林建原，陶志華，朱釤汕

(浙江萬里學院生物與環(huán)境學院，浙江 寧波 315100)

楊梅葉中總黃酮提取工藝及其抗氧化活性研究

林建原，陶志華，朱釤汕

(浙江萬里學院生物與環(huán)境學院，浙江 寧波 315100)

采用用正交試驗優(yōu)化楊梅葉中總黃酮的最佳提取工藝條件。以楊梅葉為原料，在乙醇體積分數(shù)65%、料液比1:30(g/mL)、提取時間1.5h、提取次數(shù)3次條件下，總黃酮提取率為3.34%。測定楊梅葉中總黃酮的體外抗氧化活性活性，結(jié)果表明：楊梅葉總黃酮對羥自由基、超氧陰離子自由基均有較強的清除作用，是一種天然有效的抗氧化劑。

楊梅葉；總黃酮；提取工藝；抗氧化活性

楊梅葉屬楊梅科常綠喬木楊梅(Myrica rubraSieb. et Zucc.)的干燥葉片[1]，其中含有的酚類化合物、萜類內(nèi)酯和生物堿等具有較強的抑菌殺菌作用，有很高的藥用價值。主要活性成分之一酚類化合物含有的黃酮類化合物具有清除體內(nèi)活性氧自由基，防止生物膜脂質(zhì)被超氧自由基和羥自由基氧化的功能，具有降血壓、抗炎、抑菌、抗氧化活性等多種功效[2-4]。為有效利用楊梅葉中的黃酮類物質(zhì)，本實驗采用回流提取方法，通過正交試驗確定楊梅葉總黃酮的最佳提取工藝條件[5]，并對其抗氧化能力進行研究，為楊梅葉的開發(fā)利用提供科學依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

楊梅葉：采集于浙江寧波慈溪，60℃烘干，粉碎后過80目篩備用。

蘆丁標準樣品 中國藥集團化學試劑有限公司；石油醚、乙醇、亞硝酸鈉、硝酸鋁、氫氧化鈉、鄰苯三酚、鐵氰化鉀、硫酸亞鐵、三氯乙酸、碳酸氫鈉、鹽酸、三氨基甲烷、磷酸氫二鈉、水楊酸、雙氧水、三氯化鐵等均為分析純；實驗用水均為雙蒸水。

1.2 儀器與設(shè)備

BS224型電子天平 北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司；HH-2型數(shù)顯恒溫水浴鍋 常州國華電器有限公司；S53型紫外-可見分光光度計 上海凌光技術(shù)有限公司；RE252型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 上海青浦滬西儀器廠。

1.3 方法

1.3.1 標準工作曲線的繪制

準確稱取干燥至質(zhì)量恒定的蘆丁標準品20.00mg，置于100mL容量瓶中，加入甲醇溶解，定容，制得質(zhì)量濃度0.2mg/mL的標準品儲備液，分別準確吸取0.00、0.20、0.40、0.60、0.80、1.00mL于10.00mL具塞試管中，加入5%氯化鋁3mL加甲醇定容，混勻，即得供試品溶液，同時做試劑為空白，在270nm波長處測定吸光度。以吸光度為縱坐標，質(zhì)量濃度為橫坐標，繪制標準曲線。用最小二乘法進行線性回歸，得回歸方程式：y＝36.4x－0.0298，相關(guān)系數(shù)為0.9997，線性范圍為0.004～0.02mg/mL。

1.3.2 黃酮化合物的提取工藝

原料→烘干→粉碎→石油醚除雜→去除濾液→乙醇回流→濃縮→蒸餾水溶解(pH4以下)→離心沉淀→總黃酮。

式中：C為由標準曲線計算得出的樣品質(zhì)量濃度/(mg/mL)；V為樣品溶液的體積/mL；L為樣品的總稀釋倍數(shù)；m為樣品的質(zhì)量/mg。

1.3.3 正交試驗

固定水浴溫度86℃條件下[5]，對提取次數(shù)、處理時間、乙醇體積分數(shù)和料液比4個影響提取黃酮總含量的因素進行考察[6]，對該因素進行單因素試驗，比較各因素水平間提取率的差異。根據(jù)單因素試驗結(jié)果，選擇主要影響楊梅葉總黃酮提取效果的水平做正交試驗，對結(jié)果進行極差分析，確定最佳提取工藝條件。

1.3.4 黃酮的還原力試驗

取5支10mL容量瓶，分別加入不同質(zhì)量濃度楊梅葉提取液，再加入2.50mL(pH6.6) 0.2mol/L磷酸緩沖液及2.50mL含1%鐵氰化鉀溶液，50℃水浴20min后急速冷卻，加入含2.5mL 10%三氯乙酸水溶液，于3000r/min離心10min，取上清液5.00mL，加蒸餾水4.0mL及1.0mL含0.1%三氯化鐵溶液，混勻，10min后在700nm處測定吸光度[7]。吸光度越大，則說明還原能力越強。

1.3.5清除超氧陰離子自由基(O2－·)作用試驗

[8]進行。取5支10mL具塞試管，各加入2.00mL pH8.20的Tris-HCl溶液，分別加入2.50mL不同質(zhì)量濃度楊梅葉提取的黃酮溶液，混勻，加入1.00mL 0.2mmo1/L鄰苯三酚溶液，加水定容至刻度，以時間模式記錄45min內(nèi)每隔30s吸光度的變化，并計算提取物對超氧陰離子自由基的抑制率。

式中：ΔA1/Δt為鄰苯三酚自氧化速率；ΔA2/Δt為加入提取物以后鄰苯三酚自氧化速率。

1.3.6 清除羥自由基(·OH)作用試驗

式中：E(·OH)為羥自由基的清除率/%；Ai為楊梅黃酮反應的吸光度；A0為空白吸光度；Aj為無水楊酸參加反應時楊梅黃酮的吸光度。

2 結(jié)果與分析

2.1 楊梅葉中黃酮的定性試驗

取一定量樣品溶液，滴加1%氫氧化鈉溶液，溶液出現(xiàn)橘黃色。取樣品溶液，滴加1%硼氫化鈉溶液，溶液變?yōu)樗{紫色。取樣品溶液，點于濾紙上，滴加1%三氯化鋁乙醇溶液，吹干，在可見光下呈灰黃色。取樣品溶液，滴加1%三氯化鐵溶液，溶液產(chǎn)生墨綠色沉淀。取乙醇提取液1mL于試管中，加鎂粉，再加入濃鹽酸數(shù)滴(1次加入)，在泡沫處呈紫紅色。綜合顏色反應結(jié)果，楊梅葉提取物中含有黃酮類化合物，其中可能含黃酮醇、雙氫黃酮[12-13]。

2.2 單因素及正交試驗

2.2.1 乙醇體積分數(shù)對楊梅葉總黃酮提取率的影響

圖1 乙醇體積分數(shù)對楊梅葉總黃酮提取率的影響Fig.1 Effect of ethanol concentration on extraction efficiency of total flavonoids from bayberry leaves

在5.000g樣品中，按料液比1:30分別加入體積分數(shù)55%、65%、75%、85%、95%的乙醇，在水浴鍋中86℃條件下回流提取1.5h(2次)，真空抽濾，減壓濃縮，用蒸餾水溶解(pH＜4)，離心，測其吸光度，分別計算出黃酮的得率為2.21%、2.67%、3.17%、2.7%、1.74%。由圖1可知，黃酮得率開始隨乙醇體積分數(shù)的增大而增加，當體積分數(shù)達到75%時，總黃酮得率最大；當乙醇體積分數(shù)再增加時，得率又開始下降，并且脂溶性的物質(zhì)溶出增多，尤其是葉綠素幾乎完全溶出，給提純?nèi)ルs帶來較大的麻煩。從成本和提取率來考慮，乙醇體積分數(shù)最好控制在65%～85%為好。

2.2.2 料液比對楊梅葉總黃酮提取率的影響

圖2 料液比對楊梅葉總黃酮提取率的影響Fig.2 Effect of solid-to-liquid ratio on extraction efficiency of total flavonoids from bayberry leaves

分別按1:20、1:25、1:30、1:35的料液比加入75%的乙醇，其他條件同2.2.1節(jié)，結(jié)果見圖2。由圖2可知，隨料液比減小，黃酮得率增加較快，當料液比小于1:35后，黃酮得率趨于恒定。從提取效果和減少溶劑用量等方面綜合考慮，用量應不宜過大，故將料液比定在1:25～1:35。

正因如此，在2002年光大銀行推出中國第一個理財產(chǎn)品之后，個人理財產(chǎn)品逐步成為了個人投資者主要的投資方式并得到了快速發(fā)展：2007年，只有不到50家銀行發(fā)售理財產(chǎn)品，而2017年，這一數(shù)字已經(jīng)擴大了10倍多，達到了572家；2007年個人理財產(chǎn)品種類只有1500種，而2017年，市場上存在25.77萬種個人理財產(chǎn)品，十年間種類擴大了171.8倍；2007年，個人理財產(chǎn)品募集到的資金有9000億元，而2017年募集到的資金擴大了進193倍，達到了173.59萬億元。

2.2.3 提取時間對楊梅葉總黃酮提取率的影響

圖3 提取時間對楊梅葉總黃酮提取率的影響Fig.3 Effect of extraction time on extraction efficiency of total flavonoids from bayberry leaves

在料液比為1:30條件下，回流提取0.5、1、1.5、2.0、2.5h，其他條件同2.2.2節(jié)，結(jié)果見圖3。由圖3可知，黃酮收率隨著回流作用時間的延長先增加后減少。當作用時間為0.5～2h時，黃酮的收率增加較快，當作用時間為2h時，黃酮收率最大，但此時與1.5h相比，僅略微增加；2 h后，隨著作用時間的延長，黃酮的收率不但沒增加反而下降，這可能是由于回流熱效應，長時間的作用會破壞黃酮，在后處理過程中損失增大而影響黃酮的提取率，造成負面影響。從成本等各方面考慮，提取時間控制在1～2h為宜。

2.2.4 提取次數(shù)對楊梅葉總黃酮提取率的影響

圖4 提取次數(shù)對楊梅葉總黃酮提取率的影響Fig.4 Effect of number of repeated extractions on extraction efficiency of total flavonoids from bayberry leaves

在料液比為1:25條件下，在水浴鍋中86℃回流1次、2次、3次、4次、5次，每次為1.5 h，其他條件同2.2.3節(jié)，結(jié)果見圖4。由圖4可知，黃酮收率隨著提取次數(shù)增加而增加。當提取次數(shù)1～3次，黃酮的收率增加較快，隨著次數(shù)的增多，黃酮的收率增加幅度很小。一方面其中的活性成分會受到破壞，雜質(zhì)的溶出量增加，給后續(xù)操作帶來不便，成本費用增加；另一方面也會造成溶劑的損失。從成本等各方面考慮，提取次數(shù)為2～3次時最佳。

2.2.5 正交試驗設(shè)計及結(jié)果

在單因素試驗的基礎(chǔ)上，選擇對楊梅葉總黃酮提取影響較大的乙醇體積分數(shù)、料液比、提取時間、提取次數(shù)4個因素進行正交試驗，選擇L9(34)正交表，繪制因素水平表，結(jié)果見表1。

表1 楊梅葉總黃酮提取正交試驗設(shè)計及結(jié)果Table 1 Factors and their coded levels in orthogonal array design

以總黃酮提取率作為考察指標，分析試驗結(jié)果可知，各因素影響程度大小依次為A(乙醇體積分數(shù))＞C(提取時間)＞D(提取次數(shù))＞B(料液比)。回流提取總黃酮的最佳提取條件為A1B3C2D3，即乙醇體積分數(shù)65%、料液比1:30(g/mL)、提取時間1.5h、提取次數(shù)3次。

2.3 楊梅葉總黃酮樣品穩(wěn)定性考察試驗

將同一楊梅葉總黃酮樣品溶液平行配制9份，在室溫條件下避免陽光直射，每隔30min測定1次吸光度。結(jié)果表明樣品在4h內(nèi)，吸光度基本保持不變。

2.4 黃酮還原力作用

以不加黃酮溶液的對照組為試劑空白，得到黃酮質(zhì)量濃度(x)與吸光度(y)的線性回歸方程為：y＝0.111x＋0.0347，相關(guān)系數(shù)為0.9985。

圖5 黃酮的還原力Fig.5 Reducing power of total flavonoids from bayberry leaves

由圖5可知，隨著黃酮質(zhì)量濃度的增大，還原力逐漸增強。當質(zhì)量濃度為13.58μg/mL時，黃酮吸光度為0.192，當質(zhì)量濃度為74.85μg/mL時，黃酮吸光度為0.877。證明，楊梅葉中黃酮是良好的電子供應者，具有較強的還原能力。

2.5 清除超氧陰離子自由基(O2－·)作用

圖6 黃酮對超氧陰離子自由基的清除作用Fig.6 Superoxide anion radical scavenging effect of total flavonoids from bayberry leaves

由圖6可知，隨著樣品黃酮質(zhì)量濃度的增加，對鄰苯三酚自氧化速率的抑制作用越明顯。當質(zhì)量濃度為13.97μg/mL時，黃酮對超氧陰離子自由基的清除作用為27.71%。當質(zhì)量濃度為96.91μg/mL時，對超氧陰離子自由基的清除作用為49.42%。證明楊梅葉有較強的清除超氧陰離子自由基活性。黃酮質(zhì)量濃度(x)與抑制率(y)關(guān)系的回歸方程為：y＝－0.001x2＋0.3786x＋22.48，相關(guān)系數(shù)為0.9992。

2.6 清除羥自由基(·OH)的作用

圖7 黃酮對羥自由基的清除作用Fig.7 Hydroxyl radical scavenging effect of total flavonoids from bayberry leaves

由圖7可知，對羥自由基的清除作用，黃酮質(zhì)量濃度(x)與抑制率(y)關(guān)系的回歸方程為：y=－0.0365x2＋2.5927x＋0.2905，相關(guān)系數(shù)為0.9950。

隨著黃酮質(zhì)量濃度增加，對羥自由基的清除作用逐漸加強。當黃酮質(zhì)量濃度6.25μg/mL時，對羥自由基的清除率為15.6%。當質(zhì)量濃度19.25μg/mL時，對羥自由基的清除率為36.4%。

3 結(jié) 論

3.1 回流法是一種有效提取楊梅葉總黃酮的方法，本實驗所得最佳工藝條件為乙醇體積分數(shù)65%、料液比1:30(g/mL)、提取時間1.5h、提取3次，在該條件下，總黃酮提取率為3.34%。

3.2 抗氧化性試驗表明，楊梅葉總黃酮具有較好的還原性以及清除羥自由基、清除超氧陰離子自由基的能力，而且在一定質(zhì)量濃度范圍內(nèi)呈線性關(guān)系。

3.3 楊梅葉資源豐富，其有效成分和藥理作用的研究已經(jīng)引起廣泛關(guān)注。本研究結(jié)果對于促進楊梅葉資源利用有一定的參考價值。

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Extraction and Antioxidant Activity Evaluation of Total Flavonoids from Bayberry(Myrica rubraSieb. et Zucc.) Leaves

LIN Jian-yuan，TAO Zhi-hua，ZHU Shan-shan
(College of Biomedical and Environmental Science, Zhejiang Wanli University, Ningbo 315100, China)

An L9 (34) orthogonal array design was employed to optimize the extraction of total flavonoids from bayberry (Myrica rubraSieb. et Zucc.) leaves. Thein vitroantioxidant activity of total flavonoids extracted was evaluated by determining their scavenging capacity against hydroxyl radicals and superoxide anions. The optimum extraction conditions were determined as follows: 65% aqueous ethanol solution as extraction solvent at a material/liquid ratio of 1:30 (g/mL) for triple repeated extractions for 1.5 h each time and the extraction rate is 3.34%. Total flavonoids from bayberry leaves could strongly scavenge hydroxyl and superoxide anion free radicals, thus being a powerful natural antioxidant.

bayberry leaves；total flavonoids；extraction conditions；antioxidant activity

O657.39

A

1002-6630(2011)20-0026-04

2011-03-14

浙江省自然科學基金項目(Y2110865)

林建原(1965—)，女，副教授，碩士，研究方向為天然產(chǎn)物的提取及分析。E-mail：linjianyuan@yahoo.com.cn