性脂肪酸(DHA、EPA等)的高度重視，對食品中脂肪酸的分析也成為研究的熱點。HPLC和GC等方法的分析過程較為復(fù)雜，包括許多樣品前處理，近紅外具有無損、快速、無污染等優(yōu)點，但也存在一定的缺陷。由于脂肪酸組分較復(fù)雜，給分析工作帶來了一定的困難，但我們堅信在研究者的不斷努力下，對脂肪酸的分析將邁上新的臺階。

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Progress in analysis methods of fatty acids

GAO Rui-ping1，2，PENG Jian-lin1，2，LIU Hui1，2，ZHAO Guo-hua1，2，*
(1.College of Food Science，Southwest University，Chongqing 400715，China; 2.Chongqing Key Laboratory of Agricultural Products Processing，Chongqing 400715，China)

A number of chronic diseases such as obesity，diabetes，cardiovascular disease are caused by taking overdose fatty acids.However，the moderate amount of unsaturayed fatty acids such as α-linolenic acids(ALA)，arachidonic acid(AA)and eicosapentaenoic acid(EPA)，which not only be beneficial to human health，but also can improve body functions.Analysis methods of fatty acids are quite mature abroad.Analysis methods of fatty acids were reviewed to introduce the extraction and determination methods.The purpose was to provide necessary references to speed the study process of fatty acids of our country.

fatty acids;free fatty acids;extraction technology;analysis methods

Q547

A

1002-0306(2011)08-0473-05

脂肪酸是組成油脂的脂肪族一元羧酸，根據(jù)雙鍵數(shù)目可分為飽和脂肪酸、單不飽和脂肪酸、多不飽和脂肪酸(polyunsaturayed fatty acids，PUFAs)。其鏈長度也不同，由4～28個碳組成，長鏈脂肪酸碳鏈上碳原子數(shù)大于16，包括多不飽和脂肪酸，其鏈上包括2個或更多的雙鍵，包括ω-3族和ω-6族。近年來，人們發(fā)現(xiàn)食用較多油脂會造成高血脂、高膽固醇、肥胖、糖尿病等疾病。由此，國外相繼開發(fā)出一大類新型營養(yǎng)保健型油脂，其功能主要有降膽固醇、降血脂、減肥、抗癌等保健功能，其中的主要功效成分即為PUFAs，如亞油酸、亞麻酸、花生四烯酸、EPA、DHA、磷脂及現(xiàn)在興起的結(jié)構(gòu)油脂等［1］。上述脂肪酸可能會以自由形式存在，但一般它們都是和其他復(fù)雜分子以酯鍵或酰胺鍵結(jié)合。最常用的分析游離脂肪酸(free fatty acids，F(xiàn)FA)的步驟包括:a.樣品中脂類物質(zhì)提取;b.油脂中FFA分離［薄層色譜法(thin -layer chromatography，TLC)、固相微萃取(solidphase ertraction，SPE)］;c.FFA衍生為脂肪酸甲酯(fatty acid methyl esters，F(xiàn)AMEs);d.脂肪酸甲酯提取及分析。脂肪酸的測定大多數(shù)是通過毛細管氣相色譜法(capillary gas chromatography，GC)，HPLC分析方法，另外還有無損的近紅外分析方法。本文對國內(nèi)外FAs的分析方法進行綜述，著重介紹脂類物質(zhì)的提取和最新的分析方法(GC、HPLC和NIRS)，以期為加快國內(nèi)脂肪酸分析技術(shù)的發(fā)展提供一定的參考。

2010-07-23 *通訊聯(lián)系人

高瑞萍(1987-)，女，碩士研究生，研究方向:食品化學(xué)與營養(yǎng)學(xué)。