余曉波 魏剛 孫興懷 陳君毅

青光眼的濾過性手術(shù)仍是目前青光眼的主要治療手段，但2年失敗率達15% ～30%。失敗的主要原因是手術(shù)區(qū)濾過口處成纖維細胞增殖，瘢痕形成而使濾過泡功能減退［1］。因此，要提高青光眼治療的手術(shù)成功率，解決濾過泡瘢痕化是關(guān)鍵問題。近年來的研究發(fā)現(xiàn)，干擾素 α-2b(interferon α-2b，IFNα-2b)具有廣譜的抗纖維化作用，并且已經(jīng)應(yīng)用到青光眼濾過術(shù)后的抗瘢痕治療中［2］。目前臨床常用IFN的使用方法多為滴眼液或球結(jié)膜下注射。藥物滴眼后立即被結(jié)膜囊中的淚液稀釋，并很快從淚道排出，因此生物利用度低，作用時間短暫，需反復(fù)頻繁滴眼，患者依從性也較差。作為一種有創(chuàng)性的給藥方式，結(jié)膜下注射會給患者帶來不必要的痛苦，并具有出現(xiàn)眼球穿破等并發(fā)癥的潛在風(fēng)險。采用高分子親水性聚合物為基質(zhì)的凝膠劑近年來作為藥物載體受到醫(yī)藥界的重視。溫度敏感原位形成凝膠(簡稱原位凝膠)滴眼劑室溫下為液體，滴入眼表轉(zhuǎn)變?yōu)槟z，可以延長藥物與角膜上皮或結(jié)膜之間的接觸時間，降低全身不良反應(yīng)的同時，改善眼部生物利用度，局部定位給藥或持續(xù)給藥。本研究旨在觀察IFN α-2b原位凝膠滴眼劑與傳統(tǒng)IFN α-2b滴眼液在家兔實驗性濾過手術(shù)后的抗瘢痕化作用。

1 材料與方法

1.1 材料 選取健康雌性或雄性新西蘭大白兔10只，體質(zhì)量2.2～2.8 kg。采用隨機數(shù)字表法分為兩組，每組各5只(10眼)。所有大白兔均進行雙眼小梁切除手術(shù)。設(shè)定右眼為實驗眼，術(shù)后給予IFN滴眼;左眼為對照眼，術(shù)后只給予抗生素滴眼。所有手術(shù)操作均由同一名醫(yī)師完成。

1.2 主要藥物 ①重組IFN α-2b溫度敏感原位凝膠的制備:原料藥使用注射用重組IFN α-2b凍干粉針劑(安徽安科生物工程股份有限公司，商品名:安達芬粉針)。凝膠基質(zhì):聚氧乙烯-聚氧丙烯嵌段共聚物(Pluronic F127，巴斯夫公司;商品名:泊洛沙姆)。所有原位凝膠藥物均在復(fù)旦大學(xué)藥學(xué)院制備。制備完成的在位凝膠中IFN α-2b濃度:20萬IU/mL。凝膠凝固溫度約為30℃。②重組IFN α-2b滴眼液(安徽安科生物工程股份有限公司，商品名:安達芬滴眼液)，IFN濃度:20萬IU/mL。

1.3 實驗方法 建立兔眼濾過手術(shù)模型:全部家兔均使用氯胺酮(50 mg/kg)和氯丙嗪(25 mg/kg)肌內(nèi)注射麻醉。升汞及無菌注射用水沖洗結(jié)膜囊，常規(guī)眼部區(qū)域消毒、鋪巾。手術(shù)顯微鏡下用直肌牽引線將上直肌牽向鼻側(cè)，暴露顳上象限鞏膜。沿角鞏膜緣做以穹隆為基底的結(jié)膜瓣，暴露表層鞏膜，熱凝止血，結(jié)膜下Tenon囊組織均不切除。制作以角膜緣為基底3 mm×3 mm的方形半厚板層鞏膜瓣，并分離直至透明角膜。切除2 mm×1.5 mm角鞏膜組織，不做虹膜根切。鞏膜瓣兩個角處以10-0絲線各縫合1針，8-0可吸收縫線縫合球結(jié)膜。

術(shù)后用藥:所有術(shù)眼每天均滴硫酸慶大霉素眼液(復(fù)旦大學(xué)附屬眼耳鼻喉科醫(yī)院制劑室)，4次/d。然后第1組手術(shù)后第2天開始右眼加IFN α-2b原位凝膠4次/d滴眼，持續(xù)用藥至術(shù)后14 d;第2組手術(shù)后第2天開始右眼加IFN α-2b滴眼液4次/d滴眼，持續(xù)用藥至術(shù)后14 d。

眼壓(intraocular pressure，IOP)測定:于術(shù)前及術(shù)后每7 d使用Tonopen(Reichert Ophthalmic Instruments，美國)測量家兔雙眼IOP。測量前使用鹽酸奧布卡因滴眼液(日本參天制藥株式會社，商品名:倍諾喜)進行表面麻醉3次，測量時盡量使動物保持安靜。

術(shù)后第1周每天、第2周起隔天用裂隙燈觀察眼部情況，包括結(jié)膜、角膜、前房、晶狀體等，并用直接檢眼鏡檢查眼底。眼瞼、結(jié)膜反應(yīng)按輕重分為3級:0級:眼瞼無紅腫，結(jié)膜不充血;I級:眼瞼無紅腫，結(jié)膜輕度充血、水腫;II級:眼瞼紅腫，結(jié)膜明顯充血、水腫。角膜上皮用1% 熒光素鈉染色。

1.4 切片制作與觀察 術(shù)后28 d，使用空氣栓塞法處死全部家兔，并立即行眼球摘除。取小梁切除手術(shù)部位10 mm×10 mm眼球壁組織，立即使用4%戊二醛固定。石蠟包埋后切片，蘇木素-伊紅(hematoxylin eosin，HE)染色，低倍鏡下觀察HE染色切片。

1.5 統(tǒng)計學(xué)處理 使用配對t檢驗分析兩組家兔間IOP差異，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 IOP變化 第1組家兔術(shù)后各時間點右眼IOP均較左眼 IOP 低(P 值分別為 0.000、0.011、0.000、0.009);第2組術(shù)后各時間點右眼 IOP也均較左眼IOP 低(P 值分別為0.010、0.145、0.012、0.040);術(shù)后各時間點IFN α-2b原位凝膠眼IOP均低于IFN α-2b滴眼液眼，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P值分別為0.347、0.328、0.640、0.346)(圖 1)。

圖1 兩組家兔手術(shù)前后IOP變化曲線(1 mm Hg=0.133 kPa)

2.2 不良反應(yīng) 在整個實驗過程中，兩組實驗組所有家兔均存活。全部術(shù)眼均未表現(xiàn)出明顯的眼前節(jié)炎癥反應(yīng)，角膜均保持透明。所有術(shù)眼均未發(fā)現(xiàn)眼內(nèi)炎表現(xiàn)。實驗組眼與對照組眼相比，結(jié)膜充血程度相似。

2.3 HE染色觀察 術(shù)后4周，小梁切除手術(shù)部位HE染色顯示，對照眼鞏膜瓣下可見大量增生的纖維結(jié)締組織，成纖維細胞豐富，濾過泡間隙消失(附1頁圖2)。IFN α-2b滴眼液組鞏膜瓣下纖維結(jié)締組織明顯較對照組少，成纖維細胞相對較少，并可見部分濾過泡間隙(附1頁圖3)。IFN α-2b原位凝膠組可見鞏膜瓣下結(jié)締組織形態(tài)較規(guī)則，成纖維細胞較少，可見明顯濾過泡間隙(附1頁圖4)。

3 討論

IFN是一類具有廣泛生物活性的蛋白質(zhì)，具有調(diào)節(jié)機體免疫功能、抗病毒、抗腫瘤等多種作用。目前已用于臨床的IFN有α、β、γ三種類型。近年來的研究發(fā)現(xiàn)，IFN還具有抗纖維化作用［3-4］。本研究發(fā)現(xiàn)，IFN α-2b滴眼液和原位凝膠均能夠顯著減少鞏膜瓣下纖維結(jié)締組織形成，并保持一定的濾過泡間隙。同時除術(shù)后第2周滴用IFNα-2b滴眼液組雙眼眼壓差異無統(tǒng)計學(xué)意義外，其余術(shù)后各時間點，實驗眼IOP均顯著小于自身對照眼。

既往IFN治療青光眼濾過術(shù)后瘢痕化多采用結(jié)膜下注射或頻繁滴眼的方法［5］。緩釋給藥系統(tǒng)可以延長藥物在眼表的存留時間，提高藥物的生物利用度，避免結(jié)膜下注射或頻繁滴藥給患者帶來痛苦和不便。原位凝膠在凝固或凝膠形成之前是一種在室溫下能夠自由流動的液體，在體溫環(huán)境下迅速變?yōu)槟z［6］。本研究采用的溫度敏感凝膠基質(zhì)為聚氧乙烯-聚氧丙烯嵌段共聚物，具有黏稠的流動液體行為，而在體溫環(huán)境下能夠轉(zhuǎn)變?yōu)榘牍腆w透明凝膠，其透明性和半固體等特性使得它可以作為良好的眼部給藥載體。本研究中使用的凝膠凝固溫度為30℃，在眼部滯留時間20～30 min［7］，而普通滴眼劑在眼部存留時間為2～5 min。研究結(jié)果表明，溫度敏感原位凝膠給藥系統(tǒng)可以提高IFNα-2b在濾過術(shù)后的抗纖維化作用。雖然差異無統(tǒng)計學(xué)意義，但術(shù)后各時間點原位凝膠組兔眼IOP均低于滴眼液組兔眼IOP。這可能與原位凝膠延長了藥物在眼表的停留時間，提高了生物利用度有關(guān)。

在本動物實驗研究中，除眼部充血外，未發(fā)現(xiàn)IFN α-2b滴眼液和原位凝膠有明顯的眼部不良反應(yīng)。

綜上所述，本研究表明，IFN α-2b在兔濾過手術(shù)模型中具有良好的抗瘢痕作用，原位凝膠給藥系統(tǒng)可以進一步提高IFNα-2b的抗瘢痕作用。由于本實驗僅是IFNα-2b原位凝膠給藥系統(tǒng)的初步研究，IFN α-2b在眼部的藥代動力學(xué)研究、理想的藥物濃度和使用頻率、在人眼的抗瘢痕效果等還有待于進一步的研究。

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