湖南省衡陽(yáng)市中心醫(yī)院（421001）顏瀅

湖南省南華大學(xué)附一醫(yī)院（421001）李卓

銀芩膠囊是由金銀花、黃芩、魚(yú)腥草、散去葉合理配方所制成的硬膠囊劑，其內(nèi)容物為黃色至黃褐色顆粒和粉末，氣微，味苦。本品具有清熱解毒，清宣風(fēng)熱之功效，用于外感風(fēng)熱所致的發(fā)熱、咳嗽、咽痛及呼吸道感染見(jiàn)以上癥狀者[1]。本品尚未收載入《中國(guó)藥典》，為了有效控制藥品質(zhì)量，確保該制劑的療效，本文以方中主藥黃芩的有效成分黃芩苷為定量控制指標(biāo)，采用高效液相色譜法（HPLC）測(cè)定銀芩膠囊中黃芩苷的含量，方法簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確，現(xiàn)報(bào)告如下：

1 儀器與試藥

1.1 儀器 日本島津SPD-10AVP高效液相色譜儀，包括LC-10ATVP-一元高壓泵，SPD-10AVP紫外檢測(cè)器，CTO-10ASVP柱溫箱，S C L-1 0 A V P 系統(tǒng)控制器；LibrorAEG-200電子天平(日本島津制造所)；Millipore simplicity-185超純水器(美國(guó)密理博公司)；LS-3120 超聲波發(fā)生器(美國(guó)科學(xué)系統(tǒng)公司)；RE- 52A 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器(上海青浦滬西儀器廠)。

1.2 試藥 甲醇(色譜純) ；磷酸(分析純) ；四氫呋喃(分析純) ；黃芩苷對(duì)照品(由中國(guó)藥品生物制品檢定所提供，批號(hào)為110715-200815，含量測(cè)定用) ；銀芩膠囊(昆明制藥集團(tuán)股份有限公司生產(chǎn)，批號(hào)090611、091121和091125)及其空白樣品由某有限責(zé)任公司提供。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件[2～5]色譜柱：大連依利特C18柱( 250mm×4mm, 10μm) ；流動(dòng)相:甲醇- 磷酸- 四氫呋喃( THF) ( 45: 55: 6) (磷酸為pH=2.7 的磷酸水溶液)；流速:1ml/min；柱溫:25℃；檢測(cè)器波長(zhǎng):280nm。

2.2 系統(tǒng)試用性試驗(yàn) 按供試品含量測(cè)定項(xiàng)下方法制備對(duì)照品溶液, 取該對(duì)照品溶液、供試品溶液各20μl, 注入液相色譜儀。理論塔板數(shù)以黃芩苷計(jì), 理論板數(shù)n=3.54(tR／Wh/2)2=3486，說(shuō)明在選定的條件下，色譜柱的某些條件如柱長(zhǎng)、載體性能及色譜柱填充均符合要求，測(cè)定效果良好；分離度R>1.5。

2.3 對(duì)照品溶液的制備 精密稱(chēng)取黃芩苷對(duì)照品(60℃減壓干燥至恒重) 3.7mg，置于100ml容量瓶中，加20ml甲醇超聲20min，完全溶解后加水至刻度，0.45μm的濾膜過(guò)濾制成對(duì)照品溶液。

2.4 供試品溶液的制備 取銀芩膠囊3盒，每盒隨機(jī)取10粒，除去膠囊殼，取本品膠囊內(nèi)容物約2.5g，精密稱(chēng)定，置50mL量瓶中，加甲醇45mL，超聲處理40min，放冷后，甲醇定容至刻度，搖勻，靜置，經(jīng)0.45μm 微孔濾膜過(guò)濾，取續(xù)濾液，即得。

2.5 線(xiàn)性關(guān)系考察 分別精密吸取“2.3”項(xiàng)下的對(duì)照品溶液1ml、2ml、4ml、6ml、8ml 與10ml容量瓶中，70%甲醇定容，混勻。各精密進(jìn)樣20μl，測(cè)得峰面積，以峰面積對(duì)濃度(μg/ml) 進(jìn)行線(xiàn)性回歸，結(jié)果表明在3.7～29.6μg/ml的濃度范圍內(nèi)，線(xiàn)性關(guān)系良好。標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)為: Y=57417x- 31303，γ=0.9998。

2.6 進(jìn)樣精密度試驗(yàn) 取“2.3”項(xiàng)下對(duì)照品溶液5ml置于10ml 的容量瓶中，70% 的甲醇定容至10ml，經(jīng)過(guò)0.45μm 的微孔濾膜過(guò)濾，濾液重復(fù)進(jìn)樣5次，每次進(jìn)樣20μl，依據(jù)測(cè)定結(jié)果計(jì)算RSD為0.67%( n=5) ，小于2.0%，符合要求。

2.7 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取“2.3”、“2.4”項(xiàng)下對(duì)照品溶液，供試品溶液，分別在0、2、4、12、24h時(shí)注入液相色譜儀中測(cè)定，測(cè)得黃芩苷的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差分別為1.5%、2.3%，說(shuō)明對(duì)照品溶液、供試品溶液在24h內(nèi)穩(wěn)定。

2.8 重現(xiàn)性試驗(yàn) 精密吸取樣品批號(hào)為091106的銀芩膠囊，按“2.4”項(xiàng)下的方法制備5份，分別進(jìn)樣20μl，按“2.1”項(xiàng)下的色譜條件進(jìn)行測(cè)定，測(cè)得黃芩苷平均含量為3.19mg/ml，RSD=1.6%(n=5) ，說(shuō)明本方法重現(xiàn)性良好。

2.9 加樣回收率試驗(yàn) 取已知含量的樣品（批號(hào)090611），精密吸取6 份，分別加入一定量的黃芩苷對(duì)照品，按“2.4”項(xiàng)下方法制備，并按“2.1”項(xiàng)下的色譜條件進(jìn)行測(cè)定，試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)附表1。

2.10 樣品含量測(cè)定 精密吸取按“2.4”項(xiàng)下的方法制備的供試品溶液各20μl，按“2.1”項(xiàng)下的色譜條件進(jìn)行測(cè)定，4批供試品含量測(cè)定結(jié)果詳見(jiàn)附表2。

附表1 加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果（n=6）

附表2 樣品含量測(cè)定結(jié)果（n=5）

3 討論

3.1 在流動(dòng)相選擇方面，通過(guò)調(diào)節(jié)比較水和甲醇的比例，溶液的pH 值、流動(dòng)相中TPF的含量等幾方面，以獲取最佳的分析條件。經(jīng)過(guò)多次實(shí)驗(yàn)，得出如下結(jié)論：①增加甲醇比例，增加洗脫能力，減小保留時(shí)間，但是理論塔板數(shù)就會(huì)減小，不能達(dá)到要求，并使樣品的峰分離不完全。②水相的比例增加，作用和甲醇相反，增加比例就會(huì)使理論塔板數(shù)增大，但是當(dāng)比例達(dá)到65%以后，保留時(shí)間遠(yuǎn)大于20min，故不宜采用。③因?yàn)閷?shí)驗(yàn)所用高效液相色譜柱的pH適用范圍是2～8，酸性太強(qiáng)和堿性太強(qiáng)，易使柱內(nèi)填料變性，致使柱效降低，為保證柱效采取磷酸溶液調(diào)節(jié)純化水到pH 值為2.7。④流動(dòng)相中加入適量的四氫呋喃可改善峰型，使理論塔板數(shù)增大，最終確定流動(dòng)相為甲醇-磷酸-四氫呋喃（45: 55: 6），能保證分離效果好，出峰時(shí)間短，柱效高。

3.2 取質(zhì)量濃度為10μg/mL 的對(duì)照品溶液，在200～400nm波長(zhǎng)范圍內(nèi)進(jìn)行紫外掃描，結(jié)果在280nm 波長(zhǎng)處有最大吸收，故以280nm為檢測(cè)波長(zhǎng)。

3.3 該方法簡(jiǎn)便易行、準(zhǔn)確度高、被測(cè)溶液穩(wěn)定，可作為銀芩膠囊中黃芩苷的含量測(cè)定方法來(lái)對(duì)銀芩膠囊進(jìn)行質(zhì)量控制。