朱小波黃燕華彭 俊高 俊李蓓蕓陳洪雷

(1武漢市腫瘤納米診斷工程技術(shù)研究中心;2武漢大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院病理學(xué)教研室 ;

3武漢珈源量子點(diǎn)技術(shù)開(kāi)發(fā)有限公司,武漢 430072)

量子點(diǎn)免疫熒光技術(shù)在病理診斷中的初步應(yīng)用

朱小波1,3黃燕華3彭 俊1,3高 俊3李蓓蕓3陳洪雷2＊

(1武漢市腫瘤納米診斷工程技術(shù)研究中心;2武漢大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院病理學(xué)教研室 ;

3武漢珈源量子點(diǎn)技術(shù)開(kāi)發(fā)有限公司,武漢 430072)

目的 利用量子點(diǎn)(quantum dots,QDs)免疫熒光技術(shù)檢測(cè)石蠟包埋組織中不同蛋白的定位與免疫酶法進(jìn)行比較,以及兩種蛋白的共表達(dá),并探討其初步應(yīng)用價(jià)值。方法 利用QDs免疫熒光和免疫酶組織化學(xué)方法分別檢測(cè)正常闌尾組織LCA、乳腺肌上皮組織Calponin、肺癌組織p53蛋白的表達(dá),并利用QDs免疫熒光雙標(biāo)法同時(shí)檢測(cè)了宮頸上皮內(nèi)瘤變組織內(nèi)CK和PCNA蛋白、乳腺癌組織內(nèi) Her-2和CK蛋白的共表達(dá)。結(jié)果 QDs免疫熒光和免疫酶組織化學(xué)技術(shù)分別檢測(cè)LCA、Calponin和p53蛋白的定位完全一致。QDs免疫熒光雙標(biāo)法結(jié)合多光譜成像可同時(shí)觀察到宮頸上皮內(nèi)瘤變組織內(nèi)CK和PCNA蛋白、乳腺癌組織內(nèi) Her-2和CK蛋白的共表達(dá)。結(jié)論 QDs免疫熒光組織化學(xué)法具有與免疫酶法等同的應(yīng)用價(jià)值。QDs免疫熒光雙標(biāo)法可同時(shí)檢測(cè)不同蛋白的共定位。

量子點(diǎn); 免疫熒光; 多重標(biāo)記; 多光譜成像

量子點(diǎn)(Quantum dots,QDs)或半導(dǎo)體納米微晶體,作為一種新型的熒光染料用于生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的研究始于20世紀(jì)70年代末。與傳統(tǒng)熒光染料相比,QDs具有許多獨(dú)特的性質(zhì)如激發(fā)光譜寬而連續(xù)、熒光強(qiáng)度高,發(fā)光時(shí)間長(zhǎng),光化學(xué)穩(wěn)定性好等特性,還能夠?qū)喖?xì)胞分子進(jìn)行多種標(biāo)記,使之成為近乎完美的熒光標(biāo)志物,故量子點(diǎn)點(diǎn)亮了病理學(xué)[1]。本研究利用不同發(fā)射波長(zhǎng)的量子點(diǎn)(605nm,545nm)標(biāo)記的生物分子如鏈霉親和素、二抗IgG為基礎(chǔ),采用量子點(diǎn)免疫熒光組織化學(xué)方法(QDs immunofluorescence histochemistry,QDs-IHC)在石蠟包埋的不同組織切片上檢測(cè)不同蛋白的定位以及兩種蛋白的共表達(dá),并與傳統(tǒng)的免疫酶法進(jìn)行比較,評(píng)價(jià)其初步應(yīng)用價(jià)值。

材料和方法

1.材料

1.1 組織標(biāo)本 隨機(jī)選取我院歸檔的病理石蠟標(biāo)本包括肺癌、乳腺癌和宮頸上皮內(nèi)瘤變組織以及正常闌尾組織各5例。

1.2 主要試劑和儀器 鼠抗人p53、CK、Calponin、LCA(CD45)單克隆抗體(濃縮型,工作濃度均為1:150)、兔抗人 Her-2、PCNA多克隆抗體(濃縮型,工作濃度分別為1:150,1:200)、生物素化羊抗鼠和羊抗兔IgG(濃縮型,工作濃度1:400);免疫組化PV-9000通用型試劑盒(即用型);量子點(diǎn)超敏試劑盒(605nm QDs-SA)、量子點(diǎn)雙染熒光試劑盒(605nm QDs-SA和545nm QDs-IgG(羊抗兔));熒光圖像采集和分析采用日本Olympus BX51(CCD DP72)和美國(guó)劍橋NuanceTM多光譜顯微成像系統(tǒng);以上試劑和儀器均由武漢珈源量子點(diǎn)技術(shù)開(kāi)發(fā)有限公司提供。

2.方法

2.1 量子點(diǎn)免疫熒光組織化學(xué)法檢測(cè)不同蛋白的定位

實(shí)驗(yàn)方法參照文獻(xiàn)[2],采用605nm發(fā)射波長(zhǎng)的量子點(diǎn)標(biāo)記的鏈霉親和素為基礎(chǔ)檢測(cè)不同組織中蛋白的定位。如正常闌尾組織LCA、乳腺肌上皮組織Calponin、肺癌組織p53蛋白的定位。上熒光顯微鏡藍(lán)光激發(fā),605nm QDs-SA以細(xì)胞內(nèi)出現(xiàn)紅色的熒光信號(hào)為陽(yáng)性。用 TBS代替一抗作陰性對(duì)照,以已知陽(yáng)性片作陽(yáng)性對(duì)照。

2.2 免疫組化PV-9000法檢測(cè)不同蛋白的定位

為了驗(yàn)證量子點(diǎn)免疫熒光法檢測(cè)不同蛋白的定位是否準(zhǔn)確,在連續(xù)切片上也分別檢測(cè)了正常闌尾組織LCA、乳腺肌上皮組織Calponin、肺癌組織p53蛋白的表達(dá)。詳細(xì)實(shí)驗(yàn)步驟,嚴(yán)格按照說(shuō)明書進(jìn)行。采用DAB顯色,蘇木精復(fù)染,封片后在 Olympus BX51(CCD DP72)成像系統(tǒng)進(jìn)行與量子點(diǎn)免疫熒光法相同視野成像分析。

2.3 量子點(diǎn)免疫熒光雙標(biāo)法檢測(cè)兩種蛋白的共表達(dá)

詳細(xì)實(shí)驗(yàn)步驟參照文獻(xiàn)[3],簡(jiǎn)述如下:在宮頸上皮內(nèi)瘤變組織內(nèi)檢測(cè)CK和PCNA蛋白的共表達(dá),乳腺癌組織內(nèi)檢測(cè)Her-2和CK的共表達(dá)。分別滴加用抗體稀釋液稀釋的QDs-SA(605nm)和QDs-IgG(545nm),37℃濕盒孵育 45 min;TBS洗(2×3min),90%緩沖甘油封片,熒光顯微鏡下觀察成像,QDs-IgG(545nm)標(biāo)記的 Her-2蛋白以細(xì)胞胞膜內(nèi)出現(xiàn)綠色的熒光信號(hào)為陽(yáng)性,而PCNA則定位于胞核;QDs-SA(605nm)標(biāo)記的CK蛋白以細(xì)胞質(zhì)內(nèi)出現(xiàn)紅色的熒光信號(hào)為陽(yáng)性。CK和PCNA蛋白的共表達(dá)采用紫外和藍(lán)光激發(fā),熒光顯微鏡下直接觀察成像;而Her-2和CK蛋白的共表達(dá)則在紫外激發(fā)下利用多光譜顯微成像系統(tǒng)進(jìn)行處理。

結(jié) 果

熒光顯微鏡下藍(lán)光激發(fā)觀察到p53蛋白定位于肺癌細(xì)胞的胞核(圖1a),LCA定位于正常闌尾組織里淋巴細(xì)胞的胞膜(圖1b),Calponin則定位于乳腺肌上皮細(xì)胞的胞質(zhì)(圖1c)。以上3種不同蛋白的定位與免疫組化 PV-9000法檢測(cè)的完全一致(圖2a-c),但量子點(diǎn)免疫熒光的信號(hào)更強(qiáng)。

量子點(diǎn)免疫熒光雙標(biāo)法檢測(cè)到宮頸上皮內(nèi)瘤變組織內(nèi)CK和PCNA蛋白的共表達(dá),熒光顯微鏡下紫外和藍(lán)光激發(fā)均顯示CK定位于胞質(zhì),呈紅色信號(hào),而PCNA定位于胞核,呈綠色信號(hào),定位準(zhǔn)確,背景清晰(圖3a-b)。Her-2主要定位于胞膜而CK定位于胞質(zhì),二者定位很接近,不可避免會(huì)有信號(hào)的重疊,圖3c顯示乳腺癌組織內(nèi) Her-2和CK蛋白共表達(dá)的RGB原始圖像。當(dāng)兩種以上的蛋白定位完全相同或相近時(shí),能借助多光譜成像系統(tǒng)進(jìn)行解混,會(huì)得到每一種蛋白的單獨(dú)信號(hào),還可去除組織的自發(fā)熒光,可提高圖像的信噪比。圖3d顯示多光譜解混后 Her-2蛋白表達(dá)的信號(hào),圖3e顯示多光譜解混后CK蛋白表達(dá)的信號(hào)。圖3f顯示多光譜解混后Her-2和CK蛋白共表達(dá)的信號(hào),96.8%的腫瘤細(xì)胞呈現(xiàn)共定位,與圖3c相比,去除了組織的自發(fā)熒光,顯著提高了圖像的信噪比,并且可得到兩種蛋白共定位的準(zhǔn)確數(shù)值。

討 論

1.量子點(diǎn)的光學(xué)特性

量子點(diǎn)是一種由 Ⅱ-Ⅵ族或Ⅲ-Ⅴ族元素組成的,粒徑約為2-6nm,能夠接受激發(fā)光產(chǎn)生熒光的半導(dǎo)體納米微晶體,生物標(biāo)記中最常用的是CdSe系列量子點(diǎn)。由于量子點(diǎn)具有激發(fā)光譜寬而連續(xù)、發(fā)射光譜窄而對(duì)稱、熒光強(qiáng)度高(是羅丹明6G的20倍)、光化學(xué)穩(wěn)定性好(是羅丹明 6G的 100倍以上)、耐光漂白、發(fā)射光顏色與粒徑大小關(guān)聯(lián)等優(yōu)點(diǎn),使量子點(diǎn)成為一種最佳的熒光標(biāo)記物被廣泛應(yīng)用于蛋白質(zhì)及DNA、RNA檢測(cè)、細(xì)胞標(biāo)記成像、藥物篩選、病原體檢測(cè)、活細(xì)胞生命動(dòng)態(tài)過(guò)程示蹤、活體動(dòng)物體內(nèi)腫瘤細(xì)胞靶向示蹤、熒光共振能量轉(zhuǎn)移等生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域[1-4]。

2.量子點(diǎn)在免疫熒光組織化學(xué)中的應(yīng)用

本研究利用量子點(diǎn)與鏈霉親合素偶聯(lián)的復(fù)合物作為特異性探針,能與生物素化的抗體結(jié)合,這樣形成的QDs復(fù)合物即可用于免疫熒光分析。本研究利用QDs免疫熒光和免疫酶組織化學(xué)技術(shù)分別檢測(cè)定位于胞膜、胞質(zhì)和胞核的不同蛋白的表達(dá)如:正常闌尾組織LCA、乳腺肌上皮組織 Calponin、肺癌組織p53蛋白的表達(dá),結(jié)果表明QDs免疫熒光和免疫酶組織化學(xué)技術(shù)分別檢測(cè)LCA、Calponin和p53蛋白的定位完全一致,而且前者的信號(hào)更強(qiáng)。量子點(diǎn)熒光信號(hào)的結(jié)果既可水性封片也可脫水封片,并且可長(zhǎng)時(shí)間室溫保存并保持和初次分析時(shí)相同水平的敏感度,本研究最長(zhǎng)跟蹤了3個(gè)月,而文獻(xiàn)報(bào)道最長(zhǎng)的是18個(gè)月[1]。我們以往研究還發(fā)現(xiàn)即使在熒光信號(hào)減弱后,再加入QDs-SA,可以重新恢復(fù)淬滅的熒光信號(hào),而且,很有趣的發(fā)現(xiàn)是并不影響利用免疫酶法進(jìn)行相關(guān)抗原的檢測(cè)[2]。以上提示QDs免疫熒光組織化學(xué)法具有和免疫酶法等同的應(yīng)用價(jià)值。我們以往的報(bào)道表明,在肺癌組織芯片上采用QDs免疫熒光技術(shù)高通量檢測(cè)了caveolin-1和PCNA的蛋白表達(dá),效果優(yōu)于傳統(tǒng)的免疫酶法[5]。

量子點(diǎn)直徑的可調(diào)性以及同一激發(fā)光可激發(fā)不同量子點(diǎn),這些獨(dú)特特征能夠同時(shí)分析多種抗原,特別對(duì)于復(fù)雜的標(biāo)本需要分析大量參數(shù)時(shí)很有價(jià)值。本研究利用量子點(diǎn)免疫熒光雙標(biāo)法同時(shí)檢測(cè)了宮頸上皮內(nèi)瘤變組織內(nèi)CK和 PCNA蛋白的共表達(dá),結(jié)果觀察到在不同波長(zhǎng)(紫外光或藍(lán)光)的激發(fā)下均能清晰顯示這兩種蛋白在同一細(xì)胞內(nèi)的定位,效果很好,表明不同激發(fā)光也能激發(fā)同一量子點(diǎn),量子點(diǎn)免疫熒光雙標(biāo)法可同時(shí)檢測(cè)不同蛋白的共定位。這種不必轉(zhuǎn)換濾光片可同時(shí)顯示兩種顏色的量子點(diǎn)和很耐光的發(fā)射波峰,使量子點(diǎn)很方便和簡(jiǎn)單地應(yīng)用于免疫熒光多指標(biāo)的檢測(cè)[6]。當(dāng)兩種以上的蛋白定位完全相同或相近時(shí),不可避免會(huì)有不同信號(hào)的重疊,這挑戰(zhàn)了人類眼睛的檢出極限。多光譜成像系統(tǒng)是基于液晶可調(diào)諧濾光技術(shù),可以在不同波長(zhǎng)處(420nm-720nm)檢測(cè)熒光探針或染料在細(xì)胞或組織中的分布,可獲取不同波長(zhǎng)范圍內(nèi)的所有信號(hào),通過(guò)光譜學(xué)的原理,把每一種色原或染料分離成自己?jiǎn)为?dú)的圖像,完全去除樣本的自發(fā)熒光,可顯著提高組織切片成像的信噪比,在生物醫(yī)學(xué)中可能有著廣泛的應(yīng)用[7]。本研究利用量子點(diǎn)免疫熒光雙標(biāo)法結(jié)合多光譜成像系統(tǒng)分析了乳腺癌組織內(nèi) Her-2和CK蛋白的共表達(dá),通過(guò)多光譜成像系統(tǒng)解混后,能得到每一種蛋白的單獨(dú)信號(hào),與傳統(tǒng)成像方法相比,去除了組織的自發(fā)熒光,提高了圖像的信噪比,并能完成單指標(biāo)的定量分析以及多指標(biāo)之間共定位的定量數(shù)據(jù)。Chen等[8]在乳腺癌組織芯片中同時(shí)檢測(cè)了70例乳腺癌 Her-2和 ER的共表達(dá),有助于理解乳腺癌異質(zhì)性進(jìn)展中的相互作用,并有利于臨床指導(dǎo)個(gè)體化治療。文獻(xiàn)報(bào)道在石蠟包埋組織中的同一標(biāo)本上最多實(shí)現(xiàn)了4個(gè)不同蛋白共表達(dá)的檢測(cè)[9]。以上均提示在病理診斷中,量子點(diǎn)可實(shí)現(xiàn)多指標(biāo)的同時(shí)檢測(cè)。

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圖 版 說(shuō) 明

圖1a p53蛋白在肺癌組織中的胞核表達(dá),陽(yáng)性信號(hào)呈紅色,藍(lán)光激發(fā),QDs-IHC法 ×100

圖1b LCA蛋白在正常闌尾組織的淋巴細(xì)胞的胞膜呈陽(yáng)性表達(dá),藍(lán)光激發(fā),QDs-IHC法 ×100

圖1c Calponin蛋白在乳腺肌上皮細(xì)胞的胞質(zhì)呈陽(yáng)性表達(dá),藍(lán)光激發(fā),QDs-IHC法 ×200

圖2a p53蛋白在肺癌組織中的胞核表達(dá),陽(yáng)性信號(hào)呈棕黃色,PV法 ×100

圖2b LCA蛋白在正常闌尾組織的淋巴細(xì)胞的胞膜呈陽(yáng)性表達(dá),PV法 ×100

圖2c Calponin蛋白在乳腺肌上皮細(xì)胞的胞質(zhì)呈陽(yáng)性表達(dá),PV法 ×200

圖3a 宮頸上皮內(nèi)瘤變組織內(nèi)CK和 PCNA蛋白的共表達(dá),CK定位于胞質(zhì),呈紅色信號(hào),而PCNA定位于胞核,呈綠色信號(hào),紫外光激發(fā),QDs-IHC法 ×200

圖3b 宮頸上皮內(nèi)瘤變組織內(nèi)CK和 PCNA蛋白的共表達(dá),藍(lán)光激發(fā),QDs-IHC法 ×1000

圖3c 乳腺癌組織 Her-2和CK蛋白共表達(dá)的RGB原始圖像,紫外光激發(fā),QDs-IHC法 ×400

圖3d 多光譜解混后 Her-2蛋白表達(dá)的信號(hào)呈綠色

圖3e 多光譜解混后CK蛋白表達(dá)的信號(hào)呈紅色

圖3f 多光譜解混后 Her-2和CK蛋白共表達(dá)的信號(hào)

EXPLANATION OF FIGURES

Fig.1a p53 protein expression in the lung cancer tissues,which was located in the nuclei,positive signals showed red,blue light excitation,QDs-IHC method×100

Fig.1b Positive expression of LCA protein was located in the membrane of lymphocytes in the normal appendix tissues,blue light excitation,QDs-IHC method×100

Fig.1c Calponin protein expression in the myoepithelial cell of breast tissues,which was located in the cytoplasm,blue light excitation,QDs-IHC method×200

Fig.2a p53 protein expression in the lung cancer tissues,which was located in the nuclei,positive signals showed brown-yellow,PV method×100

Fig.2b Positive expression of LCA protein was located in the membrane of lymphocytes in the normal appendix tissues,PV method×100

Fig.2c Calponin protein expression in the myoepithelial cell of breast tissues,which was located in the cytoplasm,PV method×200

Fig.3a Co-expression of CK and PCNA proteins in the cervical intraepithelial neoplasia,CK protein located in the cytoplasm,manifested red signals,PCNA protein located in the nuceli,manifested green signals,ultraviolet light excitation,QDs-IHC method×200

Fig.3b Co-expression of CK and PCNA proteins in the cervical intraepithelial neoplasia,blue light excitation,QDs-IHC method×1000

Fig.3c RGB primary image of Her-2 and CK proteins co-expression in the breast cancer tissues,ultraviolet light excitation,QDs-IHC method×400

Fig.3d Green signal of Her-2 protein expression was observed by multispectral unmixing

Fig.3e Red signal of CK protein expression was observed by multispectral unmixing

Fig.3f Signal of Her-2 and CKprotein expression was detected by multispectral unmixing

Initialapplication of quantum dots immunofluorescence technology in pathological diagnosis

Zhu Xiaobo1,3,Huang Yanhua3,Peng Jun1,3,Gao Jun3,Li Beiyun3,Chen Honglei2＊

(1W uhan Tumor N anometer Diagnosis Engineering Research Center;2Department.of Pathology,B asic Medical School of W uhan University,W uhan;3W uhan J iayuan Quantum dots Co.,L TD,W uhan430072,China)

Objective Quantum dots(QDs)immunofluorescence was compared with the immunoenzyme method in uccurately locating different proteins in paraffin embedded tissues,to detect co-expression of two different proteins.The initial application value of QDS was investigated by using it.Methods QDs immunofluorescence histochemistry(QDs-IHC)and immunoenzyme histochemistry were used to detect the expression of p53 protein in the lung cancer tissues,calponin protein in the myoepithelial cells of breast tissues,and LCA protein in the normal appendix tissues.Co-expression of CK and PCNA proteins in the human cervical intraepithelial neoplasia,Her-2 and CK proteins in the breast cancer tissues were simultaneously detected by QDs double-labeling immunofluorescence.Results Location of p53,LCA and calponin proteins was completely concordant through QDs-IHC and immunoenzyme histochemistry.Co-expression of CK and PCNA proteins in the cervical intraepithelial neoplasia,Her-2 and CK proteins in the breast cancer tissues were simultaneously observed by QDs double-labeling immunofluorescence combined with multispectral imaging.Conclusion The same application value was found between QDs-IHC and immunoenzyme histochemistry.Co-location of different proteins were simultaneously detected by QDs double-labeling immunofluorescence.

Quantum Dots; Immunofluorescence; Multiple labeling; Multispectral imaging

R392-3

A

10.3870/zgzzhx.2011.02.003

2010-07-10

2011-03-01

國(guó)家自然科學(xué)基金資助(30900652)

朱小波,男(1972年),漢族,工程師。

＊通訊作者(To whom correspondence should be addressed)