冷桂華，王瑞君，孫萬里

(宜春學(xué)院化學(xué)與生物工程學(xué)院，江西省天然藥物活性成分研究重點實驗室，江西宜春336000)

生物催化合成1,3-丙二醇工藝的研究

冷桂華，王瑞君，孫萬里

(宜春學(xué)院化學(xué)與生物工程學(xué)院，江西省天然藥物活性成分研究重點實驗室，江西宜春336000)

以甘油為底物，利用克雷伯氏菌發(fā)酵生產(chǎn)1，3－丙二醇的實驗中，考察了初始甘油濃度、溫度、pH、通氣策略等發(fā)酵條件對1，3－PDO產(chǎn)量的影響。實驗結(jié)果表明:積累1，3－PDO的適合條件為:甘油的初始濃度為40g/L、發(fā)酵溫度37℃、pH7.0、0.5V/V·min的通氣量，發(fā)酵30h，反應(yīng)液中PDO的產(chǎn)量可達(dá)57.63g/L。

生物合成，1，3－丙二醇，發(fā)酵，工藝

克雷伯氏肺炎桿菌(Klebsiella pneumoniae) 由華東理工大學(xué)國家化生中心提供;粗甘油 工業(yè)級，上?；瘜W(xué)試劑采購供應(yīng)站中心化工廠;酵母浸膏生化級，北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司;甘油分析純，天津市福晨化學(xué)試劑廠;維生素B12、甘氨酸生化級，上海國藥集團化學(xué)試劑有限公司;1，3－丙二醇、高碘酸納 分析純，上海國藥集團化學(xué)試劑有限公司;K2HPO4、KH2PO4分析純，成都科龍化工試劑廠;(NH4)2SO4、MgSO4·7H2O、FeSO4·7H2O、MnSO4·4H2O 分析純，天津市永大化學(xué)試劑開發(fā)中心;KOH 化學(xué)純，上海光華化學(xué)試劑廠;種子培養(yǎng)基(g/L) 甘油10，葡萄糖4，K2HPO4·3H2O 0.8，KH2PO40.5，(NH4)2SO42，MgSO4·7H2O 0.5，酵母浸膏3，微量元素1mL，F(xiàn)e2+溶液0.5mL;發(fā)酵培養(yǎng)基(g/L) 甘油40，葡萄糖2，K2HPO41.2，KH2PO40.4，(NH4)2SO43，MgSO4·7H2O 0.5，酵母粉1.5，微量元素1mL，鐵溶液0.6mL;微量元素成分和鐵溶液的配制 參照文獻(xiàn)［5］。

DSX－280A不銹鋼滅菌器 上海申安醫(yī)療器械廠;SPX－250BS－Ⅱ生化培養(yǎng)箱 上海新苗醫(yī)療器械制造有限公司;UV－2000紫外分光光度計 尤尼柯儀器有限公司;BIOTECH－7BGZ磁力攪拌發(fā)酵罐上海保興生物設(shè)備工程公司;SP－3420A氣相色譜儀北京北分瑞利儀器有限公司;BCM－1000A生物潔凈工作臺 蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司;BS224S電子分析天平 北京賽多利斯儀器有限公司。

1.2 1，3一丙二醇的發(fā)酵培養(yǎng)方法

1.2.1 種子培養(yǎng) 250mL三角瓶棉塞加牛皮紙封口，裝液量100mL，接入斜面菌苔1環(huán)，在37℃的生化培養(yǎng)箱、轉(zhuǎn)速為150r/min下培養(yǎng)12h。

1.2.2 發(fā)酵培養(yǎng)

1.2.2.1 分批發(fā)酵 在5L發(fā)酵罐中，裝入發(fā)酵培養(yǎng)基4L，接種量為5%(v/v)，攪拌速度200r/min，發(fā)酵溫度37℃，通氣量0.5V/V·min，發(fā)酵過程中體系pH用5mol/L的NaOH自動調(diào)控為7.0。

1.2.2.2 補料分批發(fā)酵 在5L發(fā)酵罐中，裝入發(fā)酵培養(yǎng)基3L，接種量為5%(v/v)，攪拌速度200r/min，發(fā)酵溫度37°C，通氣量0.5V/V·min，發(fā)酵過程中體系pH用5mol/L的NaOH自動調(diào)控為7.0。在初始甘油降到15g/L以下時開始流加底物甘油，保持甘油濃度在15～25g/L范圍內(nèi)。

1.3 分析方法

1.3.1 生物量測定 采用比濁法，以未接種的發(fā)酵培養(yǎng)基為對照，分光光度計于650nm處檢測細(xì)胞的濃度，根據(jù)干重與OD650對應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)曲線計算。

1.3.2 目的產(chǎn)物1，3－丙二醇以及副產(chǎn)物乙酸和乙醇含量的測定 氣相色譜法測定，檢測器為FID，色譜柱為毛細(xì)管柱，柱溫130℃，汽化室與檢測器的溫度均為240℃，載氣為N2，進(jìn)樣量0.5μL，采用外標(biāo)法定量。

1.3.3 甘油、葡萄糖含量測定 分別采用高碘酸氧化法［6］、DNS比色法［7］。

2 結(jié)果與分析

2.1 在分批發(fā)酵中初始甘油濃度對發(fā)酵的影響

利用克雷伯氏菌的PDO發(fā)酵中，甘油是發(fā)酵底物中的物質(zhì)基礎(chǔ)，提供碳源和能源，其濃度對產(chǎn)物1，3－丙二醇有較大的影響。分別取20、40、60、80g/L的初始甘油濃度進(jìn)行分批發(fā)酵實驗，實驗結(jié)果見圖1、圖2。

圖1 分批發(fā)酵過程中不同初始甘油濃度(g/L)下生物量的變化

由圖1可知，甘油初始濃度在20～60g/L范圍內(nèi)的菌體生長比較好，菌體生長15h左右基本上處于停滯狀態(tài)，初始甘油濃度60g/L稍有生長，但增殖較小，發(fā)酵30h其菌密度比其它兩種情況稍高些。初始甘油濃度為80g/L時，生長相對緩慢得多，菌體密度也偏小。由圖2可以看出，初始甘油濃度分別為40g/L和60g/L時，二者的PDO生物合成情況有相似之處，前者比后者更早到達(dá)最大產(chǎn)量，且濃度稍高些。初始甘油濃度分別為20g/L和80g/L時，二者的PDO生物合成情況也有相似，相比之下，80g/L時的PDO濃度低了很多。結(jié)合圖1、圖2，初始甘油濃度20g/L，在發(fā)酵初期的菌體生長旺盛，可能由于碳源的缺乏影響了PDO的合成。40～60g/L的初始甘油，細(xì)胞生長良好，PDO濃度也高，可能由于底物的抑制作用較小。80g/L的初始甘油濃度過高對發(fā)酵有抑制作用［8］，主要是生成高濃度的3－羥基丙醛，在細(xì)胞中積累到一定濃度，會毒害細(xì)胞，使發(fā)酵終止。綜合成本考慮，分批發(fā)酵中甘油初始濃度選為40g/L最佳。

圖2 分批發(fā)酵過程中不同初始甘油濃度(g/L)下1，3－丙二醇含量的變化

2.2 流加補料發(fā)酵中溫度對1，3－丙二醇生成的影響

溫度是影響微生物生長代謝的基本環(huán)境因素之一，酶活對溫度的變化很敏感，合適的溫度將有利于酶促反應(yīng)，有利于產(chǎn)物的形成。克雷伯氏肺炎桿菌屬于腸道細(xì)菌，生長溫度應(yīng)該接近人體溫度，實驗選用34、37、40℃三個溫度情況來考察溫度對PDO轉(zhuǎn)化的影響，結(jié)果如圖3所示，由圖3可以看出，37℃下的1，3－丙二醇的產(chǎn)量最高，達(dá)到57g/L左右。在40℃條件下其1，3－丙二醇的產(chǎn)量很低。在34℃下產(chǎn)物的最高濃度達(dá) 38g/L左右，所以溫度偏低(34℃)、偏高(40℃)都會影響發(fā)酵產(chǎn)物的產(chǎn)生，低溫可能影響1，3－丙二醇形成的酶系活力，高溫可能對于細(xì)胞有極大的破壞，因此37℃為1，3－丙二醇生物合成中的較理想溫度。

圖3 流加補料發(fā)酵中溫度對1，3－丙二醇生成的影響

2.3 流加補料發(fā)酵中pH對1，3－丙二醇生成的影響

微生物的生長和代謝中，環(huán)境的pH對細(xì)胞的生長與代謝有著重要影響，同樣微生物代謝的活動反過來又會影響環(huán)境液的酸堿狀態(tài)?？死撞戏窝讞U菌屬于腸道細(xì)菌，其生長環(huán)境在pH6.5～7.5之間，實驗方法采用對比實驗，考察pH為6.5、7.0、7.5和不調(diào)pH條件下整個發(fā)酵過程中PDO的生成情況。

圖4表明發(fā)酵液的pH在6.5～7.5之間，產(chǎn)物的積累可以延續(xù)到25～30h，在pH為7的條件下產(chǎn)量可達(dá)到57g/L左右，濃度最大，這與有關(guān)報道克雷伯氏肺炎桿菌產(chǎn)生1，3－丙二醇的最適酸堿環(huán)境pH為7.0左右相適［9］，而不調(diào)pH條件下產(chǎn)物的積累只能持續(xù)10h，并且產(chǎn)量很低，只有15g/L左右，這與克雷伯氏肺炎桿菌代謝甘油，產(chǎn)生有機酸如乙酸，乳酸等，使pH下降，使菌體的生長代謝也受到抑制有著非常密切的關(guān)系。

圖4 流加補料發(fā)酵中pH對1，3－丙二醇生成的的影響

2.4 通氣策略對1，3－丙二醇生成的影響

克雷伯氏肺炎桿菌利用甘油作為底物進(jìn)行分解代謝時，其代謝途徑見文獻(xiàn)［10］，在好氧情況下，代謝主要經(jīng)3－磷酸甘油代謝;在厭氧情況下，甘油代謝將主要通過二羥丙酮途徑。目前有許多報道關(guān)于1，3－丙二醇在有氧參與的情況下發(fā)酵的研究，其產(chǎn)量、生產(chǎn)強度等發(fā)酵結(jié)果要高于厭氧發(fā)酵［11］。為此實驗設(shè)計了三種通氣策略來優(yōu)化發(fā)酵條件。Ⅰ:整個發(fā)酵過程不通空氣;Ⅱ:發(fā)酵0～20h通0.5V/V·min空氣，20～40h不通空氣;Ⅲ:全發(fā)酵過程通0.5V/V· min空氣。實驗結(jié)果如圖5所示。

圖5 流加補料發(fā)酵中通氣策略對發(fā)酵的影響

由圖5可見，在第Ⅱ和第Ⅲ通氣策略下，其OD650始終大于第Ⅰ情況，而且菌體增殖持續(xù)時間更長。三種情況下產(chǎn)物PDO生成量的差別不是很大，Ⅲ在30h積累量最大，接近57g/L，Ⅱ的產(chǎn)量達(dá)55.65g/L，不通氣情況下最小?？紤]到生產(chǎn)成本與操作的方便性，選用全發(fā)酵過程通0.5V/V·min空氣來發(fā)酵生產(chǎn)。

3 結(jié)論與討論

3.1 發(fā)酵液中的初始甘油為40g/L，為克雷伯氏肺炎桿菌利用甘油作為底物進(jìn)行生長代謝提供碳源和能量，代謝中間產(chǎn)物3－羥基丙醛濃度不高，這種有毒的化合物能及時被轉(zhuǎn)化，解除3－羥基丙醛的積累，有利于1，3－丙二醇的合成。

3.2 發(fā)酵液的溫度維持在37℃下，甘油轉(zhuǎn)化成1，3－丙二醇過程中的三個關(guān)鍵酶－甘油脫氫酶(GDH)、甘油脫水酶(GDHt)和1，3－丙二醇氧化還原酶(PDOR)的酶活力達(dá)到較佳狀態(tài)，PDO的產(chǎn)率相對較高。

3.3 發(fā)酵過程中pH為7.0的條件下，菌體生長良好，PDO生物合成量最高，有幾方面的原因:a.GDHt甘油脫水酶的活性恰好在pH為7.0的時候最高［12］，甘油脫水酶為甘油向PDO轉(zhuǎn)化途徑的第一個酶，為1，3－丙二醇發(fā)酵幾個關(guān)鍵酶中的限速酶;b.發(fā)酵液中的pH影響著細(xì)胞內(nèi)的氧化還原電位，影響到NADH/NAD的含量，而PDO合成途徑與胞內(nèi)輔酶的氧化、還原狀態(tài)相關(guān)，也就間接影響到PDO的合成; c.pH對克雷伯氏菌合成1，3－丙二醇過程中的副產(chǎn)物如丁二酸、乳酸、乙酸、乙醇和2，3－丁二醇等有顯著影響［13］，過多的副產(chǎn)物都會毒害細(xì)胞，也抑制產(chǎn)物的形成。

3.4 通氣量在0.5V/V·min的微好氧條件對1，3－丙二醇的發(fā)酵最有利。氧氣的存在會對PDO發(fā)酵中幾種關(guān)鍵酶的活性產(chǎn)生抑制作用［14］，但通入微量的空氣，對發(fā)酵反而有明顯的促進(jìn)作用。原因可能是前期菌體生長時氧的供應(yīng)對菌體生長有利;微量氧作為氫受體有利于調(diào)節(jié)氧化途徑和還原途徑之間的NAD+/NADH平衡，消除厭氧途徑積累的大量NADH。

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Study on the biocatalysis synthetic technique of 1，3－propanediol

LENG Gui－h(huán)ua，WANG Rui－jun，SUN Wan－li
(Chemical and Biological Engineering College，Yichun University，Key Laboratory of Jiangxi Province for Research on Active Ingredients in Natural Medicines，Yichun 336000，China)

The effects of glycerol concentrations，temperature，pH and aeration strategies were investigated on the production of 1，3－propanediol with glycerol as substrate by Klebsiella pneumoniae.The results showed that the most suitable condition of accumulating 1，3－PDO were glycerol concentrations 40g/L，temperatures37℃，pH7.0 and aeration rate 0.5V/V·min，fermentation time 30h，respectively.The PDO concentration in the fermentation broth reached 57.63g/L.

biosynthesis;1，3－propanediol;fermentation;technique

TS201.1

B

1002－0306(2011)12－0136－04

1，3－丙二醇(1，3－propanediol，簡稱1，3－PDO)是一種重要的化工原料，可直接用作防凍劑，是增塑劑、洗滌劑、防腐劑和乳化劑的合成原料［1］，廣泛用于食品、化妝品和制藥等行業(yè)［2］。目前1，3－丙二醇最主要的用途是作為合成聚酯、聚氨酯的主要原料，聚對苯二甲酸丙二酯(PTT)是一種新型聚酯材料，具有許多優(yōu)良特性，主要用于生產(chǎn)纖維和紡織品，是合成纖維新品種開發(fā)的熱點［3］，制約PTT發(fā)展的關(guān)鍵因素在于1，3－丙二醇的成本問題。1，3－丙二醇可通過化學(xué)法和生物法生產(chǎn)［4］，化學(xué)法生產(chǎn)消耗了不可再生的有限資源，造成環(huán)境污染，同時化學(xué)法生產(chǎn)原料及設(shè)備要求高，生產(chǎn)存在設(shè)備投資大、工藝復(fù)雜、條件苛刻和環(huán)境污染，且原料石油資源日益匱乏等問題;生物法具有原料可再生、操作簡便、反應(yīng)條件溫和、副產(chǎn)物較少、環(huán)境污染小等優(yōu)點，越來越受到人們的重視，各國都致力于研發(fā)生物技術(shù)合成1，3－丙二醇。本文以甘油為主要底物、以克雷伯氏肺炎桿菌為菌種，探討發(fā)酵生產(chǎn)1，3－丙二醇的條件，以提高1，3－PDO轉(zhuǎn)化率，降低其成本。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

2011－09－01

冷桂華(1968－)，女，碩士，副教授，研究方向:食品生物技術(shù)。

江西教育廳計劃項目資助(GJJ10603)。