張 昕，崔曉東，王轉花

(1.山西大學環(huán)境科學與工程研究中心，山西 太原 030006；2.山西大學生物技術研究所，山西 太原 030006)

蕎麥過敏原特異性抗體酶聯(lián)免疫吸附法檢測試劑制備

張 昕1，崔曉東2，王轉花2

(1.山西大學環(huán)境科學與工程研究中心，山西 太原 030006；2.山西大學生物技術研究所，山西 太原 030006)

以天然苦蕎過敏蛋白包被聚苯乙烯微孔板，以鼠抗人IgE抗體標記辣根過氧化物酶，以間接酶聯(lián)免疫吸附法(indirect enzyme-linked immunosorbent assay，IELISA)檢測病人血清中的特異性抗體，分析并建立關鍵操作步驟及反應條件。結果表明：ELISA反應的最適工作條件為包被的抗原質量濃度100μg/mL、陽性血清稀釋度1:50、酶標二抗稀釋度1:1000，37℃時封閉的最佳時間為40min，包被抗原與陽性血清中抗體的最佳作用時間為40min，陽性血清與酶標二抗的最佳作用時間為40min。本方法具有良好的特異性、重復性和精密度。

苦蕎；過敏蛋白；試劑盒；間接酶聯(lián)免疫吸附法

食物過敏同保健食品和食品安全等，已成為食品衛(wèi)生研究中的重要問題。全球范圍內，大約有4%～6%的兒童和2%的成年人有食物過敏癥[1]。患者一旦發(fā)生食物過敏，癥狀通常十分嚴重。目前，我國對于食品過敏研究還沒有引起足夠的重視，與國外發(fā)達國家相比有較大的差距，這對于我國全民的身體健康構成了很大的威脅。過敏原無處不在，因此患者清楚自己對何種食品過敏，及早避開這些過敏原就顯得至關重要。

近年來，富含生物類黃酮及多種生物活性成分的蕎麥、燕麥等產品不斷問世，而食用這些食品引起的不同程度過敏癥也成為了生物學和醫(yī)藥學領域普遍關注的熱點問題。蕎麥由于其獨特的營養(yǎng)以及藥用價值，在世界各地已經成為一種普遍栽培的作物[2]。近年來關于蕎麥過敏的報道日益增多，許多人在食用或接觸蕎麥后會產生休克、哮喘和皮疹等過敏癥狀[3-7]。目前，有關蕎麥過敏的診斷在國外已有臨床檢測的產品，但它的檢測范圍較窄，對于一些蕎麥過敏的病例易造成漏檢。間接性ELISA(indirect enzyme linked immunosorbent assay，IELISA)診斷技術具有特異、敏感、快速、經濟、可自動化等特點，是過敏癥早期快速診斷和免疫抗體監(jiān)測的有效實用技術[8-10]。

對蕎麥食品過敏的患者首先應進行過敏原檢測，只有明確過敏原后，才能進行下一步針對性的預防和治療。本實驗從前期得到的苦蕎種子中，分離純化得到一種分子質量為24kD的蛋白質，同時采用基因克隆、定點突變及免疫學等技術確認其為苦蕎麥食品中的主要過敏原[11-12]。在此基礎上，本研究將通過分離、純化獲得苦蕎過敏蛋白純品，并對ELISA反應體系進行優(yōu)化，制備一種成本低、特異性高的蕎麥過敏蛋白ELISA抗體檢測試劑，為食物過敏癥患者過敏原的檢測、確診提供方法和試劑。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與儀器

血清來自于蕎麥過敏患者(臨床表現(xiàn)為哮喘、變異性鼻炎、皮疹等癥狀)，特異性IgE濃度均大于0.35IU/mL；辣根過氧化物酶鼠抗人IgE 美國Southernbiotech公司。

抗原包被液(5 0mmol/L碳酸鹽緩沖液、2.93 g NaHCO3、1.59g Na2CO3、1L ddH2O，pH9.6)，抗體稀釋液(8g NaCl、2.9g Na2HPO4·12H2O、0.2g KH2PO4、0.5mL 吐溫-20、0.01mmol/L PBST、1L ddH2O，pH7.4)，底物-鄰苯二胺溶液(SIGMA FASTTM OPD Tablet Set，Sigma)臨用前配制：0.1mol/L檸檬酸、0.2mol/L Na2HPO4·12H2O、12.5mL蒸餾水，10mg鄰苯二胺，臨用前加質量分數(shù)30%的H2O2溶液。

酶標測定儀 美國Bio-RAD公司；CAP系統(tǒng) 瑞典Pharmacia公司。

1.2 方法

1.2.1 抗原樣品的制備

按照已報道的苦蕎過敏蛋白的制備方法[13]，將脫脂蕎麥粉經緩沖液抽提、鹽析、透析、離子交換和凝膠過濾層析，得到電泳純的24kD抗原，將抗原真空凍干，備用。

1.2.2 ELISA最佳反應條件選擇

1.2.2.1 陽性血清最佳稀釋度與抗原包被濃度的確定

采用方陣滴定法，用包被緩沖液將制備的抗原分別按5、10、20、30、40、50、100、200μg/mL 稀釋后包被ELISA板，抗原在使用前加入吐溫-20，使其終體積分數(shù)達到1%。4℃過夜包被，倒盡液體，用洗滌液(PBST)洗3次。用質量分數(shù)1%的明膠于37℃水浴封閉1h。用洗滌液洗3次，每排1～8孔分別加入按照1:20、1:40、…、1:2560倍稀釋的陽性血清，再加入酶標二抗(辣根過氧化物酶標記的鼠抗人IgE)，洗3次，最后加入鄰苯二胺顯色底物，37℃溫育15min，加入1mol/L H2SO4溶液終止反應，在酶標儀上測定OD490處的光密度。

1.2.2.2 酶標二抗最佳工作濃度的確定

用1.2.2.1節(jié)確定的最佳抗原包被濃度包被酶標板，陽性血清也使用1.2.2.1節(jié)確定的最佳稀釋度。酶標二抗稀釋度分別為1:100、1:200、1:400、1:800、1:1600、1:3200、1:6400和1:12800，具體操作同1.2.2.1節(jié)。

1.2.2.3 封閉液最佳作用時間的確定

使用1.2.2.1節(jié)確定的抗原包被濃度和陽性血清稀釋度，使用1.2.2.2節(jié)確定的酶標二抗稀釋濃度。用質量分數(shù)1%的明膠封閉酶標板，分別封閉20、30、40、50、60、70、80、90min，具體操作同1.2.2.1節(jié)。

1.2.2.4 抗原抗體最佳作用時間的確定

使用1.2.2.1節(jié)確定的抗原包被濃度和陽性血清稀釋度，分別作用 20、30、40、50、60、70、80、90min，使用1.2.2.3節(jié)確定的封閉液最佳作用時間，將酶標二抗按步驟1.2.2.2節(jié)選擇的濃度稀釋后加入酶標板。具體操作同1.2.2.1節(jié)。

1.2.2.5 陽性血清與酶標二抗最佳作用時間的確定

陽性血清與酶標二抗分別作用20、30、40、50、60、70、80、90min，其余步驟使用以上確定的條件進行，具體操作同1.2.2.1節(jié)。

1.2.3 ELISA陰、陽性血清標準臨界值的確定

取一定數(shù)量的陰性血清樣本，使用已建立的ELISA方法，并參考市售其他食品過敏原檢測試劑盒使用說明，確定標準臨界值。大約95%的陰性血清OD值與平均值0.05相近，以陰性參考血清的2倍作為陽性判定值。確定P/N＜2.1為陰性、P/N≥2.1為陽性(P為陽性OD值、N為陰性OD值)。依照上述步驟確定的條件，本實驗取陰性血清和陽性血清8份進行ELISA鑒定，測量OD490值，以絕對值法判定結果。

1.2.4 ELISA質量鑒定

將陽性對照血清按照1:50、1:100、…、1:6400倍稀釋，選用質量濃度為100μg/mL的苦蕎蛋白進行吸收，然后進行ELISA特異性檢測。同時測定選用質量濃度為100μg/mL的BSA溶液吸收阻斷的陽性對照血清的OD490值與未加抗原的陽性對照血清的OD490值。

另外取2例陰性血清(N1、N2)和3例陽性血清(P1、P2、P3)在同一條件和時間下進行ELISA重復性實驗。實驗共重復測定8次，取8次測定值，計算其平均值、變異系數(shù)以及相關統(tǒng)計學指標。

2 結果與分析

2.1 苦蕎過敏蛋白的純度分析

將苦蕎蛋白的粗提物先后通Sephadex G-100和DEAE-Sepharose CL 6B柱層析分離，十二烷基磺酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresi，SDS-PAGE)檢測其純度。圖1顯示，純化的24kD目的蛋白(上樣量為5μg)為單一條帶，純度達到9 5%以上，可滿足后續(xù)研究。

圖1 目的蛋白的SDS-PAGE 分析Fig.1 SDS-PAGE analysis of purified protein from tartary buckwheat

2.2 ELISA最佳反應條件的確定

2.2.1 陽性血清最佳稀釋度與最佳抗原包被濃度的確定

采用方陣滴定測定了陽性血清最佳稀釋度和最佳抗原包被濃度，結果顯示當抗血清的稀釋濃度為1:40和1:80時，各稀釋度的抗原OD值均較高(表1)。為了取樣方便，選定1:50作為最佳的稀釋度。當包被抗原質量濃度為100μg/mL時，各稀釋度的抗體即陽性血清的OD值最大，而當包被質量濃度為200μg/mL的時候，OD值較小，原因可能是，質量濃度太高時，空間因素影響了抗原抗體的結合。最后確定100μg/mL、1:50為抗原包被與抗血清稀釋的工作濃度。

表 1 包被抗原和抗血清濃度的方陣滴定Table 1 Titration matrix of coating antigen and positive antiserum dilution

2.2.2 酶標二抗最佳稀釋度的確定

在確定最佳血清稀釋度和最佳包被條件的情況下，進一步確定酶標二抗的稀釋度。從圖2可以看出，當稀釋倍數(shù)處于1:100～1:400之間時，因為酶標二抗過量，容易造成非特異性吸附，因此OD值較高；當倍數(shù)大于1:1600時，由于抗體量不足，造成光密度值較小。因此比較適宜的稀釋倍數(shù)為1:400～1:1600，本研究選定1:1000為最佳稀釋度。2.2.3 封閉液最佳作用時間的確定

圖2 酶標二抗最適濃度的確定Fig.2 Determination of optimal working concentration of HRP-labeled mouse anti-human IgE

在ELISA反應中，封閉液的封閉效果和均一性對于實驗的結果至關重要。因此本研究選用純度較好的明膠作為封閉液，以減少實驗的誤差。在封閉液確定的條件下對封閉的時間進行研究。發(fā)現(xiàn)在40～60min之間時，OD值比較穩(wěn)定(圖3)，最終確定40min為最佳封閉時間。

圖3 封閉液最佳作用時間的確定Fig.3 Determination of optimal blocking time

2.2.4 抗原抗體最佳作用時間的確定

包被抗原和血清中抗體的結合強度和特異性程度是ELISA實驗結果是否穩(wěn)定的因素之一。通過對抗原抗體的最佳作用時間進行探討，發(fā)現(xiàn)在30～60min范圍內，OD值處于一個相對穩(wěn)定的水平(圖4)，而作用時間大于60min后，OD值明顯偏大，最終選定最佳作用時間為40min。

圖4 抗原抗體最佳作用時間的確定Fig.4 Determination of optimal incubation time of antigen and antibody for conjugation

2.2.5 陽性血清與酶標二抗最佳作用時間的確定

陽性血清與酶標二抗的作用時間研究結果如圖5顯示，在兩者作用40～60min之間，OD值比較穩(wěn)定，因此選定40min為最佳作用時間。

圖5 酶標二抗與陽性血清最佳工作時間的確定Fig.5 Determination of optimal working time of HRP-labeled mouse anti-human IgE and patients’positive sera

2.3 陽性血清標準臨界值的確定

因為每次實驗條件(包括試劑配制)會存在差異，一般采用標本(P)與陰性對照(N)比值(P/N)的方法確定實驗結果屬于陽性還是陰性。在得出標本和陰性對照的OD值后，計算P/N值。P/N＜2.1為陰性、P/N≥2.1為陽性，因此，標準臨界值＝2.1×陰性對照OD值。本實驗將緩沖液作為陰性對照。為避免假陽性的出現(xiàn)，對N值作一些特殊規(guī)定，即如果實驗中N值小于0.05，則按0.05計算。經測量后，8份陽性血清OD值均大于0.15，P/N≥2.1，符合測定需要。

2.4 ELISA質量判定

2.4.1 ELISA特異性實驗

阻斷實驗顯示用苦蕎抗原吸收不同稀釋度的陽性對照血清后，陽性血清的OD490值明顯降低。而用BSA吸收阻斷的陽性對照血清后所測的OD490值，與未加抗原的陽性對照血清的OD490值沒有差異。說明本方法具有良好的特異性。

2.4.2 ELISA重復性實驗

選取2例陰性血清和3例陽性血清在同一時間(t1)和條件下重復測定8次，結果顯示其OD490值變化不顯著，陽性樣本P1、P2、P3變異系數(shù)均小于5%，說明本方案的精密度比較高。又在不同時間(t2)重復測定8次，所測定的8次變異系數(shù)不超過10%。

3 結 論

本實驗從苦蕎種子中分離純化得到一種苦蕎麥過敏蛋白，純度達到95%以上，采用間接酶聯(lián)免疫吸附法初步建立了此過敏原的特異性抗體檢測方法，確定用ELISA檢測抗血清時的最適工作條件為包被的抗原質量濃度100μg/mL、陽性血清稀釋度1:50、酶標二抗稀釋度1:1000，37℃時封閉的最佳時間為40min，包被抗原與陽性血清中抗體的最佳作用時間為40min，陽性血清與酶標二抗的最佳作用時間為40min。ELISA進行的8次重復實驗結果顯示變異系數(shù)較低，證實本方法具有良好的重復性，并且精密度也較好。

制備一個穩(wěn)定且成熟的特異性過敏原檢測試劑需要通過大量的重復實驗和臨床檢測，血清的樣本數(shù)、抗原的純度、包被濃度、反應時間及溫度等都會對結果造成影響。本研究根據(jù)間接ELISA方法初步研制的檢測手段具有一定的特異性和穩(wěn)定性，而對于蕎麥食品過敏原檢測試劑的商品化開發(fā)還需要進一步研究。

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Preparation of an ELISA Method for Determining Buckwheat Allergen

ZHANG Xin1，CUI Xiao-dong2，WANG Zhuan-hua2
(1. Research Center for Environmental Science and Engineering, Shanxi University, Taiyuan 030006, China；2. Institute of Biotechnology, Shanxi University, Taiyuan 030006, China)

An indirect enzyme-linked immunosorbent assay (IELISA) was proposed to detect specific antibodies in tartary buckwheat allergenic patients,sera using polystyrene micro-well plate coated with natural tartary buckwheat allergenic proteins and horseradish peroxidase (HRP)-labeled mouse anti-human IgE. Key operations and reaction conditions were optimized. The results showed that the optimal coating antigen concentration, positive serum dilution, HRP-labeled mouse anti-human IgE concentration, blocking time at 37 ℃, reaction time between coating antigen and antibodies in positive sera, and reaction time between positive sera and HRP-labeled mouse anti-human IgE were 100 μg/mL, 1:50, 1:1000, 40 min, 40 min and 40 min,respectively. This method proved highly specific, repeatable and sensitive.

tartary buckwheat；allergen；kit；indirect enzyme-linked immunosorbent assay (IELISA)

R392.11

B

1002-6630(2011)20-0327-04

2010-12-27

山西省科技攻關項目(20100321101)；太原市技術創(chuàng)新計劃項目(2010-09)

張昕(1981—)，女，副教授，博士，主要從事環(huán)境科學與免疫學研究。E-mail：xinzhang0051@sxu.edu.cn