隋 濤，付 建，李曉玉，郭海霞，婁喜山

(1.煙臺(tái)出入境檢驗(yàn)檢疫局，山東 煙臺(tái) 264000；2.煙臺(tái)杰科檢測(cè)服務(wù)有限公司，山東 煙臺(tái) 265231)

超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法同時(shí)測(cè)定水產(chǎn)品中6種獸藥殘留

隋 濤1，付 建2，李曉玉1，郭海霞2，婁喜山2

(1.煙臺(tái)出入境檢驗(yàn)檢疫局，山東 煙臺(tái) 264000；2.煙臺(tái)杰科檢測(cè)服務(wù)有限公司，山東 煙臺(tái) 265231)

采用液液萃取的前處理方式，以超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜(UPLC-MS/MS)檢測(cè)水產(chǎn)品中萘啶酸、泰妙菌素、甲氧芐胺嘧啶、二氟沙星、氟甲砜霉素和吡喹酮的殘留量。水產(chǎn)品經(jīng)過(guò)勻質(zhì)，乙腈提取并沉淀蛋白，正己烷去除脂肪，UPLC-MS/MS進(jìn)行檢測(cè)，在6min內(nèi)完成分離。在5～200μg/L范圍內(nèi)，相關(guān)系數(shù)R2在0.9977～0.9999之間，具有良好的線性關(guān)系。6種物質(zhì)的檢測(cè)限度均為1.0μg/kg，回收率范圍在61.2%～90.5%之間。本方法操作簡(jiǎn)單、靈敏度高，可以滿足水產(chǎn)品中農(nóng)藥殘留的的定性定量檢測(cè)。

萘啶酸；泰妙菌素；甲氧芐胺嘧啶；二氟沙星；氟甲砜霉素；吡喹酮；超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜；多反應(yīng)監(jiān)測(cè)

萘啶酸為第一代喹諾酮類抗菌藥物，對(duì)大腸埃希菌、克雷伯菌屬、變形桿菌屬、志賀菌屬、沙門(mén)菌屬、腸桿菌屬及流感嗜血桿菌的部分菌株具抗菌活性。泰妙菌素是一種雙萜類動(dòng)物專用抗生素，主要用于防治家畜家禽呼吸系統(tǒng)疾病和動(dòng)物促生長(zhǎng)，是世界十大獸用抗生素之一。甲氧芐胺嘧啶是一種抗菌藥物，抗菌譜與磺胺藥相近，具有抑制二氫葉酸還原酶的作用。二氟沙星是動(dòng)物用抗菌藥，屬于氟喹諾酮類。氟甲砜霉素是獸用抗菌藥，用于敏感細(xì)菌所致的豬、雞及魚(yú)的細(xì)菌性疾病。吡喹酮為一新型廣譜抗寄生蟲(chóng)藥。結(jié)構(gòu)式見(jiàn)圖1。

韓國(guó)國(guó)立水產(chǎn)物品質(zhì)檢查院計(jì)劃2010年增加針對(duì)水產(chǎn)品的檢測(cè)項(xiàng)目，新增抗生素類項(xiàng)目12項(xiàng)，其中包括萘啶酸(nalidixic acid)、吡喹酮(praziquantel)、泰妙菌素(tiamulin)、二氟沙星(difloxacin)、甲氧芐胺嘧啶(trimethoprim)、氟甲砜霉素(florfenicol)，在魚(yú)類或甲殼類中的限量分別為0.03、0.02、0.1、0.3、0.05、0.1mg/kg。

從目前文獻(xiàn)和資料方法來(lái)看，抗生素類檢測(cè)方法的對(duì)象局限于單類抗生素在一種或多種基質(zhì)中的殘留[1-5]。本實(shí)驗(yàn)研究的6種獸藥檢測(cè)方法也多為單一檢測(cè)[6-14]，且所用儀器多為液相色譜，定量不夠準(zhǔn)確，靈敏度也不夠高。萘啶酸的檢測(cè)尚無(wú)相關(guān)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)和行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)，泰妙菌素、甲氧芐胺嘧啶、二氟沙星、氟甲砜霉素、吡喹酮5種藥物雖然分別有相關(guān)的國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)或行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)，但每個(gè)項(xiàng)目均為獨(dú)立的前處理方法和儀器檢測(cè)方法，不能同時(shí)、快速分析檢測(cè)。分析時(shí)間長(zhǎng)，成本高，效率非常低，難以有效地對(duì)其出口安全性進(jìn)行監(jiān)控。因此，建立一種可以同時(shí)、快速檢測(cè)上述藥物的標(biāo)準(zhǔn)方法對(duì)人們的身體健康和出口貿(mào)易都有十分重要的意義。

圖1 6種獸藥的結(jié)構(gòu)式Fig.1 Structures of six veterinary drugs

本實(shí)驗(yàn)旨在建立快速萃取后進(jìn)樣同時(shí)測(cè)定水產(chǎn)品中萘啶酸、泰妙菌素、甲氧芐胺嘧啶、二氟沙星、氟甲砜霉素、吡喹酮的超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法。該法具有可多種獸藥同時(shí)分析、操作簡(jiǎn)便、測(cè)定速度快等優(yōu)點(diǎn)，適應(yīng)目前出口食品的快速通關(guān)檢測(cè)工作的需要，也可作為企業(yè)內(nèi)控檢測(cè)的標(biāo)準(zhǔn)方法，從而提高企業(yè)出口產(chǎn)品安全性，降低企業(yè)檢測(cè)成本。

1 材料與方法

1.1 試劑

乙腈、甲醇(均為色譜純) 德國(guó)默克公司；正己烷、甲酸(均為色譜純) 天津科密歐化學(xué)試劑有限公司；水為超純水，乙酸銨為優(yōu)級(jí)純。

6種標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)(純度)：萘啶酸(99.5%)、泰妙菌素(98.5%)、甲氧芐胺嘧啶(99.5%)、二氟沙星(98.4%)、氟甲砜霉素(99.0%)、吡喹酮(99.0%) 德國(guó)Dr.Ehrenstorfer公司。

單標(biāo)儲(chǔ)備液制備：用天平準(zhǔn)確稱取0.0100g標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，用乙腈配制成100mg/L的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，4℃避光保存。

混合標(biāo)準(zhǔn)工作液的制備：準(zhǔn)確移取一定量的混合標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液置于容量瓶中，用乙腈與水混合溶液(4:6，V/V)定容至刻度線，逐級(jí)稀釋成2、5、10、25、50、100 μg/L的標(biāo)準(zhǔn)工作混合液，于4℃條件下保存。

1.2 儀器與設(shè)備

超高效液相色譜儀UPLC、Premier四極桿串聯(lián)質(zhì)譜儀 美國(guó)Waters公司；Rios 8超純水儀 美國(guó)Millipore公司；T18均質(zhì)器 德國(guó)IKA公司；N-1100旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 日本東京理化器械株式會(huì)社；DL-5C離心機(jī) 上海安亭科學(xué)儀器廠；孔徑0.22μm 的濾膜。

1.3 樣品處理

稱取5.00g勻質(zhì)后的樣品、5g無(wú)水硫酸鈉，置于50mL離心管中，加入20mL乙腈，振蕩提取10min，4000r/min離心5min，上清液轉(zhuǎn)移至125mL分液漏斗中，殘?jiān)屑尤?0mL乙腈，再次提取1次，合并上清液至分液漏斗中。向分液漏斗中20mL乙腈飽和的正己烷溶液，混合均勻，靜置分層，分取乙腈層至茄形瓶中。40℃水浴條件下旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至干，準(zhǔn)確加入1mL乙腈-水(4:6，V/V)混合溶液和1mL乙腈飽和正己烷，超聲使其完全溶解，將溶液轉(zhuǎn)移至2.0mL小離心管中，12000r/min高速離心10min。吸取下層過(guò)0.22μm的濾膜。待檢測(cè)。

1.4 超高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用分析

1.4.1 色譜條件

表1 流動(dòng)相梯度洗脫程序Table 1 Gradient elution program

色譜柱：Waters ACQUITY UPLC HSS T3(2.1mm×100mm，1.8μm)；流動(dòng)相：甲醇-5mmol/L 乙酸銨溶液(0.1%甲酸)，梯度洗脫程序見(jiàn)表1； 流速：0.25mL/min；柱溫35℃；進(jìn)樣量：3μL。首先用一個(gè)等梯度洗脫程序，觀察每一種化合物出峰的出峰順序，后確定一個(gè)較為粗略的梯度洗脫程序，通過(guò)不斷優(yōu)化和實(shí)驗(yàn)最終確定一個(gè)最佳的梯度洗脫程序。

1.4.2 質(zhì)譜條件

采用ESI離子源；掃描方式：由于氟甲砜霉素含有電負(fù)性較強(qiáng)的氯基團(tuán)，因此確定為負(fù)離子掃描，萘啶酸、泰妙菌素、甲氧芐胺嘧啶、二氟沙星、吡喹酮為正離子掃描；正離子模式下毛細(xì)管電壓：3.0kV，負(fù)離子模式下毛細(xì)管電壓為2.6kV；離子源溫度：110℃；脫溶劑溫度：350℃。首先對(duì)每一種標(biāo)準(zhǔn)品的單標(biāo)進(jìn)行蠕動(dòng)進(jìn)樣，通過(guò)分別界定母離子和子離子的掃描范圍進(jìn)行全掃描以確定母離子和子離子對(duì)的準(zhǔn)確值，然后分別通過(guò)改變不同的錐孔電壓和碰撞能值使化合物的出峰靈敏度達(dá)到最高以使錐孔電壓和碰撞能值達(dá)到最優(yōu)。

2 結(jié)果與分析

2.1 質(zhì)譜分析與方法定性

分別將6種5mg/L的單獨(dú)標(biāo)準(zhǔn)溶液以蠕動(dòng)泵進(jìn)樣的方式注入到質(zhì)譜中，萘啶酸、泰妙菌素、甲氧芐胺嘧啶、二氟沙星、吡喹酮在ESI+方式下進(jìn)行一級(jí)質(zhì)譜全掃描分析，可以找到準(zhǔn)確的[M+H]+分子離子峰。氟甲砜霉素在ESI+方式下離子化強(qiáng)度遠(yuǎn)弱于ESI-，因此氟甲砜霉素選擇在ESI-方式下進(jìn)行MRM分析。用daughterscan 方式對(duì)子離子及碰撞能量進(jìn)行優(yōu)化。

2.2 色譜條件的選擇

2.2.1 色譜柱的選擇

本研究選用適用于Acquity UPLC的3種專用反相色譜柱，在其他質(zhì)譜與液相條件相同的情況下，比較各色譜柱對(duì)6種物質(zhì)的保留情況、靈敏度、峰形等。3種色譜柱規(guī)格為：Waters ACQUITY UPLC HSS T3 Column(2.1mm×100mm，1.8μm) (簡(jiǎn)寫(xiě)：T3)；Waters ACQUITY SHIELD RP18 Column(2.1mm×100mm，1.7μm)(簡(jiǎn)寫(xiě)：RP)；Waters ACQUITY UPLC BEH C18Column (2.1mm×100mm，1.7μm) (簡(jiǎn)寫(xiě)：C18) 。

表2 6種獸藥的UPLC-MS/MS儀器參數(shù)Table 2 LC-ESIMS/MS parameters for 6 veterinary drugs

圖2 6種獸藥不同色譜柱下的色譜圖Fig.2 Chromatographic plots of six veterinary drugs separated by column

從圖2可以看出，RP柱與C18柱的分離度相似，T3柱對(duì)甲氧芐胺嘧啶、吡喹酮的保留性要明顯優(yōu)于RP柱和C18柱。靈敏度由大到小排序?yàn)椋篢3＞RP＞C18。所以最終選擇Waters ACQUITY UPLC HSS T3 Column為樣品分析柱。

2.2.2 流動(dòng)相的選擇

流動(dòng)相中使用緩沖鹽(乙酸銨)可以增加6種物質(zhì)的保留性；加入適當(dāng)?shù)募姿峥梢源偈够衔镫婋x，提高靈敏度。甲醇與乙腈相比，極性較弱，同樣流動(dòng)相梯度條件下，使用甲醇時(shí)，目標(biāo)物的保留時(shí)間靠后；同時(shí)甲醇為質(zhì)子化試劑，用甲醇做流動(dòng)相，目標(biāo)物的離子化程度高，靈敏度相對(duì)也高，記過(guò)顯示：用甲醇做流動(dòng)相目標(biāo)物的峰面積是乙腈做流動(dòng)相時(shí)的2倍。因此選擇甲醇-5mmol/L乙酸銨溶液(含體積分?jǐn)?shù)0.1%甲酸)作為流動(dòng)相。

2.2.3 前處理?xiàng)l件的選擇

本研究旨在快速同時(shí)分析這6種物質(zhì)，因此前處理時(shí)間也是一個(gè)重要的控制點(diǎn)。本研究舍棄了SPE凈化手段，選擇了耗時(shí)少、分析成分低的液液萃取凈化方式。用乙腈提取樣本中的目標(biāo)物，同時(shí)達(dá)到沉淀蛋白的目的；采用正己烷與乙腈液液分配去除脂肪和脂溶性雜質(zhì)；定容后再用乙腈飽和正己烷去一次油脂，同時(shí)12000r/min以上高速離心，去除大分子雜質(zhì)。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，定溶液中加入甲酸會(huì)影響氟甲砜霉素的靈敏度，響應(yīng)面積約降低1倍，最終定容液未加酸。

2.3 方法性考察

表3 6種獸藥的線性范圍、線性方程及相關(guān)系數(shù)Table 3 Linear ranges, regression equations and related coefficients for 6 veterinary drugs

6種獸藥線性考察見(jiàn)表3。在6min內(nèi)完成分離。在5～200μg/L的質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，相關(guān)系數(shù)R2在0.9977～0.9999之間，具有良好的線性關(guān)系。

向馬哈魚(yú)、鲅魚(yú)、海鋪蝦空白樣品中添加3個(gè)水平的6種混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，按1.3節(jié)方法做回收率實(shí)驗(yàn)。每個(gè)添加水平重復(fù)6次，計(jì)算添加回收率和結(jié)果相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差，結(jié)果見(jiàn)表4。根據(jù)RSN≥10作為檢出限，6種物質(zhì)的檢測(cè)限度均為1.0μg/kg，回收率范圍在61.2%～90.5%之間。

表4 方法的加標(biāo)回收率Table 4 Recovery rates of spiked samples

3 結(jié) 論

本研究采用乙腈提取目標(biāo)物并沉淀蛋白、正己烷去除脂溶性雜質(zhì)，可基本排除水產(chǎn)品基質(zhì)對(duì)離子化的影響；采用超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜儀進(jìn)行檢測(cè)，靈敏度高、定性定量準(zhǔn)確。與普通液相色譜相比，定性和定量更加準(zhǔn)確，通過(guò)不同檢測(cè)人員對(duì)陽(yáng)性結(jié)果進(jìn)行復(fù)檢基本可以排除假陽(yáng)性的錯(cuò)誤結(jié)果。而且大大提高了檢測(cè)靈敏度，使得檢測(cè)結(jié)果由幾十、幾百ng/g甚至μg/g級(jí)提高到1.0ng/g，可以更好的應(yīng)對(duì)國(guó)外的技術(shù)壁壘。另外，超高效液相色譜(UPLC)與高效液相色譜(HPLC)相比由于具有小顆粒填料、非常低系統(tǒng)體積及快速檢測(cè)手段等技術(shù)，增加了分析的通量及色譜峰容量，與傳統(tǒng)的HPLC相比，UPLC的速度、靈敏度及分離度分別是HPLC的9倍、3倍及1.7倍。本實(shí)驗(yàn)在5～200 μg/L質(zhì)量濃度范圍內(nèi)具有良好的線性關(guān)系，6種分析物質(zhì)的檢測(cè)限度均為1.0μg/kg，回收率范圍在61.2%～90.5%之間，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差均不大于12.5%。本研究能夠滿足快速同時(shí)分析水產(chǎn)品中萘啶酸、泰妙菌素、甲氧芐胺嘧啶、二氟沙星、氟甲砜霉素、吡喹酮檢測(cè)的需求。

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Simultaneous Determination of Veterinary Drug Residues in Aquatic Products by UPLC-MS/MS

SUI Tao1，F(xiàn)U Jian2，LI Xiao-yu1，GUO Hai-xia2，LOU Xi-shan2
(1. Yantai Entry-exit Inspection and Quarantine Bureau, Yantai 264000, China；
2. Yantai Jieke Inspection Service Co. Ltd., Yantai 265231, China)

A method for detecting residues of nalidixic acid, tiamulin, trimethoprim, difloxacin, florfenicol and praziquantel in aquatic products by ultra-high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry (UPLC-MS/MS)after liquidliquid extraction approach was established. The samples were extracted using acetonitrile as the solvent, purified by hexane and detected by UPLC-MS/MS within 6 minutes. The linear regression coefficients corresponding to 6 spiked levels in the range of 5 to 200 μg/L were between 0.9977 and 0.9999. The detection limit for each of the six substances was 1.0 μg/kg, and their recoveries were in the range of 61.2% to 90.5%. The developed method is simple and sensitive and can meet the requirements for qualitative and quantitative analysis of aquatic products.

nalidixic acid；tiamulin；trimethoprim；difloxacin；florfenicol；praziquantel；ultra-high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry (UPLC-MS/MS)；multiple-reaction monitoring (MRM)

O657.63；S859.84

A

1002-6630(2011)10-0203-05

2010-07-15

2010年度山東檢驗(yàn)檢疫局科研項(xiàng)目(SK201030)

隋濤(1966—)，男，工程師，本科，研究方向?yàn)槭称分械乃幬餁埩魴z測(cè)。E-mail：ytst2009@163.com