馬永強，韓春然，張 娜，佟曉芳，張毅方，劉 穎

(1.哈爾濱商業(yè)大學 黑龍江省食品科學與工程重點實驗室，黑龍江 哈爾濱 150076；2.黑龍江省食品質(zhì)量監(jiān)督檢驗一站，黑龍江 哈爾濱 150010；3.哈高科大豆食品有限責任公司，黑龍江 哈爾濱 150078)

聚丙烯微孔膜固定化轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶在大豆乳清廢水處理中的應(yīng)用

馬永強1，韓春然1，張 娜1，佟曉芳2，張毅方3，劉 穎1

(1.哈爾濱商業(yè)大學 黑龍江省食品科學與工程重點實驗室，黑龍江 哈爾濱 150076；2.黑龍江省食品質(zhì)量監(jiān)督檢驗一站，黑龍江 哈爾濱 150010；3.哈高科大豆食品有限責任公司，黑龍江 哈爾濱 150078)

將固定化轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶酶膜應(yīng)用到酶膜反應(yīng)器中，對大豆乳清廢水進行催化使其發(fā)生聚合并被截留，從而減輕大豆乳清廢水對環(huán)境的污染，并確定其最佳影響條件，得出在最佳條件下進行處理的蛋白截留率為78.4%。對處理前后大豆乳清廢水進行分析，其主要成分指標發(fā)生了很大變化，如蛋白質(zhì)含量、生化需氧量(biochemical oxygen demand，BOD)值、化學需氧量(chemical oxygen demand，COD)值、灰分含量等指標較處理前發(fā)生顯著下降。

轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶；聚丙烯微孔膜；大豆乳清廢水；固定化酶；催化

生產(chǎn)大豆分離蛋白過程中產(chǎn)生的乳清一直是環(huán)保治理的難點，乳清中含有乳清蛋白，大豆低聚糖和鹽類等物質(zhì)，這些有效成分排放到自然水體中不僅造成資源浪費，而且對水構(gòu)成嚴重污染，生化需氧量(biochemical oxygen demand，BOD)、化學需氧量(chemical oxygen demand，COD)值嚴重超標[1-2]。因此，設(shè)法回收大豆乳清廢水中有用成分不僅可提高原料利用率，并且可大大減輕廢水對環(huán)境的污染。

轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶是一種能催化多肽或蛋白質(zhì)的谷氨酰胺殘基的γ-羥胺基團(?；墓w)與許多伯胺化合物(?；荏w)之間的?；D(zhuǎn)移反應(yīng)的酶[3-4]。經(jīng)過轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶改性后，蛋白質(zhì)分子可以實現(xiàn)交聯(lián)，提高其分子質(zhì)量水平并使其某些物化特性得到改善[5-6]。

目前，大豆乳清廢水的處理方法是直接將其進行多級生物處理，利用厭氧和好氧的方法降低廢水中的COD及BOD值[7]，但是僅此很難達到國家排放標準。固定化酶膜具有聚合大豆乳清蛋白的作用，并且固定化酶膜的一個重要應(yīng)用領(lǐng)域是酶膜反應(yīng)器，近年來酶膜反應(yīng)器用于污水處理，尤其是水中酚的降解也成為研究熱點之一[8-10]。酶膜反應(yīng)器能將酶的催化特性與膜的優(yōu)良性能結(jié)合，使化學反應(yīng)和產(chǎn)品分離同時進行，并且有效地加速反應(yīng)，突破化學平衡的限制，提高轉(zhuǎn)化率[11]。因此，酶膜反應(yīng)器已被廣泛地應(yīng)用于化工、制藥、環(huán)保、食品工業(yè)等領(lǐng)域。通過選擇適當大小孔徑的膜，使底物在酶膜表面反應(yīng)，但不透過膜，而小分子物質(zhì)能透過膜，從而達到純化的目的[12]。近幾年酶的膜固定化技術(shù)己有了很大發(fā)展，但仍有很大的進步潛力。對現(xiàn)有膜材料的改性、開發(fā)新膜材料、采用新的固定化技術(shù)、分子識別固定化、定點固定化、多酶系統(tǒng)共固定將成為這一領(lǐng)域的發(fā)展方向[13]。

本研究以工業(yè)生產(chǎn)大豆分離蛋白的副產(chǎn)物大豆乳清廢水為原料，用實驗室制備好的固定化轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶酶膜應(yīng)用到酶膜反應(yīng)器中，使大豆乳清廢水中的大豆乳清蛋白凝聚并且被截留，并對催化凝聚前后的大豆乳清廢水的主要成分進行分析[14]。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與儀器

固定化轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶 實驗室自制；大豆乳清廢水哈爾濱高科技有限責任公司；標準蛋白(14～100kD) 北京全式金生物技術(shù)有限公司；鹽酸 哈爾濱市新達化工廠；冰醋酸、醋酸鈉 天津市天新精細化工開發(fā)中心；磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉 哈爾濱市新春化工廠；甲醇、硫酸鉀、濃硫酸、氫氧化鈉硫酸銅 哈爾濱市化學試劑廠；硼酸、葡萄糖、蒽酮、硫脲 北京化學試劑公司。

Spectrum722E型紫外-可見分光光度計 上海光譜儀器有限公司；SY-2-4型恒溫水浴鍋 天津市歐諾儀器儀表有限公司；固定化酶膜反應(yīng)器裝置 實驗室自制。1.2 方法

1.2.1 酶膜反應(yīng)器裝置

根據(jù)大豆乳清廢水中的分子質(zhì)量分布，選擇截留分子質(zhì)量分別為25000D的膜進行固定化后，應(yīng)用到酶膜反應(yīng)器中進行反應(yīng)。采用實驗室通過臭氧活化方法制備得到的聚丙烯微孔膜-轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶進行固定化酶膜反應(yīng)器的制備。經(jīng)實驗室優(yōu)化得到的聚丙烯微孔膜上的載轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶量為30.23mg/g膜，并且酶膜活力可達16.9U/g。

反應(yīng)裝置主要包括4個部分：預熱罐、螺桿泵、酶膜反應(yīng)器、產(chǎn)物收集器。其主要工作流程為：將預處理后的大豆乳清廢水過濾，加入到預熱罐中，調(diào)節(jié)到所需的溫度及pH值后，物料經(jīng)螺桿泵通過轉(zhuǎn)子流量計進入酶膜反應(yīng)器中，借助酶膜反應(yīng)器內(nèi)葉輪的作用使大豆乳清廢水與酶膜充分接觸，并使其聚合，大分子物質(zhì)被膜截留，收集到產(chǎn)物收集器中，小分子物質(zhì)及未被聚合的蛋白透過膜后通過管道再次進入到預熱罐中，再次循環(huán)作用。本研究采用大量45℃熱水反向連續(xù)通過酶膜表面的清洗方式。清洗完的酶膜反應(yīng)器，通透量等恢復正常[15]。

1.2.2 酶膜反應(yīng)器處理大豆乳清廢水條件確定

將大豆乳清廢水升溫分別為30、35、40、45、50、55℃，緩慢均勻加入NaOH溶液(分別調(diào)節(jié)pH5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8、10)，然后加入CaCl2溶液，并與直接均勻加入Ca(OH)2并分別調(diào)節(jié)pH8、10的體系進行對比。通過調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)子流量計的顯示，設(shè)定不同物料流速分別為50、70、90、110、130、150mL/min。觀察絮凝沉淀效果確定最佳預處理方法，通過測定不同條件聚合前后的大豆乳清廢水的蛋白質(zhì)含量，根據(jù)蛋白截留率確定最佳聚合溫度、最佳pH值、物料流速[16]。1.2.3 酶膜反應(yīng)器的重復使用性的測定

取反應(yīng)一段時間后的載荷轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶的聚丙烯微孔膜進行酶膜反應(yīng)器重復使用性測定，酶膜反應(yīng)器的剩余酶活采用改進的分光Hydroxamate分析法進行測定[17]。以初始酶活力作為100，其余時間的剩余酶活力同其比值作為評價指標。

1.2.4 大豆乳清廢水成分分析

采用GB 5009.5—2010《食品中蛋白質(zhì)的測定》測定大豆乳清廢水中蛋白質(zhì)的含量；采用蒽酮比色法測定大豆乳清廢水中多糖含量；取廢水樣液用pH計直接測定大豆乳清廢水的pH值；采用GB 11914—2003《化學需氧量的測定》測定大豆乳清廢水中COD值，根據(jù)測定的COD值，采用稀釋接種法測定大豆乳清廢水中的BOD值；采用GB/T 5009.4—2003《食品中灰分的測定》測定大豆乳清廢水的灰分含量。

2 結(jié)果與分析

2.1 酶膜反應(yīng)器處理大豆乳清廢水條件確定

2.1.1 大豆乳清廢水的預處理

表1 大豆乳清廢水預處理方法對比Table 1 Comparison of different pretreatments on protein precipitation in soybean whey wastewater

對大豆乳清廢水采用兩個方法進行預處理，結(jié)果進行對比，如表1所示。對大豆乳清廢水進行預處理的目的是為了去除大豆乳清廢水中大分子質(zhì)量蛋白質(zhì)，澄清

廢水，并使該處理后的廢水通過酶膜反應(yīng)器時作用效率更高，同時對酶膜反應(yīng)器具有一定保護作用。基于處理效果，本實驗選擇1.2‰的Ca(OH)2作為絮凝劑，此條件下，絮凝速度快，上清液澄清，并且絮凝后上清液的灰分最低。

2.1.2 物料溫度對聚合大豆乳清廢水的影響

圖1 物料溫度對蛋白截留率的影響Fig.1 Effect of temperature on interception rate of proteins

由圖1可知，當物料溫度小于45℃時，蛋白截留率很明顯地隨物料溫度的升高而升高，說明此時的物料溫度并不能使廢水中的蛋白充分聚合從而截留，但物料溫度升至45℃時蛋白截留率達到77%，溫度繼續(xù)升高蛋白截留率趨勢穩(wěn)定，并沒有顯著變化，但是此時的蛋白有可能發(fā)生變性，因此最佳物料溫度確定為45℃。

2.1.3 物料pH值對聚合大豆乳清廢水的影響

圖2 物料pH值對蛋白截留率的影響Fig.2 Effect of pH on retention rate of proteins

由圖2可知，當pH值在5～6.5之間時蛋白截留率隨pH值的升高而升高，pH6.5時蛋白截留率達到最高76%，而當pH值繼續(xù)升高，蛋白截留率下降。由此可見，在強酸、強堿性條件下對大豆乳清蛋白的聚合效果較差。物料最佳pH值為6.5。

2.1.4 物料流速對聚合大豆乳清廢水的影響

由圖3可知，當調(diào)節(jié)物料流速為30、50、70mL/min時，蛋白截留率沒有顯著變化。而當流速為大于70mL/min，蛋白截留率呈顯著下降趨勢，此時由于流速較快，大豆乳清廢水中的蛋白在通過酶膜反應(yīng)器的過程中，與固定化轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶的作用有效接觸率降低，所以造成蛋白截留率降低，因此，最佳流速設(shè)定為70mL/min。

圖3 物料流速對蛋白截留率的影響Fig.3 Effect of feed flow rate on retention rate of proteins

2.1.5 酶膜反應(yīng)器的重復使用性

圖4 酶膜衰減系數(shù)隨時間的變化Fig.4 Repeated usability evaluation of MTG-conjugated polypropylene microporous membrane

由圖4可知，酶膜反應(yīng)器中酶膜活力隨工作時間的延長緩慢下降，當工作時間為24h后酶活仍然可高達50%以上，由此可證明，本實驗所制備使用的轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶酶膜的重復使用性較好，較穩(wěn)定。

2.2 聚合前后大豆乳清廢水成分對比分析

2.2.1 主要成分的分析

表2 大豆乳清廢水聚合前后主要成分分析Table 2 Variations of chemical composition of soybean whey wastewater before and after MTG treatment

大豆乳清廢水經(jīng)聚合前后其主要成分指標發(fā)生了很大變化，如蛋白質(zhì)含量、COD值、BOD值、灰分含量等指標較處理前發(fā)生了顯著下降，如表2所示。

2.2.2 處理前后蛋白質(zhì)分子質(zhì)量的分析

采用SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳法分析原大豆乳清廢水和在最佳條件下聚合后收集的乳清蛋白溶液分子質(zhì)量分布，并做對比。如圖5所示，聚合前分子質(zhì)量分布幾乎全部在20kD左右，低于30kD，而聚合后圖譜顯示，明顯在30kD以上出現(xiàn)幾條帶，說明此時已經(jīng)有小分子蛋白聚合成大分子蛋白，并且此圖同樣可證明本實驗所選截留分子質(zhì)量在25000D是符合依據(jù)的。

圖5 SDS-PAGE電泳圖Fig.5 SDS-PAGE of soybean whey wastewater before and after MTG treatment

3 結(jié) 論

本研究將制備好的固定化轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶酶膜應(yīng)用到酶膜反應(yīng)器中，對酶膜反應(yīng)器聚合并截留大豆乳清廢水中蛋白的影響條件：物料溫度、物料pH值、物料流速進行考查，最佳條件為：物料溫度45℃、物料pH6.5、物料流速70mL/min。在最佳條件下進行處理的蛋白截留率為78.4%。本實驗檢驗了該酶膜的重復使用性，工作時間為24h后酶活仍然可高達50%以上。大豆乳清廢水經(jīng)酶膜反應(yīng)器處理，蛋白質(zhì)含量、COD值、BOD值、灰分含量發(fā)生了尤其顯著的變化。其中蛋白質(zhì)含量由原0.51%下降至0.11%，COD值由17794mg/L下降至4549mg/L，BOD值由10973mg/L下降至2586mg/L，灰分由0.71%下降至0.11%。

[1]袁其朋, 馬潤宇. 膜分離技術(shù)處理大豆乳清廢水[J]. 水處理技術(shù), 2001, 27(3): 161-162.

[2]杜明, 劉鶴楠, 易華西, 等. 大豆乳清蛋白研究進展[J]. 食品工業(yè)科技, 2008, 29(2): 302-304.

[3]YAMAGUCHI S, JEENES D J, ARCHER D B. Protein-glutaminase fromChryseobacterium proteolyticum, an enzyme that deamidates glutaminyl residues in proteins. purification, characterization and gene cloning[J]. Eur J Biochem, 2001, 268(5): 1410-1421.

[4]SATO H, HAYASHI E, YAMADA N. Further studies on the sitespecific protein modification by microbial transglutaminase[J]. Bioconjugate Chem, 2001(12): 701-2710.

[5]IKURA K, KOMETANI T, SASAKI R, et al. Crosslinking of soybean 7S and 11S proteins by transglutaminase[J]. Agric Biol Chem, 1980, 44 (12): 2979-2984.

[6]劉心偉, 呂加平, 范貴生. 微生物轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶在食品工業(yè)中的研究進展[J]. 內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學學報, 2005, 26(4): 54-57.

[7]徐朝輝, 萬端極, 崔朝亮, 等. 膜技術(shù)在處理大豆乳清廢水中的應(yīng)用[J]. 中國油脂, 2007, 32(1): 68-69.

[8]趙麗穎, 符群. 膜分離技術(shù)在大豆乳清廢水回收中應(yīng)用[J]. 糧食與油脂, 2002(9): 48-49.

[9]CHAKRABARTI R, CHAKRABORTY D. Mechanical and thermomechanical characterization of PVC/polyalkylacrylate blends[J]. J Appl Polym Sci, 2006, 102(4): 3698-3703.

[10]梁華民, 田少君, 周怡. 轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶對大豆分離蛋白交聯(lián)聚合作用研究[J]. 糧食與油脂, 2004(2): 3-6.

[11]王文杰, 王璋. 酶膜反應(yīng)器中水解大豆分離蛋白的研究[J]. 食品與機械, 2008, 24(1): 16-19.

[12]儲力前, 付永彬. 膜分離技術(shù)在大豆蛋白廢水處理中的應(yīng)用研究[J].給水排水, 2000, 26(5): 36-37.

[13]高安全, 吳景遠, 梁偉. 膜分離技術(shù)在大豆乳清回收中的應(yīng)用[J]. 過濾與分離, 2001, 11(3): 26-27.

[14]De JONG G A H, KOPPELMAN S J. Transglutaminase catalyzed reaction: impact on food applications[J]. Journal of Food Science, 2002, 67(8): 2798-2806.

[15]陳愛梅, 江連州. 膜分離大豆乳清蛋白的研究[J]. 糧油加工與食品機械, 2005(10): 79-82.

[16]尹少謙, 王淼. Streptomyces hygroscopicus 谷氨酰胺酶轉(zhuǎn)胺酶分離純化及其性質(zhì)研究[J]. 食品與發(fā)酵工業(yè), 2005, 31(3): 26-29.

[17]劉穎, 張丹丹, 馬永強, 等. 新轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶在聚丙烯膜上的固定化研究[J]. 食品工業(yè)科技, 2010, 31(6): 49-52.

Application of Polypropylene Microporous Membrane Carrying Transglutaminase to Treat Soybean Whey Waste

MA Yong-qiang1，HAN Chun-ran1，ZHANG Na1，TONG Xiao-fang2，ZHANG Yi-fang3，LIU Ying1
(1. Key Laboratory of Food Science and Engineering of Heilongjiang Province, Harbin University of Commerce, Harbin 150076, China；2. Administration of Quality Supervision, Inspection of Heilongjiang, Harbin 150001, China；3. Harbin Hi-tech Soybean Food Company, Harbin 150078, China)

In this study, we immobilized microbial transglutaminase (MTG) onto polypropylene microporous membrane by ozone activation and then evaluated its application to treat soybean whey waste with the purpose to recover proteins and decrease pollution. The results showed that under optimal technological conditions, MTG-conjugated polypropylene microporous membrane recovered 78.4% of proteins from soybean whey waste, and significantly decreased protein and ash contents, COD value and BOD value of soybean whey waste.

microbial transglutaminase；polypropylene microporous membrane；soybean whey wastewater；enzyme immobilization；atalysis

TS252.41

A

1002-6630(2011)20-0104-04

2011-06-29

黑龍江省高?？萍紕?chuàng)新團隊建設(shè)計劃項目(2010td04)；國家“863”計劃項目(2008AA10Z303)

馬永強(1963—)，男，教授，碩士，研究方向為食品酶學、食品化學。E-mail：mayq@hrbcu.edu.cn