王金勝 魏 武紀(jì)愛芳 任宏政文繼舫

(長治醫(yī)學(xué)院附屬和平醫(yī)院中心實(shí)驗(yàn)室,山西 046000;1中南大學(xué)湘雅醫(yī)學(xué)院病理學(xué)系,長沙 410008)

β-catenin在食管鱗癌中的異常表達(dá)及臨床意義

王金勝 魏 武＊紀(jì)愛芳 任宏政1文繼舫1

(長治醫(yī)學(xué)院附屬和平醫(yī)院中心實(shí)驗(yàn)室,山西 046000;1中南大學(xué)湘雅醫(yī)學(xué)院病理學(xué)系,長沙 410008)

目的 探討β-catenin基因在食管鱗狀細(xì)胞癌(Esophageal squamous cell carcinoma,ESCC)中的表達(dá)及其意義。方法 免疫組化法檢測(cè)65例ESCC及20例因ESCC手術(shù)切除的遠(yuǎn)切端正常食管黏膜組織中β-catenin的表達(dá)及定位,分析其與臨床病理學(xué)參數(shù)的關(guān)系;RT-PCR檢測(cè)31例新鮮ESCC及相應(yīng)的遠(yuǎn)切斷正常食管黏膜組織中β-catenin mRNA的表達(dá)。結(jié)果 免疫組化結(jié)果顯示:在20例因ESCC手術(shù)切除的遠(yuǎn)切端正常食管黏膜組織中,β-catenin主要位于胞膜;在65例ESCC組織中,β-catenin的胞質(zhì)積累陽性率為63.1%,胞核積累陽性率為30.8%;β-catenin的胞質(zhì)/核積累與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)(P=0.005),但與患者的年齡、性別、腫瘤的分化程度及浸潤深度等無關(guān)。RT-PCR結(jié)果顯示:在31例ESCC及相應(yīng)的遠(yuǎn)切端正常食管黏膜組織中,均檢測(cè)到β-catenin mRNA的表達(dá),與相應(yīng)的遠(yuǎn)切端正常食管黏膜組織比較,癌組織中β-catenin基因mRNA的表達(dá)水平明顯升高(P=0.037),其中表達(dá)升高的21例,占67.7%,表達(dá)無明顯差異的8例,占25.8%,表達(dá)降低的2例,占6.5%。結(jié)論 在 ESCC中存在β-catenin mRNA表達(dá)水平的升高以及β-catenin蛋白的異常胞質(zhì)/胞核積累,并與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)。

食管鱗狀細(xì)胞癌; β-catenin; 淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移; 免疫組織化學(xué)

近年來研究表明,Wnt信號(hào)通路異常激活與結(jié)直腸癌、肝癌、乳腺癌、子宮內(nèi)膜癌、卵巢癌、前列腺癌等惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。β-catenin是Wnt信號(hào)通路的關(guān)鍵樞紐分子之一,它在胞質(zhì)內(nèi)的積累和核轉(zhuǎn)位是該信號(hào)通路激活的關(guān)鍵。近年來研究表明,在部分食管癌中存在β-catenin異常的細(xì)胞質(zhì)/核的積累[1～4],并且β-catenin的異常胞質(zhì)/核積累與Wnt途徑下游靶基因 MMP-7[2]、MMP-26[3]、垂體瘤轉(zhuǎn)化基因[4]等的表達(dá)相關(guān)。我們利用免疫組織化學(xué)技術(shù)檢測(cè)了65例食管鱗狀細(xì)胞癌(Esophageal squamous cell carcinoma,ESCC)組織以及20例正常食管黏膜組織中β-catenin的表達(dá)和定位,RT-PCR檢測(cè)了31例ESCC及其相應(yīng)的正常黏膜組織中β-catenin mRNA的表達(dá),旨在進(jìn)一步探討β-catenin在ESCC發(fā)生發(fā)展中的作用。

材料和方法

1.材料

1.1 石蠟標(biāo)本

復(fù)查2004年1月至2005年7月山西省長治醫(yī)學(xué)院附屬和平醫(yī)院病理科存檔的 ESCC標(biāo)本共65例,術(shù)前均未接受過化療和放療。其中男性36例,女性29例,年齡37-76歲,平均年齡為56.3歲。病理分級(jí)采用 WHO(1996)分類法,根據(jù)分化程度不同分為高,中,低三級(jí),其中21例為高分化癌,32例為中分化癌,12例為低分化癌,臨床病理資料完整,全部經(jīng)病理檢查確診。另取20例因ESCC手術(shù)切除的遠(yuǎn)端食管黏膜組織,經(jīng)病理診斷證實(shí)為正常食管黏膜。

1.2 新鮮手術(shù)標(biāo)本

收集山西省長治醫(yī)學(xué)院附屬和平醫(yī)院腫瘤組織標(biāo)本庫中2006年4月-6月手術(shù)切除的 ESCC新鮮組織31例,其中男性21例,女性10例,年齡42-74歲,平均年齡為57.4歲。無菌狀態(tài)下切取約0.5cm×0.5cm×0.8cm大小的癌組織(高分化癌8例,中分化19癌例,低分化癌4例)及相應(yīng)切端選取正常食管黏膜。標(biāo)本取下后立即以液氮速凍并保存,RT-PCR檢測(cè)備用;部分標(biāo)本用10%中性福爾馬林固定,組織學(xué)診斷備用。

1.3 試劑

β-catenin鼠抗人單克隆抗體(工作濃度為1∶200),美國 Chemicion;Trizol試劑,美國 Invitrogen;免疫組化檢測(cè)試劑盒 SP-9000及 DAB Kit(ZLI-9032②)購自北京中衫金橋公司;逆轉(zhuǎn)錄試劑盒為美國Fermentas產(chǎn)品;DNA序列由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。

2.方法

2.1 免疫組織化學(xué)染色

用SP法檢測(cè)β-catenin蛋白的表達(dá),操作按試劑盒說明書進(jìn)行。用已知陽性片作為陽性對(duì)照,用PBS替代一抗作陰性對(duì)照。采用p H6.0的枸櫞酸鹽緩沖液經(jīng)中火檔微波處理進(jìn)行抗原修復(fù),各批次實(shí)驗(yàn)均設(shè)陽性和陰性對(duì)照片以評(píng)判批間差異。

2.2 結(jié)果判斷

參照Zhou[5]等的判定標(biāo)準(zhǔn)。以細(xì)胞膜或胞質(zhì)或胞核染為黃色者定為陽性信號(hào)。根據(jù)切片中陽性信號(hào)定位不同的細(xì)胞所占比例將結(jié)果分類:細(xì)胞膜表達(dá)為主指陽性信號(hào)集中在細(xì)胞膜的細(xì)胞>50%;細(xì)胞質(zhì)表達(dá)為主指陽性信號(hào)集中在細(xì)胞質(zhì)的細(xì)胞>50%;有核定位指陽性信號(hào)在細(xì)胞核的細(xì)胞≥1。

2.3 RT-PCR

用 Trizol試劑抽提組織總RNA。取少量RNA于1.2%的瓊脂糖凝膠電泳,檢測(cè)抽提的 RNA質(zhì)量。測(cè)定各組細(xì)胞 RNA濃度后取 2μg RNA,按AMV試劑盒說明進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)。以逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物為模版進(jìn)行 PCR反應(yīng),條件如下:95℃預(yù)變性5min,94℃變性 50sec,60℃退火 40sec,72℃延伸40sec,共30個(gè)循環(huán),最后72℃延伸10min。引物序列為β-catenin[6]正義鏈:5′-AAGGTCTGAGGAGCAGCTTC-3′,反義鏈:5’-GTGAAGATCTGCGTCTGCTTGG-3’,擴(kuò)增片斷長度為 668 bp;β-actin 正義鏈:5’-A GTTGCGTTACACCCTTTCTTG-3’,反義鏈:5’-TCACCTTCACCGTTCCAGTTT-3’,擴(kuò)增片斷長度為150bp。產(chǎn)物進(jìn)行1.5%瓊脂糖凝膠電泳,紫外光分析儀上觀察、照相。采用凝膠圖像處理軟件 ImageTool(IT)3.0測(cè)量各條帶的光密度值,計(jì)算目的基因mRNA表達(dá)的相對(duì)值(mRNA表達(dá)的相對(duì)值 =β-catenin光密度值/β-actin光密度值)。當(dāng)癌組織/正常黏膜的比值大于>1.2時(shí),為表達(dá)升高;當(dāng)比值介于0.8-1.2時(shí),為表達(dá)無變化;當(dāng)比值<0.8,為表達(dá)降低。

3.統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

免疫組織化學(xué)結(jié)果分析采用卡方檢驗(yàn),ESCC組織與正常黏膜組織β-catenin基因mRNA的表達(dá)水平的比較采用非參數(shù)秩和檢驗(yàn),以 P<0.05時(shí)確定差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1.β-catenin蛋白在正常食管黏膜及 ESCC組織中的表達(dá)

在正常食管黏膜上皮中,β-catenin蛋白均勻分布于細(xì)胞膜,胞質(zhì)(核)未見明顯的陽性信號(hào)。在ESCC組織中,β-catenin蛋白在胞質(zhì)彌散表達(dá),可見部分細(xì)胞中的核定位,而細(xì)胞膜上的表達(dá)量減少,有些病例甚至檢測(cè)不到。此外,同一腫瘤標(biāo)本,部分區(qū)域β-catenin蛋白強(qiáng)表達(dá),而部分區(qū)域表達(dá)卻很弱,甚至不能被檢測(cè)出;即使在同一癌巢的不同區(qū)域,βcatenin蛋白的表達(dá)水平也存在差異,呈現(xiàn)明顯的異質(zhì)性(表 1,圖 1-5)。

表1 β-catenin蛋白在食管鱗癌中的表達(dá)及定位Table 1 Expression and Location ofβ-catenin in ESCC

2.β-catenin蛋白表達(dá)與ESCC臨床病理學(xué)參數(shù)的關(guān)系

分析65例 ESCC中β-catenin蛋白胞質(zhì)/核積累與患者的性別、年齡、腫瘤的分化程度、浸潤深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移等臨床病理學(xué)參數(shù)的關(guān)系,發(fā)現(xiàn)β-catenin的胞質(zhì)/核積累與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)(P=0.005),但與患者的年齡、性別、腫瘤的分化程度及浸潤深度等無關(guān)(表2)。

表2 β-catenin蛋白表達(dá)與食管鱗癌臨床病理學(xué)參數(shù)的關(guān)系Table 2 Correlation ofβ-catenin expression with ESCC clinicopathological parameters

3.RT-PCR檢測(cè)β-catenin在 ESCC和正常食管黏膜組織中的表達(dá)

RT-PCR結(jié)果顯示(圖6):在31例 ESCC組織及相應(yīng)的正常食管黏膜組織中,均檢測(cè)到β-catenin基因mRNA水平的表達(dá)。與相應(yīng)的正常食管黏膜組織相比較,表達(dá)升高的21例,占67.7%,表達(dá)無明顯差異的8例,占25.8%,表達(dá)降低的2例,占6.5%。癌組織中β-catenin基因mRNA的表達(dá)水平較正常食管黏膜組織明顯升高(P=0.037),提示在β-catenin在 ESCC的發(fā)生、發(fā)展過程中可能具有重要的作用。

討 論

研究表明,β-catenin在細(xì)胞內(nèi)主要有兩方面的功能:一是組成上皮細(xì)胞粘附/肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架網(wǎng)絡(luò)的結(jié)構(gòu)組分,參與細(xì)胞之間的粘附[7];二是游離的β-catenin作為Wnt信號(hào)通路的關(guān)鍵分子,將信號(hào)導(dǎo)入細(xì)胞核而在基因轉(zhuǎn)錄中起作用[8]。在分化成熟的正常細(xì)胞中,β-catenin主要定位于細(xì)胞膜,胞質(zhì)中游離的β-catenin維持在極低的水平,由 Wnt信號(hào)調(diào)節(jié)。目前,β-catenin被視為原癌基因編碼的蛋白質(zhì),它在胞質(zhì)內(nèi)的積累是 Wnt信號(hào)通路激活的關(guān)鍵[9]。

應(yīng)用免疫組化檢測(cè) ESCC中β-catenin的表達(dá)及定位的研究已見報(bào)道。由于判定標(biāo)準(zhǔn)的不同,報(bào)道的β-catenin的胞質(zhì)(核)陽性率存在較大的差異,胞質(zhì)陽性率在31.8%到71.0%之間不等,而胞核陽性率介于8.0-35.3%之間[5,10-17]。我們采用Zhou[5]等的判定標(biāo)準(zhǔn),發(fā)現(xiàn)β-catenin的胞質(zhì)陽性率為63.1%(41/65),胞核陽性率為30.8%(20/65)。在結(jié)直腸癌中,β-catenin第3外顯子突變、APC基因突變、Axin突變等均可導(dǎo)致β-catenin的異常胞質(zhì)/胞核積累[18-20]。然而 APC、Axin、β-catenin 等 Wnt信號(hào)途徑分子在 ESCC中發(fā)生突變的頻率均極低[10-13,21-24]。因此,在 ESCC中可能某種獨(dú)立于APC、Axin、β-catenin 等 Wnt信號(hào)途徑分子突變之外的原因介導(dǎo)了的Wnt/β-catenin信號(hào)途徑的異常激活。Wang等[17]發(fā)現(xiàn)在 ESCC細(xì)胞系 EC9706中,End-binding蛋白1(EB1)通過與APC蛋白相互作用 ,影響由 APC、GSK-3β、axin/conductin 和βcatenin組成的多蛋白復(fù)合體介導(dǎo)的β-catenin的降解,導(dǎo)致β-catenin胞質(zhì)積累、核轉(zhuǎn)位及β-catenin/TCF轉(zhuǎn)錄活性增加。Deng等[25]發(fā)現(xiàn)β-catenin與靶基因結(jié)締組織生長因子(CTGF)之間存在一個(gè)正反饋環(huán),CTGF在 ESCC細(xì)胞中過表達(dá)能引起βcatenin的胞質(zhì)/胞核的積累,導(dǎo)致β-catenin-Tcf/Lef信號(hào)通路激活。

Kimura等[26]研究發(fā)現(xiàn),在部分 ESCC中,胞質(zhì)中可溶性的β-catenin的含量明顯高于正常食管黏膜。我們應(yīng)用 RT-PCR檢測(cè)了31例 ESCC中βcatenin基因在轉(zhuǎn)錄水平的表達(dá),發(fā)現(xiàn)與正常食管黏膜比較,67.7%的 ESCC中存在β-catenin mRNA表達(dá)水平的升高。Lv等[27]的研究表明,β-catenin mRNA在ESCC癌組織中的表達(dá)顯著高于臨近的正常食管粘膜組織,并且β-catenin mRNA的過表達(dá)與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和臨床病理分(期)級(jí)相關(guān)。因此,除了上述的影響β-catenin胞質(zhì)積累的因素之外,βcatenin基因擴(kuò)增也可能與β-catenin在 ESCC中的異常表達(dá)有關(guān)。我們前期研究證實(shí) ESCC細(xì)胞系Eca-109細(xì)胞中存在β-catenin的過表達(dá)和異常的細(xì)胞質(zhì)/核定位,抑制β-catenin的表達(dá)能顯著抑制其增殖[28]。

目前,關(guān)于β-catenin胞質(zhì)/核積累和 (或)βcatenin胞膜表達(dá)水平的降低與 ESCC臨床病理學(xué)參數(shù)的關(guān)系尚存在不同的研究結(jié)果。De Castro J[11]發(fā)現(xiàn)β-catenin的表達(dá)模式(核表達(dá)與膜表達(dá))與腫瘤分期、分化程度、對(duì)化療的敏感性、生存率等無關(guān);膜表達(dá)水平(正常與減少)與腫瘤的分期分級(jí)、生存率等也無關(guān)。Kudo J[13]的研究也發(fā)現(xiàn)β-catenin胞核積累與腫瘤大小、腫瘤分期、分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、對(duì)化療的敏感性、生存率等無關(guān)。我們的研究結(jié)果表明,β-catenin胞質(zhì)/核積累與患者的年齡、性別、腫瘤分化程度、浸潤深度等無關(guān),與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移顯著相關(guān)(χ2=8.032,P=0.005),與 Zhang等[16]和Zhou等[5]的研究結(jié)果相一致。Zhang等[16]的研究表明,ESCC中 E-cadherin胞膜表達(dá)減少與βcatenin的胞膜表達(dá)減少和胞質(zhì)積累有關(guān),并導(dǎo)致E-cadherin/cat復(fù)合體解聚,細(xì)胞黏附減弱,從而促進(jìn)了腫瘤細(xì)胞的浸潤與轉(zhuǎn)移。Yamamoto[14]等的研究發(fā)現(xiàn)β-catenin胞核積累與下游靶基因MMP-26的表達(dá)正相關(guān),MMP-26在ESCC中高表達(dá)且通過激活MMP-9酶原參與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移。

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圖 版 說 明

圖1 β-catenin蛋白在正常食管黏膜上皮的表達(dá),陽性信號(hào)位于細(xì)胞膜(SP×200)

圖2 β-catenin蛋白在腫瘤細(xì)胞膜上的表達(dá)及細(xì)胞質(zhì)中的積累(SP×200)

圖3 β-catenin蛋白在腫瘤細(xì)胞質(zhì)中的積累(SP×200)

圖4 β-catenin蛋白在腫瘤細(xì)胞質(zhì)中的異質(zhì)性表達(dá)(SP×200)

圖5 β-catenin蛋白在腫瘤細(xì)胞質(zhì)中的積累及細(xì)胞核定位(SP×200)

圖6 RT-PCR分析正常食管黏膜和食管鱗癌組織中βcatenin mRNA的表達(dá)

EXPLANATION OF FIGURES

Fig.1 The expression ofβ-catenin in nonneoplastic esophageal mucosal tissue,the positive signal locates in membrane.(SP×200)

Fig.2 The expression ofβ-catenin in ESCC,the positive signal locates in cytoplasm and membrane.(SP×200)

Fig.3 The expression ofβ-catenin in ESCC,the positive signal locates in cytoplasm.(SP×200)

Fig.4 The heterogeneous expression ofβ-catenin in ESCC.(SP×200)

Fig.5 The expression ofβ-catenin in ESCC,the positive signal locates in cytoplasm and nucleus.(SP×200).

Fig.6 RT-PCR analysis for the mRNA abundance ofβ-catenin in ESCC and their corresponding nonneoplastic epithelia tissues.M:DNA marker,N:正常食管黏膜(Normal esophageal mucosa),T:食管鱗癌(ESCC);β-catenin 擴(kuò)增產(chǎn)物 668bp(β-catenin PCR products,668bp),內(nèi)參β-actin擴(kuò)增產(chǎn)物150bp(Internal control β-actin PCR products,150bp)

Abnormal expression ofβ-catenin in esophageal squamous cell carcinoma and its clinical significance

Wang Jinsheng,Wei Wu＊,Ji Aifang,Ren Hongzheng1,Wen Jifang1

(Central L aboratory,Heping Hospital A f f iliated to Changzhi Medical University,S hanxi046000;1Department of Pathology,Xiangya Medical College,Central South University,Changsha410008,China)

Objective To explore the expression and significance ofβ-catenin in esophageal squamous cell carcinoma(ESCC).Methods Immunohistochemiscal staining was used to examine the expression ofβcatenin protein in 65 cases of formalin-fixed,paraffin-embeded ESCC tissue(n=65)and their corresponding nonneoplastic epithelial tissues(n=20).RT-PCR was used to determine the expression ofβ-catenin in 31 cases of fresh ESCC tissue(n=31)and their corresponding nonneoplastic epithelial tissues(n=31).Results In the 20 samples of normal esophageal mucosa,immunohistochemistry showed thatβ-catenin was mainly located in the membrane,while 41 in 65(63.1%)tumor samples had cytoplasmic accumulation of β-catenin and 20(30.8%)had nuclear staining.The cytoplasmic/nuclearβ-catenin was significantly associated with lymph node metastasis(P=0.005),but not with the patient’s age,gender,tumor grade or differentiation grade.In 31 fresh ESCC tissues studied,all tumor samples and paired normal samples expressedβ-catenin mRNA.Twenty-one of 31(66.7%)tumors expressedβ-catenin mRNA at a higher level than their corresponding nonneoplastic tissues,8 of 31(25.8%)were almost the same,and 2 of 31(6.5%)showed lower expression.Altogether,tumor tissues expressed a significantly higher level ofβ-catenin mRNA than the corresponding nonneoplastic tissues(P=0.037).Conclusion ESCC shows an increased expression ofβ-catenin mRNA,and the abnormal cytoplasmic/nuclear accumulation ofβ-catenin is significantly associated with lymph node metastasis.

Esophageal squamous cell carcinoma; β-catenin; Lymph node metastasis; Immunohistochemistry

R329

A

10.3870/zgzzhx.2011.02.005

2011-01-10

2011-04-01

山西省自然科學(xué)基金資助(2010011047-5)

王金勝,男(1975年),漢族,副教授。

＊通訊作者(To whom correspondence should be addressed)