張劍峰，項(xiàng)崢，竇德強(qiáng)

(遼寧中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，遼寧 大連 116600)

血塞通注射液溶血檢測(cè)方法研究△

張劍峰，項(xiàng)崢，竇德強(qiáng)*

(遼寧中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，遼寧 大連 116600)

目的:篩選出一種較好的用于檢測(cè)中藥注射劑溶血的方法。方法采用肉眼觀察法、紅細(xì)胞計(jì)數(shù)法以及分光光度法對(duì)血塞通注射液溶血度進(jìn)行測(cè)定。結(jié)果各種方法測(cè)定的結(jié)果有所差異。肉眼觀察法判斷沒有溶血或不明顯的結(jié)果，紅細(xì)胞計(jì)數(shù)法和分光光度法均可測(cè)定出具體數(shù)值，且結(jié)果在溶血趨勢(shì)上具有一定的一致性。紅細(xì)胞計(jì)數(shù)法測(cè)定每組的RSD值均大于5%，而分光光度法則均小于5%。結(jié)論分光光度法更方便、準(zhǔn)確，適用于中藥注射劑溶血監(jiān)測(cè)使用。

溶血;不良反應(yīng);分光光度法

近年來(lái)，有關(guān)臨床上中藥注射劑不良反應(yīng)的報(bào)道屢見不鮮，尋找出既簡(jiǎn)便又有效的監(jiān)測(cè)方法迫在眉睫。其中對(duì)于中藥注射劑溶血性試驗(yàn)， 《中國(guó)藥典》中規(guī)定采用肉眼觀察法對(duì)注射劑溶血進(jìn)行評(píng)價(jià)[1]。此法雖簡(jiǎn)便、易行，適用于溶血明顯的樣品，并給出定性判斷，但由于其通過肉眼來(lái)觀察，有時(shí)又受到注射劑本身顏色的影響及少量溶血時(shí)觀察不明顯，溶血情況很難判斷，主觀誤差影響較大。因此，肉眼觀察法已經(jīng)不能對(duì)各種程度的溶血做出準(zhǔn)確的判斷，需尋找出一種更有效、簡(jiǎn)便的方法。據(jù) 《藥物研究技術(shù)指導(dǎo)原則》[2]以及文獻(xiàn)[3，4]報(bào)道， 還有紅細(xì)胞計(jì)數(shù)法、分光光度法、體內(nèi)溶血試驗(yàn)法以及乳酸脫氫酶活性測(cè)定法4種溶血測(cè)定方法，乳酸脫氫酶活性測(cè)定法用于診斷臨床血液病，而非用于中藥注射劑溶血檢測(cè)，因此本實(shí)驗(yàn)未對(duì)其進(jìn)行討論研究。

由于皂苷類成分多具有溶血作用，其與血紅細(xì)胞壁上的膽甾醇結(jié)合生成不溶性分子復(fù)合物沉淀，造成血紅細(xì)胞正常滲透性被破壞而發(fā)生破裂，進(jìn)而產(chǎn)生溶血[5]，因此在一定程度上影響了其臨床使用。本實(shí)驗(yàn)以主要成分為三七總皂苷的血塞通注射液為例，分別采用紅細(xì)胞計(jì)數(shù)法，分光光度法以及常規(guī)肉眼觀察法對(duì)血塞通溶血度測(cè)定并對(duì)各種方法加以比較，找出有效、簡(jiǎn)便、穩(wěn)定的方法，為監(jiān)測(cè)中藥注射劑溶血反應(yīng)提供參考依據(jù)。

1 儀器與材料

1.1 儀器

UV-2100分光光度計(jì)(上海 UNICO公司)，TDZ4-WS臺(tái)式離心機(jī)(長(zhǎng)沙湘儀離心機(jī)儀器有限公司)，Matrix CellMate II移液器，dragon-med可調(diào)式移液器(大龍醫(yī)療設(shè)備上海有限公司)，紅細(xì)胞計(jì)數(shù)板，OLYMPUSBX50顯微鏡，HH-S型水浴鍋(鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司)。

1.2 試劑

氯化鈉注射液(赤峰榮濟(jì)堂藥業(yè)有限公司，批號(hào):09123843)，血塞通注射液(哈爾濱珍寶制藥有限公司，規(guī)格:2mL∶0.1g，批號(hào):20091108 43，20091128 41)。

1.3 動(dòng)物

家兔(購(gòu)于大連大學(xué)動(dòng)物室)。

2 方法

2.1 實(shí)驗(yàn)條件

參考 《中國(guó)藥典》 規(guī)定[1]以及先前實(shí)驗(yàn)結(jié)果[6]并經(jīng)考察，確定實(shí)驗(yàn)條件為:1.1%血細(xì)胞懸液2.5 mL，3.5 mL不同濃度血塞通注射液及氯化鈉注射液混合液，(37±0.5)℃水浴2 h后采用肉眼觀察法以及血細(xì)胞計(jì)數(shù)法評(píng)價(jià)其溶血程度。以分光光度法測(cè)定同樣樣品時(shí)，對(duì)樣品離心10 min(轉(zhuǎn)速為3 000 r·min-1)，離心后取上清液，575 nm處測(cè)定吸光度[7]，同時(shí)設(shè)立陰性對(duì)照組及陽(yáng)性對(duì)照組。

2.2 1.1%紅細(xì)胞混懸液制備

少量玻璃珠放入潔凈燒杯，將健康家兔耳緣靜脈取血于其中，輕輕不斷搖晃。去除纖維蛋白后，用滴管將血液移至刻度離心管中。以氯化鈉注射液洗滌，離心，除去上層液體。反復(fù)操作至上清液無(wú)色澄清為止，所得的紅細(xì)胞以生理鹽水配制成1.1%的紅細(xì)胞混懸液，并于當(dāng)天用于實(shí)驗(yàn)，用時(shí)搖勻。

2.3 溶液配制方法

取血塞通注射液 0.1， 0.3， 0.5， 0.7， 0.9，1.1 mL，加入到不同試管中，用氯化鈉注射液補(bǔ)充反應(yīng)總體積至3.5 mL，作為供試品管。另取新鮮蒸餾水3.5 mL作為陽(yáng)性對(duì)照管，氯化鈉注射液3.5 mL作為陰性對(duì)照管。上述各管分別加入1.1%紅細(xì)胞混懸液2.5 mL，輕輕混勻。另向新試管中加入與各試驗(yàn)管內(nèi)相同含量的血塞通注射液，并加入適量氯化鈉注射液使體積達(dá)到6 mL，作為供試品對(duì)照管。見表1。

表1 各試驗(yàn)組溶液配比/mL

2.4 肉眼觀察法

將37℃水浴2 h后的各管取出，對(duì)陽(yáng)性對(duì)照管、陰性對(duì)照管、每組供試品管及其供試品對(duì)照管進(jìn)行顏色觀察，通過肉眼來(lái)判斷溶血情況。試管中的溶液呈澄明紅色，管底無(wú)或者有少量細(xì)胞殘留，表明有溶血發(fā)生;紅細(xì)胞全部沉淀，且上清液無(wú)色澄明，或者有色澄明，但供試品管和陰性對(duì)照管或供試品對(duì)照管顏色無(wú)明顯差異，則表明無(wú)溶血發(fā)生。

2.5 紅細(xì)胞計(jì)數(shù)法

將目視法觀察后的每組試管搖勻，分別吸取一滴滴于細(xì)胞計(jì)數(shù)板上(由于最終確定值為比例值，為了使數(shù)據(jù)更具有廣泛性，本實(shí)驗(yàn)未對(duì)樣品進(jìn)行稀釋。)。待沉降完全，在低倍鏡下觀察計(jì)數(shù)板內(nèi)的紅細(xì)胞分布是否均勻。確定均勻后把計(jì)數(shù)板中央的大方格置于視野中，將顯微鏡調(diào)成高倍鏡觀察，計(jì)數(shù)5個(gè)中方格(總共80個(gè)小方格)內(nèi)的紅細(xì)胞數(shù)量。為避免計(jì)數(shù)重復(fù)或遺漏，壓在線上的紅細(xì)胞，本實(shí)驗(yàn)只記錄方格4條線中上側(cè)線和左側(cè)線。最后計(jì)算每組試驗(yàn)管的紅細(xì)胞數(shù)與陰性管的紅細(xì)胞數(shù)的比值。溶血度(%)=(1-試驗(yàn)管紅細(xì)胞數(shù)/陰性管紅細(xì)胞數(shù))×100%。每組共做6份樣品，每份樣品取樣2次，求平均值。最終求6份樣品的平均值與RSD值，并計(jì)算溶血度。

2.6 分光光度法

根據(jù)血細(xì)胞釋放出來(lái)的血紅素在575 nm的條件下有最大吸收[6]，采用分光光度法測(cè)定每組樣品的吸光度，來(lái)反映血塞通注射液溶血度。將37℃水浴2 h后的每組試管離心10 min(3 000 r·min-1)，后將各組試管內(nèi)的上清液吸于比色皿內(nèi)，在575 nm下以陰性對(duì)照管為空白，記錄其余各管的吸光度。溶血度(%)=[(A試驗(yàn)管-A陰性管)/(A陽(yáng)性管-A陰性管)]×100%，A為樣品吸光度值。求出每組平均值，計(jì)算RSD值與溶血度。

3 結(jié)果

3.1 肉眼觀察結(jié)果

經(jīng)與陰性對(duì)照管、陽(yáng)性對(duì)照管和供試品對(duì)照管對(duì)比后，相同濃度下不同批號(hào)血塞通注射液肉眼觀察溶血情況大致相同，結(jié)果見表2。

表2 肉眼觀察法檢測(cè)血塞通注射液溶血結(jié)果

3.2 紅細(xì)胞計(jì)數(shù)法溶血度測(cè)定結(jié)果

對(duì)于兩種批號(hào)的血塞通注射液溶血度的測(cè)定，紅細(xì)胞計(jì)數(shù)法測(cè)得的溶血度與血塞通注射液濃度呈一定的正相關(guān)性。即隨著注射劑濃度的增大，溶血度增大。測(cè)得每組溶血度的RSD值均大于5%。結(jié)果見表3、4。

表3 紅細(xì)胞計(jì)數(shù)法測(cè)定血塞通注射液溶血度結(jié)果(20091108 43)/%

表4 紅細(xì)胞計(jì)數(shù)法測(cè)定血塞通注射液溶血度結(jié)果(20091128 41)/%

3.3 分光光度法溶血度測(cè)定結(jié)果

分別對(duì)兩批血塞通注射液的溶血度采用分光光度法測(cè)定的結(jié)果表明，測(cè)得的溶血度也隨著血塞通注射液的濃度增高而增高。與紅細(xì)胞計(jì)數(shù)法相比，相同給藥劑量下分光光度法計(jì)算出的溶血度小，且每組RSD值均小于5%。結(jié)果見表5、6。

表5 分光光度法測(cè)定血塞通注射液溶血度結(jié)果(20091108 43)/%

表6 分光光度法測(cè)定血塞通注射液溶血度結(jié)果(20091128 41)/%

3.4 3種測(cè)定方法結(jié)果比較

實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，肉眼觀察判斷有溶血的樣品，紅細(xì)胞計(jì)數(shù)法測(cè)定的溶血度均大于75%，分光光度法測(cè)定的溶血度則大于50%;肉眼判斷不溶血或不確定溶血的樣品，紅細(xì)胞計(jì)數(shù)法測(cè)定的溶血度在0%～75%，分光光度法測(cè)定的溶血度則在0%～50%。同種方法對(duì)不同批號(hào)血塞通注射液的溶血度測(cè)定，結(jié)果差別不大;而不同方法對(duì)同一批號(hào)血塞通注射液測(cè)定，結(jié)果差異較大，但趨勢(shì)相似，結(jié)果見表7。以每試管中加入血塞通注射液在整個(gè)反應(yīng)體系中的濃度為橫坐標(biāo)，溶血度為縱坐標(biāo)，分別對(duì)同種方法測(cè)定不同批號(hào)血塞通注射液、不同方法測(cè)定同一批號(hào)血塞通注射液進(jìn)行作圖分析，見圖1～4。

表7 不同方法測(cè)定血塞通注射液溶血度結(jié)果(x±s)/%

圖1 分光光度法測(cè)定血塞通注射液溶血度變化圖

圖2 紅細(xì)胞計(jì)數(shù)法測(cè)定血塞通注射液溶血度變化圖

圖3 紅細(xì)胞計(jì)數(shù)法與分光光度法測(cè)定血塞通注射液溶血度對(duì)比圖(20091108 43)

圖4 紅細(xì)胞計(jì)數(shù)法與分光光度法測(cè)定血塞通注射液溶血度對(duì)比圖(20091128 41)

4 結(jié)論與討論

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，肉眼觀察法可判定產(chǎn)生溶血的樣品，用分光光度法測(cè)定其溶血度都在50%以上，紅細(xì)胞計(jì)數(shù)法測(cè)定的溶血度在75%以上;對(duì)于肉眼觀察法觀察溶血不明顯，結(jié)論不確定或者不溶血者，分光光度法測(cè)定溶血度在0%～50%，而細(xì)胞計(jì)數(shù)法則在0%～75%。這與文獻(xiàn)[8，9]報(bào)道結(jié)果大致相同。但對(duì)于介于溶血不明顯或不能確定的樣品，不同人的觀察判斷結(jié)果不同。因此，肉眼觀察法對(duì)結(jié)果的判斷受主觀影響的誤差較大。

《中國(guó)藥典》規(guī)定采用肉眼觀察法對(duì)中藥注射劑溶血進(jìn)行觀察。此法雖簡(jiǎn)便，省時(shí)，但適用于溶血現(xiàn)象明顯的樣品。由于其通過肉眼來(lái)觀察，有時(shí)又受到注射劑本身顏色和部分血細(xì)胞破裂后釋放出的血紅素顏色的影響，主觀誤差對(duì)結(jié)果產(chǎn)生的影響較大。而《藥物研究技術(shù)指導(dǎo)原則》[2]中對(duì)分光光度法測(cè)定溶血試驗(yàn)的參考指標(biāo)明確指出，當(dāng)溶血率＞5%時(shí)，表明有溶血發(fā)生，此時(shí)本實(shí)驗(yàn)中肉眼觀察法結(jié)果卻為陰性。因此肉眼觀察法對(duì)中藥注射劑溶血反應(yīng)發(fā)生程度無(wú)法給予準(zhǔn)確判斷，需尋找出適宜的方法代替肉眼觀察法。

結(jié)合《中國(guó)藥典》與文獻(xiàn)[6，7]，本實(shí)驗(yàn)最開始對(duì)部分影響溶血測(cè)定的因素進(jìn)行了考察。為平行對(duì)照肉眼觀察法與另外兩種溶血檢測(cè)方法，水浴溫度參照《中國(guó)藥典》規(guī)定，選取(37±0.5)℃。以陰性對(duì)照組和陽(yáng)性對(duì)照組為試驗(yàn)管分別對(duì)保溫時(shí)間為30，45，60，90，120，150 min進(jìn)行了考察，結(jié)果表明，陰性對(duì)照組水浴150 min內(nèi)不發(fā)生自然衰敗，而陽(yáng)性對(duì)照組在30 min內(nèi)即產(chǎn)生全溶血，并且隨時(shí)間的增加，其吸光度值不再改變。而實(shí)驗(yàn)過程中發(fā)現(xiàn)，加入一定量血塞通注射液的供試品隨著水浴時(shí)間延長(zhǎng)，其溶血度也逐漸增大。因此，選用120 min水浴時(shí)間，同文獻(xiàn)[7]報(bào)道半小時(shí)水浴時(shí)間相比，其優(yōu)勢(shì)在于便于觀察低劑量注射液溶血反應(yīng)情況且樣品用量少;降低由于人為操作時(shí)間差異而引起的誤差;同時(shí)由于反應(yīng)時(shí)間相對(duì)較長(zhǎng)，更有利于觀察血塞通注射液對(duì)紅細(xì)胞混懸液的影響。本實(shí)驗(yàn)又對(duì)離心速度和時(shí)間進(jìn)行了考察。選用離心時(shí)間為10 min，轉(zhuǎn)速分別為1 000， 2 000， 3 000， 4 000 r·min-1，結(jié)果發(fā)現(xiàn)1 000，2 000 r·min-1仍可以觀察到離心不完全的現(xiàn)象，3 000 r·min-1時(shí)10 min就可達(dá)到完全分離效果，4 000 r·min-1也可達(dá)到完全分離，但因轉(zhuǎn)速較高，為避免離心速度過快而造成外力溶血，故選用離心速度為3 000 r·min-1，離心時(shí)間為10 min。因此確定實(shí)驗(yàn)條件為水浴溫度(37±0.5)℃，水浴時(shí)間2 h，離心速度3 000 r·min-1，離心時(shí)間10 min。

紅細(xì)胞計(jì)數(shù)法與肉眼觀察法相比，不受主觀誤差的影響，但是實(shí)驗(yàn)操作繁瑣，觀察時(shí)間較長(zhǎng)，在測(cè)定過程中紅細(xì)胞易發(fā)生自身破裂，且對(duì)于滴于計(jì)數(shù)板上的樣品內(nèi)紅細(xì)胞分布要求均勻，一旦不均勻則需重新測(cè)定，此過程又可造成一些血細(xì)胞破裂。此外，如表3、4所示，紅細(xì)胞計(jì)數(shù)法的測(cè)定結(jié)果顯示其RSD值均較大，表明其精密度差，會(huì)造成測(cè)量值不準(zhǔn)確，因此對(duì)注射劑溶血的檢測(cè)實(shí)用性較低。

分光光度法同其他兩種方法相比，其優(yōu)勢(shì)在于實(shí)驗(yàn)操作簡(jiǎn)便，測(cè)量時(shí)間短，且能給出定量結(jié)論。即使注射劑顏色較深，也可用供試品對(duì)照溶液來(lái)校正，大大減小主觀誤差影響。表5、6結(jié)果顯示，每組實(shí)驗(yàn)的RSD值均小于5%，故分光光度法的精密度好。測(cè)量結(jié)果值準(zhǔn)確，誤差較小。因此適用于檢測(cè)中藥注射劑溶血度。

如圖3、4所示，紅細(xì)胞計(jì)數(shù)法與分光光度法相比，兩者對(duì)溶血度上升趨勢(shì)的測(cè)定有一定的一致性，即隨著血塞通注射液濃度的增加，兩者的溶血度測(cè)量值也相應(yīng)地增高。但紅細(xì)胞計(jì)數(shù)法得到的溶血度通常大于分光光度法的結(jié)果，這可能由于采用紅細(xì)胞計(jì)數(shù)法操作過程繁瑣且耗時(shí)較長(zhǎng)引起紅細(xì)胞的破裂而造成溶血度偏高。因此采用分光光度法測(cè)定血塞通注射液的溶血度更簡(jiǎn)便、快捷、誤差小，分光光度法更適合用于檢測(cè)中藥注射劑溶血反應(yīng)。

[1]國(guó)家藥典委員會(huì).中國(guó)藥典(一部)[S].北京:中國(guó)醫(yī)藥科技出版社，2010:附錄92.

[2]國(guó)家食品藥品監(jiān)督管理局.藥物研究技術(shù)指導(dǎo)原則(中藥、天然藥物刺激性和溶血性研究的技術(shù)指導(dǎo)原則)[M].北京:中國(guó)醫(yī)藥科技出版社，2005:230.

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Study on Detecting Methods of Haemolysis for Xuesaitong Injection

ZHANG Jian-feng，XIANG Zheng，DOU De-qiang
(College of Pharmacy Liaoning University of Traditional Chinese Medicine，Dalian116600，China)

Objective:To find a better method for detecting the haemolysis of Traditional Chinese Medicine Injections.Methods:Apply macroscopic observation，cytometry and spectrophotometry to determine the haemolytic degree of Xuesaitong Injection.Results:The data given by different methods varied from each other.The results given by visual inspection，which showed little or unclear haemolysis phenomena，can be got in specific value by the other two methods.Meanwhile，cytometry and spectrophotometry have coherence in the uptrend of haemolysis.All the relative standard deviation(RSD)of different groups got from cytometry were more than 5%while spectrophotometry were less than 5%.Conclusion:Spectrophotometry is more convenient and suitable than the other two in inspection of haemolytic degree of TCM Injections.

Haemolysis;Adverse drug reaction;Spectrophotometry

高等學(xué)校博士學(xué)科點(diǎn)專項(xiàng)科研基金課題(20092133110001)，國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(30973859)，遼寧省高等學(xué)校優(yōu)秀人才支持計(jì)劃項(xiàng)目(2008RC34)

*竇德強(qiáng)，E-mail:doudeqiang2003@yahoo.com.cn

2010-06-19)