黑龍江省中醫(yī)藥大學(xué)附屬第一醫(yī)院（150040）姚晶萍

黑龍江省哈爾濱市社會(huì)保險(xiǎn)局醫(yī)院（150030）倪延群

黑龍江省中醫(yī)藥大學(xué)附屬第一醫(yī)院（150040）王瑩威 張潔玉 吳效科

芫花Daphne genkwa Sieb.et Zucc.為瑞香科植物。廣泛分布于我國長江流域各省和黃河流域的部分地區(qū)。芫花的葉、花及根均為傳統(tǒng)中藥。芫花根在民間曾被用來治療多種癌腫，療效顯著。芫花根還可以治療腹水、急性乳腺炎等。化學(xué)成分研究表明，芫花根主要含有黃酮、香豆素和萜類化合物。芫花根總黃酮 (TFRD)主要由瑞香素系列的雙黃酮組成，毛瑞香素是其主要成分，含量為42 .79%[1]。本研究探討TFRD抗腫瘤活性、其對(duì)不同腫瘤及裸鼠種植瘤的抑制作用。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及瘤株 BALB/c（nu/nu）裸小鼠，4周齡，雌性，體重 18～20g；C57BL/6小鼠，由北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司提供。飼養(yǎng)于屏障系統(tǒng)潔凈層流架內(nèi)（SPF級(jí)），飲用酸水（pH3～4），進(jìn)食添加復(fù)合維生素B的標(biāo)準(zhǔn)飼料。飼料、墊料及其他裸鼠接觸物品均經(jīng)高壓滅菌。室內(nèi)每日保持10h光照，14h無光的明暗周期，定期紫外線照射和高壓滅菌消毒。室溫控制在（25±1）℃，相對(duì)濕度40%～60%。Hela、Walk-250、MCF-7、HA-116、K293-T細(xì)胞、人卵巢癌HO8910細(xì)胞株由哈醫(yī)大三院腫瘤研究所惠贈(zèng)。細(xì)胞置于含10%滅活胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基中（青霉素100U/ml、鏈霉素100μg/ml、谷氨酰胺30μg/ml），放入37℃、5% CO2孵箱，按常規(guī)方法培養(yǎng)，取對(duì)數(shù)生長期的細(xì)胞用于試驗(yàn)。

1.2 藥品及試劑 胎牛血清（美國Sigma公司）；氟尿嘧啶（上海旭東海普藥業(yè)有限公司，批號(hào)：031106）；二甲基亞砜（DMSO）、刀豆蛋白（ConA）、脂多糖（LPS）、MTT以及臺(tái)盼藍(lán)（均為美國 Sigma公司）；RMP I-1640與DMEM/f-12培養(yǎng)基（美國Sigma公司）；淋巴分離液TBD （中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院生物工程研究所）；其余試劑為國產(chǎn)分析純；96孔細(xì)胞培養(yǎng)板以及細(xì)胞培養(yǎng)瓶（美國Sigma公司）。

1.3 芫花根總黃酮的制備 取芫花根2kg粉碎，以無水乙醇（固液比1∶4）60℃浸提24h，浸提液離心除渣，上清液合并濃縮得粗浸膏，粗浸膏過ADS217大孔樹脂，以去離子水洗滌除去水溶性雜質(zhì)，再以無水乙醇洗脫得黃色乙醇洗脫液，減壓蒸餾后過200～300目硅膠柱，氯仿-甲醇（1∶1）洗脫物經(jīng)濃縮即得芫花根總黃酮（TFRD）239g，得率11.95%。TFRD經(jīng)吐溫 280乳化，以氯化鈉注射液配制成濃度確定的乳液，備用。

1.4 細(xì)胞毒活性實(shí)驗(yàn) 定量稱取TFRD、DMSO溶解后以DMEM/f-12基本培養(yǎng)基稀釋成6個(gè)不同濃度梯度，加入預(yù)先培養(yǎng)24h的Hela、Walk-250、MCF-7、HA-116、K2932 T細(xì)胞株、人卵巢癌HO8910細(xì)胞的96孔培養(yǎng)板中，每個(gè)濃度梯度重復(fù)5次。繼續(xù)在37℃，含有5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48h。MTT法測定 TFRD對(duì)腫瘤細(xì)胞以及K293-T細(xì)胞的毒性。

1.5 抗實(shí)體瘤活性實(shí)驗(yàn) 取BALB/c（nu/nu）裸小鼠120只，隨機(jī)分為12組，每組10只，雌雄各半。人卵巢漿液性上皮癌細(xì)胞株HO8910按每鼠5×107個(gè)細(xì)胞接入小鼠的后肢腋下。TFRD乳液按30mg?kg-1、55mg?kg-1、85mg?kg-13個(gè)劑量對(duì)小鼠灌胃給藥。其中3組在腫瘤接種前3d給藥，3組在腫瘤接種的同時(shí)給藥，3組在腫瘤接種3d后給藥，1次/d，連續(xù)灌胃14d。另設(shè)正常對(duì)照組每天灌胃等體積的生理氯化鈉溶液；模型組，與腫瘤接種的同時(shí)灌胃等體積的生理氯化鈉溶液；陽性對(duì)照組，與腫瘤接種的同時(shí)按30mg?kg-1灌胃氟尿嘧啶。每天記錄小鼠體重，并在接入腫瘤的第7天開始用游標(biāo)卡尺量取腫瘤體積，每2d測量1次。根據(jù)公式：腫瘤體積=長×寬2/2計(jì)算瘤體積[2]，末次給藥24h后，先眼眶取血0.5ml，制備淋巴細(xì)胞懸液，臺(tái)盼藍(lán)染色，用血球計(jì)數(shù)板統(tǒng)計(jì)活性細(xì)胞數(shù)。然后處死小鼠，取腫瘤稱重，按公式：抑瘤率（%）=（模型組瘤重-給藥組瘤重）/模型組瘤重×100%

同時(shí)取胸腺、脾臟，計(jì)算胸腺指數(shù)與脾指數(shù)。

1.6 荷瘤小鼠脾淋巴細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn) 無菌制備上述條件處理的小鼠脾淋巴細(xì)胞,經(jīng)臺(tái)盼藍(lán)染色檢測細(xì)胞活力>95%，用適量完全培養(yǎng)基RMPI-1640調(diào)整細(xì)胞濃度為1×106個(gè)/ml，加入96孔板，每孔100μl。將各處理組小鼠脾淋巴細(xì)胞分為3組，其中2組分別加入ConA，使其終濃度為5μg?ml-1，或加入LPS，使其終濃度為10μg?ml-1。另一組作為平行對(duì)照，不加Con A或LPS。每組設(shè)5個(gè)重復(fù)孔。在37℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)72h，MTT法測定570nm處A值。淋巴細(xì)胞增殖能力以刺激指數(shù)（Stimulation Index，SI）表示，即SI =ACon /A或ALPS /A[2]。

1.7 荷瘤小鼠NK細(xì)胞的殺傷活性實(shí)驗(yàn) 同上無菌制備上述各種處理的小鼠脾淋巴細(xì)胞作為效應(yīng)細(xì)胞，用完全培養(yǎng)基RPMI-1640調(diào)整細(xì)胞濃度為5×106ml-1，加入96孔板，每孔100μl。另取Hela細(xì)胞作靶細(xì)胞，用完全RPM I-1640培養(yǎng)基調(diào)整細(xì)胞濃度為1×105ml-1，加入含有小鼠脾淋巴細(xì)胞的96孔板中，每孔100μl。同時(shí)設(shè)效應(yīng)細(xì)胞對(duì)照組(淋巴細(xì)胞200μl)與靶細(xì)胞對(duì)照組(Hela細(xì)胞200μl)。在37℃，5%CO2的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)8h。MTT法測定570nm處A值。根據(jù)公式[3]計(jì)算NK細(xì)胞的殺傷活性：

NK細(xì)胞殺傷率(%) = 1- (實(shí)驗(yàn)組A值-效應(yīng)細(xì)胞對(duì)照組A值)/靶細(xì)胞對(duì)照組A值×100%

1.8 荷瘤小鼠脾淋巴細(xì)胞分泌白介素-2 （IL-2）取BALB/c（nu/nu）裸小鼠50只，雌雄各半，隨機(jī)分為5組，每組10只。人卵巢癌HO8910細(xì)胞按每鼠5×107個(gè)細(xì)胞接入小鼠的后肢腋下。接種后24h開始灌胃，其中3組按30 mg?kg-1、55 mg?kg-1、85mg?kg-1個(gè)劑量對(duì)小鼠灌胃TFRD乳液。一組為模型組，灌胃等體積的生理氯化鈉溶液；一組為陽性對(duì)照組，灌胃30mg?kg-1氟尿嘧啶；另設(shè)正常對(duì)照組，灌胃等體積的生理氯化鈉溶液，灌胃14d。最后一次灌胃24h后處死小鼠，無菌制備脾淋巴細(xì)胞懸液加入96孔培養(yǎng)板中，每孔100μl，含有淋巴細(xì)胞5×106個(gè)，每孔加入終濃度為5μg?ml-1ConA溶液，置37℃、5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)24h，離心，吸取上清液即為IL-2的待測品。另取C57BL /6小鼠（20±2）g 6只，眼球放血處死，無菌制備小鼠胸腺細(xì)胞懸液加入96孔板中，每孔100μl，含胸腺細(xì)胞1×106個(gè)。將上述IL-2樣品分別加入培養(yǎng)板中，每孔50μl，然后每孔加入終濃度為1μg?ml-1ConA溶液，另設(shè)Co2nA對(duì)照孔，參照文獻(xiàn)[4]方法測定IL-2的活性。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均采用SPSS13.0軟件進(jìn)行t檢驗(yàn)，統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)采用x±s表示。

2 結(jié)果

2.1 對(duì)細(xì)胞毒活性的影響 TFRD對(duì)實(shí)驗(yàn)?zāi)[瘤細(xì)胞和K2932T細(xì)胞表現(xiàn)出不同的細(xì)胞毒活性。在設(shè)定的5個(gè)濃度中，TFRD對(duì)Hela細(xì)胞、人卵巢癌HO8910細(xì)胞顯示出顯著的細(xì)胞毒活性。在濃度為0.125mg?ml-1時(shí)，對(duì)這兩個(gè)腫瘤細(xì)胞的抑制率分別達(dá)到65.95%和45.43%。對(duì)Walk2250、MCF27和HA-116細(xì)胞也表現(xiàn)出較強(qiáng)的細(xì)胞毒活性，在濃度為0.25mg?ml-1時(shí)對(duì)這3 個(gè)腫瘤細(xì)胞的抑制率分別為36.83%、43.19%和39.06%。與之對(duì)比，TFRD對(duì)K293-T細(xì)胞則表現(xiàn)出較低的細(xì)胞毒活性。在同等劑量下，抑制率僅為腫瘤細(xì)胞的1/2～1/10，見附表1。

2.2 對(duì)人卵巢癌HO8910細(xì)胞瘤生長的抑制作用 3個(gè)劑量的TFRD對(duì)人卵巢癌HO8910細(xì)胞瘤均表現(xiàn)出不同程度的抑制作用，并隨給藥時(shí)間的延長和給藥劑量的增加而呈增強(qiáng)的趨勢。3種不同時(shí)間給藥對(duì)人卵巢癌HO8910細(xì)胞瘤的生長的抑制作用略有差異。接種腫瘤前3d預(yù)給藥或后3d給藥，3個(gè)劑量組對(duì)卵巢癌腫瘤的生長均表現(xiàn)出顯著的抑制作用,與接種腫瘤同時(shí)給藥的中劑量（50mg?kg-1）組也顯示出較強(qiáng)的抑制作用。腫瘤接種前3d或腫瘤接種后3d給藥的3個(gè)劑量組以及與腫瘤接種同時(shí)給藥的中劑量(50mg?kg-1)組對(duì)人卵巢癌HO8910細(xì)胞瘤生長的抑制作用均明顯地高于陽性對(duì)照組，見附表2。

附表1 TFRD對(duì)腫瘤細(xì)胞和K2932T細(xì)胞生長抑制率(±s，n =5)

附表1 TFRD對(duì)腫瘤細(xì)胞和K2932T細(xì)胞生長抑制率(±s，n =5)

注：與TFRD對(duì)K293-T細(xì)胞的抑制率比較，bP<0.05，cP<0.01

組別 抑制率（%）0.625 0.125 0.25 0.5 1（mg?ml-1）K293-T 2.43±0.23 8.90±1.04 20.68±3.06 27.92±2.65 29.03±3.61 Hela 27.38±1.53c 66.42±5.67c 71.12±5.86c 77.7±5.32c 84.05±7. 21c HO8910 16.21±1.73b 45.39±4.04c 61.13±6.08c 60.18±4.93c 79.04±8.19c Walk-250 16.20±2.61b 19.43±2.65b 37.32±3.21c 38.32±3.21c 56.10±5.21c MCF-7 6.92±1.08b 23.51±2.65b 42.29±3.80c 9.51±5.54b 53.94±4.93c HA-116 30.45±2.89c 6.35±3.79b 38.96±3.79c 43.62±4.93b 49.83±5.15c

附表2 TFRD對(duì)HO8190腫瘤細(xì)胞生長抑制作用(x±s，n =10)

附表3 對(duì)小鼠體重免疫器官及血液中淋巴細(xì)胞細(xì)胞數(shù)的影響以及對(duì)腫瘤的抑制率(x±s，n=10)

附表4 對(duì)荷瘤小鼠脾淋巴細(xì)胞增殖的影響(x±s，n =10)

2.3 對(duì)荷瘤小鼠體重免疫器官血液淋巴細(xì)胞數(shù)量的影響和對(duì)腫瘤的抑制作用 實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,荷瘤小鼠體重增長明顯低于正常小鼠(P<0.05) 。TFRD在腫瘤接種同時(shí)給藥或提前3d給藥，則使荷瘤小鼠體重恢復(fù)至正常水平以上。腫瘤接種3d后給藥小鼠只有低劑量組小鼠體重恢復(fù)正常水平,中高劑量組小鼠體重則低于對(duì)照組。荷瘤小鼠的脾指數(shù)、胸腺指數(shù)顯著低于正常小鼠(P<0.05，P<0.01) 。TFRD 3種不同給藥時(shí)間給藥可使荷瘤小鼠脾指數(shù)恢復(fù)正常水平。與接種腫瘤同時(shí)給藥的3個(gè)劑量組、提前3d給藥的高劑量組和腫瘤接種3d后給藥的中劑量組可使荷瘤小鼠胸腺指數(shù)恢復(fù)至正常水平。荷瘤小鼠淋巴細(xì)胞數(shù)量顯著減少(P<0.01) 。與腫瘤接種同時(shí)給藥的TFRD可使小鼠血液淋巴細(xì)胞數(shù)量恢復(fù)至正常水平,提前3d給藥或接種3d后給藥的小鼠血液淋巴細(xì)胞數(shù)量顯著高于陽性對(duì)照組小鼠。3種不同時(shí)間給藥對(duì)實(shí)驗(yàn)?zāi)[瘤的抑制率均在44.5%以上。其中，提前3d給藥和接種后3d給藥的TFRD對(duì)腫瘤的抑制作用呈現(xiàn)出一定的量效關(guān)系。與腫瘤接種同時(shí)給藥或提前3d給藥的3個(gè)劑量組，以及腫瘤接種后給藥的中高劑量組對(duì)實(shí)驗(yàn)?zāi)[瘤的抑制作用均顯著地高于陽性對(duì)照，見附表3。

2.4 對(duì)荷瘤小鼠脾淋巴細(xì)胞增殖的影響 實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，荷瘤小鼠脾淋巴細(xì)胞對(duì)ConA引起的增殖反應(yīng)略低于正常小鼠，而對(duì)LPS引起的增殖反應(yīng)則明顯低于正常小鼠。TFRD預(yù)給藥的荷瘤小鼠脾淋巴細(xì)胞增殖反應(yīng)顯著地高于陽性對(duì)照組小鼠，其中中劑量組可使荷瘤小鼠的脾淋巴細(xì)胞增殖反應(yīng)水平超過正常小鼠。與腫瘤接種的同時(shí)給藥或接種3d后給藥的荷瘤小鼠脾淋巴細(xì)胞增殖隨劑量的增加呈上升趨勢。其中經(jīng)中高劑量組處理的荷瘤小鼠淋巴細(xì)胞增殖水平高于正常小鼠，見附表4。

2.5 對(duì)荷瘤小鼠脾淋巴細(xì)胞分泌IL-2的影響 與正常對(duì)照組相比，荷瘤小鼠脾淋巴細(xì)胞分泌IL-2的水平有所下降(P<0.05)。與模型組相比，TFRD的3個(gè)劑量對(duì)荷瘤小鼠脾淋巴細(xì)胞產(chǎn)生IL-2水平有明顯的促進(jìn)作用，隨著劑量的增加而作用逐漸增強(qiáng)，并且TFRD的中高劑量組顯著(P<0.05)高于陽性對(duì)照氟尿嘧啶組，見附圖2。

3 討論

從TFRD組成來看，毛瑞香素B為主要成分，占總黃酮的42.79%；其次為毛瑞香素G和H。而芫花素和芫根苷等單黃酮僅占很小的比例。研究表明，毛瑞香素B是腫瘤細(xì)胞有絲分裂的抑制劑[5]。從結(jié)構(gòu)上看，毛瑞香素B與G、H以及芫花醇A等雙黃酮具有十分相似的分子骨架和官能團(tuán)，因而這些化合物也可能具有抗腫瘤活性。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，TFRD對(duì)人卵巢癌HO8910細(xì)胞的生長有顯著的抑制作用。3種不同給藥時(shí)間對(duì)小鼠腫瘤的抑制作用無顯著差異。但就腫瘤體積而言，預(yù)給藥組小鼠腫瘤增長的速度明顯小于與接種腫瘤同時(shí)給藥組小鼠。值得指出的是，TFRD在接種腫瘤7d后，給藥對(duì)腫瘤的生長仍然有顯著的抑制作用。體外實(shí)驗(yàn)表明，TFRD對(duì)Hela、HO8910、Walk-250、MFC-7和HA-116有顯著的抑制作用，而對(duì)K293-T細(xì)胞生長的抑制作用相對(duì)較弱。說明TFRD對(duì)腫瘤細(xì)胞具有一定的選擇性，具有潛在的抗腫瘤活性。

淋巴細(xì)胞是機(jī)體免疫系統(tǒng)的重要組成部分，直接參與腫瘤免疫[6]。荷瘤小鼠的淋巴細(xì)胞由于受到腫瘤細(xì)胞的誘導(dǎo)而逐漸凋亡[7]，同時(shí)胸腺與脾臟開始萎縮,血液淋巴細(xì)胞數(shù)量大大減少。脾臟和胸腺是淋巴細(xì)胞成熟的重要場所，這兩個(gè)免疫器官的萎縮是導(dǎo)致淋巴細(xì)胞數(shù)量減少的重要原因。ConA主要是引起T淋巴細(xì)胞增殖，LPS主要引起B(yǎng)淋巴細(xì)胞增殖。TFRD能顯著提高荷瘤小鼠脾臟指數(shù)和胸腺指數(shù)，這說明TFRD的抗腫瘤活性可能是通過促進(jìn)荷瘤小鼠胸腺與脾臟的發(fā)育，從而增加淋巴細(xì)胞增殖來實(shí)現(xiàn)的[8～10]。

NK細(xì)胞是細(xì)胞免疫中的非特異性細(xì)胞，是機(jī)體免疫監(jiān)視功能的重要執(zhí)行者，先于T細(xì)胞發(fā)揮作用，能非特異性殺傷腫瘤細(xì)胞，其殺傷作用毋需抗原預(yù)先致敏，也不需要抗體參加，不受MHC限制，為機(jī)體抗腫瘤的第一道防線[11]。TFRD能顯著提高荷瘤小鼠NK細(xì)胞的殺傷活性。

附圖1 NK 細(xì)胞殺傷率比較

附圖2 對(duì)荷瘤小鼠脾淋巴細(xì)胞產(chǎn)生IL-2水平的影響(A570，x±s，n =10)

TFRD對(duì)荷瘤小鼠脾淋巴細(xì)胞產(chǎn)生IL-2水平有明顯的促進(jìn)作用，并隨著劑量的增加，作用逐漸增強(qiáng)。IL-2是刺激T淋巴細(xì)胞由細(xì)胞周期的G 1 期 向S 期 過 渡 的 主要調(diào)節(jié)因子，這說明TFRD是通過IL-2來間接的調(diào)控T淋巴細(xì)胞，促進(jìn)T淋巴細(xì)胞增殖。

綜上所述，TFRD對(duì)小鼠和人卵巢癌HO8910細(xì)胞的生長有顯著的抑制作用，其抗腫瘤活性是通過選擇性殺死腫瘤細(xì)胞和提高外周血淋巴細(xì)胞數(shù)量、促進(jìn)淋巴細(xì)胞的增殖和提高NK細(xì)胞的殺傷活性來實(shí)現(xiàn)的。