羅曉偉，沈建福，肖仁顯，陳中海

(浙江大學(xué)生物系統(tǒng)工程與食品科學(xué)學(xué)院，浙江杭州310029)

油茶蒲提取物中次生代謝產(chǎn)物的測定

羅曉偉，沈建福*，肖仁顯，陳中海

(浙江大學(xué)生物系統(tǒng)工程與食品科學(xué)學(xué)院，浙江杭州310029)

目的:建立準(zhǔn)確測定油茶蒲提取物中總皂素、總酚、總黃酮的方法。測定醇提物及其三個(gè)分級(jí)相中三者的含量。方法:采用香草醛-冰醋酸-高氯酸法測定總皂素，F(xiàn)olin-Ciocalteau法測定總酚，硝酸鋁法、氯化鋁法、紫外直接測定法測定總黃酮。結(jié)果:油茶蒲50%醇提物中含27.35%皂素，22.41%多酚;正丁醇相中皂素含量最高，達(dá)44.05%;乙酸乙酯相中多酚含量最高，達(dá)35.34%。在黃酮含量測定中，硝酸鋁法結(jié)果明顯偏大，氯化鋁法回收率偏大，確定紫外法為油茶蒲提取物中測定黃酮的有效方法。結(jié)論:確定的三種方法簡便易行，準(zhǔn)確可靠，精密度和回收率都較理想。油茶蒲提取物中含有大量的皂素、多酚和少量的黃酮，為進(jìn)一步探索其生理活性奠定基礎(chǔ)。

油茶蒲，皂素，多酚，黃酮

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

油茶果殼 品種為普通白花油茶，取自浙江省常山縣芳村鎮(zhèn);人參皂素Re 上海融禾醫(yī)科技術(shù)發(fā)展有限公司，純度98%;焦性沒食子酸 國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司;蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品 SIGMA，純度95%;其余試劑 均為分析純。

TU-1810紫外可見分光光度計(jì) 北京普析通用儀器有限責(zé)任公司;RE-52AAA旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器 上海嘉鵬科技有限公司;SHB-ⅢA循環(huán)水式多用真空泵 上海豫康科教儀器設(shè)備有限公司;HH-4數(shù)顯恒溫水浴鍋 國華電器有限公司;BS124S萬分之一天平 Sartorius公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 油茶果殼提取物及分級(jí)相的制備 油茶果殼經(jīng)挑選后熱風(fēng)干燥，用50%的乙醇溶液，以料液比1∶5，超聲輔助提取兩次，噴霧干燥，即得到油茶蒲醇提物。

將油茶蒲醇提物的水溶液，依次用等體積的乙酸乙酯和正丁醇分別萃取3次，分別將得到的乙酸乙酯相，正丁醇相及水相旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至干粉。

供試樣品的制備:取一定量的油茶蒲醇提物、乙酸乙酯相、正丁醇相、水相物質(zhì)定容至10mg/mL。

1.2.2 總皂素的定量測定［3］測定波長的選擇:人參皂苷溶液和供試樣品經(jīng)香草醛-冰醋酸-高氯酸反應(yīng)，400～800nm下掃描波長，在548nm處有最大吸收峰，因此選擇548nm為測定波長。

標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備:精密吸取1mg/mL的人參皂苷標(biāo)準(zhǔn)品溶液0、50、100、150、200、250μL，氮?dú)獯蹈扇軇?，分別加入5%香草醛-冰醋酸0.2mL，高氯酸0.8mL，搖勻，60℃水浴15min，取出放置冰水中冷卻，加入5mL冰乙酸稀釋，在548nm波長處測定吸光值，同時(shí)以試劑空白做參照。以人參皂苷的含量(μg)為橫坐標(biāo)，A548為縱坐標(biāo)，做回歸方程。

精密度測定:精密吸取5份同一標(biāo)準(zhǔn)品，按測定方法處理并顯色，計(jì)算相對(duì)偏差RSD值。

回收率測定:精密吸取已知總皂素的供試樣品5份，加入一定量標(biāo)準(zhǔn)品，按測定方法處理并顯色，計(jì)算回收率，RSD值。

穩(wěn)定性測定:按樣品測定方法操作，每5min測定供試液的吸光值，觀察其在45min內(nèi)的變化情況，計(jì)算10個(gè)結(jié)果的RSD值。

樣品測定:精密吸取一定量的供試樣品溶液于10mL具塞試管中，按標(biāo)準(zhǔn)曲線的方法顯色，做3次平行，測定吸光值，計(jì)算含量。

1.2.3 總酚的定量測定［4］測定波長的選擇:沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)溶液和供試樣品經(jīng)Folin-Ciocalteau法反應(yīng)，400～800nm下掃描波長，在760nm處有最大吸收峰，因此選擇760nm為測定波長。

標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備:精密吸取0.1mg/mL的沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)溶液0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6mL于10mL容量瓶中，加入1.0mL Folin-Ciocalteu試劑，加入2mL 15%Na2CO3溶液，用蒸餾水定容至10mL，充分混合后，室溫放置2h，于760nm波長下測定吸光度A760，以沒食子酸含量(μg)為橫坐標(biāo)，A760為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

精密度、回收率、穩(wěn)定性、樣品測定參照1.2.2。

1.2.4 總黃酮的定量測定

1.2.4.1 亞硝酸鈉-硝酸鋁顯色法［5］測定波長的選擇:蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液和供試樣品經(jīng)亞硝酸鈉-硝酸鋁顯色，400～800nm下掃描波長，在510nm處有最大吸收峰，因此選擇510nm為測定波長。

標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備:精確吸取1.0mg/mL蘆丁儲(chǔ)備液0，0.1，0.2，0.3，0.4，0.5，0.6mL于10mL具塞比色管中，每管用50%乙醇補(bǔ)至5mL，分別加入5%亞硝酸鈉溶液0.5mL，搖勻后放置6min，加入10%硝酸鋁0.5mL，搖勻，放置 6min，加入 5%氫氧化鈉溶液2.5mL，混勻，用50%乙醇定容至10mL，靜置15min，于510nm處測定吸光度。以蘆丁含量(μg)為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

精密度、回收率、穩(wěn)定性、樣品測定參照1.2.2。

1.2.4.2 氯化鋁-醋酸緩沖體系顯色法［6］測定波長選擇:蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液和供試樣品經(jīng)氯化鋁-醋酸體系顯色，400～800nm下掃描波長，在410nm處有最大吸收峰，因此選擇410nm為測定波長。

標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備:精確吸取1.0mg/mL蘆丁儲(chǔ)備液0，0.1，0.2，0.3，0.4，0.5，0.6mL于10mL具塞比色管中，每管用50%乙醇補(bǔ)至1mL，加入1.5%AlCl33.2mL和pH5.5的NaAC-HAC緩沖液2mL，并用50%乙醇定容至刻度，搖勻，靜置30min，于410nm處測定吸光值。以蘆丁含量(μg)為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

精密度、回收率、穩(wěn)定性、樣品測定參照1.2.2。

1.2.4.3 紫外直接測定法［5］測定波長的選擇:蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液和供試樣品經(jīng)紫外掃描，在360nm處有最大吸收峰，因此選擇360nm為測定波長。

標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備:精密吸取蘆丁儲(chǔ)備液0，0.1，0.2，0.3，0.4，0.5，0.6mL于10mL具塞比色管中，用50%乙醇定容至 10mL，充分混勻，靜置 5min，于360nm處測定吸光值，以蘆丁含量(μg)為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

精密度、回收率、穩(wěn)定性、樣品測定參照1.2.2。

2 結(jié)果與分析

2.1 油茶蒲粗提物各分級(jí)相的得率

油茶果殼粗提物經(jīng)乙酸乙酯、正丁醇萃取，剩余水相，各萃取相的得率如圖 1所示，乙酸乙酯22.15%，正丁醇33.02%，水相44.83%。

圖1 油茶果殼提取物的三相萃取得率

2.2 化學(xué)成分測定方法比較

用香草醛-冰醋酸-高氯酸測定油茶果殼提取物中總皂素，F(xiàn)olin-Ciocalteau法測定總酚，亞硝酸鈉-硝酸鋁法、氯化鋁法、紫外直接測定法測定總黃酮的結(jié)果如表1所示，香草醛-冰醋酸-高氯酸測定油茶果殼提取物中總皂素，F(xiàn)olin-Ciocalteau法測定總酚，亞硝酸鈉-硝酸鋁法、氯化鋁法、紫外直接測定法測定總黃酮的相關(guān)系數(shù)(R2)高，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)小，回收率好，并且在45min內(nèi)穩(wěn)定性高，是可行的檢測方法。用氯化鋁-醋酸緩沖體系測定油茶果殼提取物中的黃酮回收率偏高。

2.3 化學(xué)成分的測定結(jié)果

油茶蒲醇提物經(jīng)萃取之后，油茶皂素的含量主要集中在乙酸乙酯相和正丁醇相，分別達(dá)到43.69%和44.05%;總酚為乙酸乙酯相最高，達(dá)到35.34%?？傸S酮含量的比較中，亞硝酸鈉-硝酸鋁法測定的結(jié)果明顯比氯化鋁法、紫外法測定的結(jié)果大(見表2)。

表1 測定方法的各指標(biāo)比較

表2 油茶果殼提取物中化學(xué)成分分析

3 討論

皂素的測定方法有沉淀法、分光光度法、溶血指數(shù)法、色譜法等，其中分光光度法操作簡便、靈敏，是經(jīng)典成熟的測定方法。孫冀平［4］在測定茶籽餅粕中的皂素含量時(shí)比較了香草醛-冰醋酸-高氯酸、香草醛-冰醋酸-濃硫酸，香草醛-濃硫酸-乙醇，香草醛-高氯酸-乙醇4種方法，發(fā)現(xiàn)香草醛-冰醋酸-高氯酸法穩(wěn)定，抗糖、蛋白干擾力強(qiáng)，可信度好。Folin-Ciocalteau比色法用于測定油茶果殼提取物中多酚操作簡便，精密度高，穩(wěn)定性好，有很好的回收率。

以蘆丁為標(biāo)準(zhǔn)品，文中比較了硝酸鋁法、氯化鋁法、紫外測定法，結(jié)果表明硝酸鋁法測定結(jié)果明顯偏高，油茶果殼粗提物中黃酮含量分別約為氯化鋁法和紫外測定法的29倍和13倍。原因分析如下:a.硝酸鋁法不是黃酮類化合物的專屬反應(yīng)，凡具有鄰苯二羥基的物質(zhì)，均能用此法進(jìn)行顯色測量;b.前期實(shí)驗(yàn)室研究表明油茶果殼提取物中含有沒食子酸、鞣花酸等多酚類物質(zhì)均具有鄰苯二羥基的結(jié)構(gòu)。所以硝酸鋁法不適用于油茶果殼提取物中黃酮的檢測。何書美等［6］提出氯化鋁法具有較強(qiáng)的抗多酚和鞣質(zhì)干擾能力，但實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明該方法回收率明顯偏大，所以選擇紫外直接測定法用于測定油茶果殼提取物中的黃酮含量。實(shí)驗(yàn)測得油茶果殼粗提物中黃酮含量為2.81%±0.11%，乙酸乙酯相、正丁醇相和水相分別為3.35%±0.05%、2.34%±0.07%和0.98%±0.05%。

前期研究發(fā)現(xiàn)，油茶蒲醇提物具有強(qiáng)抗氧化性，抗腫瘤能力［2］?，F(xiàn)對(duì)其次生代謝產(chǎn)物進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)油茶蒲提取物中含有大量的皂素、多酚和少量的黃酮。這為進(jìn)一步探索油茶蒲的生物活性奠定基礎(chǔ)。

4 總結(jié)

油茶蒲提取物中采用香草醛-冰醋酸-高氯酸法測定總皂素，F(xiàn)olin-Ciocalteau法測定總酚，紫外直接測定法測定總黃酮簡便易行，結(jié)果準(zhǔn)確可靠，精密度高，回收率好，是可行的檢測方法。油茶蒲醇提物中含有大量的皂素、多酚和少量的黃酮，為進(jìn)一步研究其生理活性奠定基礎(chǔ)。

［1］馬力.油茶籽的綜合開發(fā)利用［J］.中國食品添加劑，2007 (3):126-129.

［2］陳亞琪.油茶蒲提取物抗氧化及抗癌活性研究［D］.浙江:浙江大學(xué)，2010.

［3］孫冀平.茶葉籽中皂素及多糖的研究［D］.江蘇:江南大學(xué)，2003.

［4］Matteo Bonoli，Vito Verardo，Emanuele Marconi，et al. Antioxidant phenols in barley(Hordeum vulgare L.)flour: comparative spectrophotometric study among extraction methods of free and bound phenolic compounds［J］.Journal of Agricultural and Food Chemistry，2004，52:5195-5200.

［5］王勇，趙海燕，封琳，等.幾種甘草黃酮含量測定方法的比較與評(píng)價(jià)［J］.安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2009，37(28):13593-13595.

［6］何書美，劉敬蘭.茶葉中總黃酮含量測定方法的研究［J］.分析化學(xué)研究簡報(bào)，2007，35(9):1365-1368.

Determination of secondary metabolism in extracts from fruit shell of Camellia oleifera Abel.

LUO Xiao-wei，SHEN Jian-fu*，XIAO Ren-xian，CHEN Zhong-hai
(College of Biosystems Engineering and Food Science，Zhejiang University，Hangzhou 310029，China)

Objective:Establish accurate method and detect contents of total saponin，flavonoids and polyphenol in extract from shell of Camellia oleifera Abel and its three fractions.Method:Use vanillin-acetic acid-perchloric acid to detect total saponin，F(xiàn)olin-Ciocalteau to detect total polyphenol，Al(NO3)3，AlCl3and ultraviolet method to detect flavonoids.Results:The contents of total saponin and total polyphenol were respectively 27.35%，22.41%in alcohol extract.Maximum amount of saponin was found in butanol fraction，44.05%.The content of polyphenol was 35.34%， highest in ethyl acetate fraction.In flavonoids’detections，Al(NO3)3method produced higher results，AlCl3method produced higher recovery rate，therefore，ultraviolet determination was practical.Conclusion:Methods are convenient and reliable in determining three components，and the precision and recovery rate are fairly well. Extracts contain large amounts of saponin，polyphenols and a small amount of flavonoids.The results build the basis of further physiological research.

shell of Camellia oleifera Abel.;saponin;polyphenol;flavonoids

TS207.3

A

1002-0306(2011)11-0451-03

油茶(Camellia oleifera Abel.)是我國特有的木本油料樹種，目前全國種植面積約為400萬hm2，主要分布在湖南、江西、廣西、浙江、福建、安徽和貴州等地。我國對(duì)油茶的利用主要集中在將油茶籽進(jìn)行榨油，油茶籽粕提取皂素。占油茶果總重量近60%的油茶蒲基本上被廢棄或焚燒處理，造成很大的資源浪費(fèi)和環(huán)境污染。前期報(bào)道指出，油茶蒲含有大量木質(zhì)素、多縮戊糖、蛋白質(zhì)和皂素等化學(xué)成分，可以用來生產(chǎn)栲膠、糠醛、木糖醇、活性炭等［1］;其提取物具有很強(qiáng)的抗氧化、抗腫瘤功能［2］。但對(duì)其中的次生代謝產(chǎn)物如皂素、多酚、黃酮的含量及測定方法還未具體報(bào)道。本研究采用紫外-可見分光光度法，分別以人參皂苷、沒食子酸、蘆丁為對(duì)照品，建立了準(zhǔn)確、快速、穩(wěn)定，適用于油茶蒲提取物中總皂素、總酚、總黃酮的測定方法。

2010-09-14 *通訊聯(lián)系人

羅曉偉(1987-)，女，碩士研究生，研究方向:油茶副產(chǎn)物的加工利用。

國家自然科學(xué)基金(30872056)。