蒲小平，楊海麟，周楠迪*

(江南大學生物工程學院，工業(yè)生物技術(shù)教育部重點實驗室，江蘇 無錫 214122)

基于生物條形碼探針和金納米顆粒的大腸桿菌O157:H7檢測

蒲小平，楊海麟，周楠迪*

(江南大學生物工程學院，工業(yè)生物技術(shù)教育部重點實驗室，江蘇 無錫 214122)

建立一種基于生物條形碼探針和金納米顆粒(gold nanoparticles，AuNPs)對致病性大腸桿菌O157:H7檢測的新方法。用生物功能化的磁性納米顆粒(magnetic nanoparticles，MNPs)和AuNPs與目標物大腸桿菌O157:H7進行免疫反應，形成MNPs/目標物/AuNPs“三明治”式復合體。利用去雜交將AuNPs上標記的條形碼DNA釋放出來，通過DNA探針雜交條形碼DNA引起AuNPs顏色變化來確定大腸桿菌O157:H7的存在，這種顏色變化很容易用裸眼觀察到并且可以通過紫外-可見吸收光譜定量分析，該方法在純樣品和牛奶中最低檢測限為102CFU/mL，檢測范圍為102～106CFU/mL。應用基于生物條形碼探針和AuNPs對大腸桿菌O157:H7檢測具有準確、快速、操作簡單的優(yōu)點，為食品安全監(jiān)測提供了新的方法。

磁性納米顆粒；金納米顆粒；生物條形碼；紫外-可見分光光度法；大腸桿菌O157:H7

大腸桿菌O157:H7(E. coli O157:H7)是腸出血性大腸桿菌的一個主要菌型，自1982年在美國首次被分離并確認為食物中毒新型致病菌以來[1]，此菌在世界范圍內(nèi)發(fā)生過多次暴發(fā)，并造成嚴重危害。食用被該菌污染的食物可導致人類腹瀉、出血性腸炎，并可繼發(fā)溶血性尿毒綜合征(haemolytic uraemic syndrome，HUS)、血栓性血小板減少性紫癜(thrombotic thrombocytopenic purpura，TTP)等嚴重的并發(fā)癥[2]。因此，該菌引起了各國食品安全管理機構(gòu)的高度關注。目前，食品中大腸桿菌O157:H7的檢測主要依靠常規(guī)的細菌學培養(yǎng)方法、PCR、ELISA，但這些方法存在操作繁瑣，檢測周期長，并且受樣品復雜成分的影響等弊端，極大地限制了在食品行業(yè)中對該菌污染的有效監(jiān)控[3-5]。因此，建立一種簡單、快速、準確、靈敏的檢測方法十分必要。

生物功能化的磁性納米顆粒(magnetic nanoparticles，MNPs)能夠利用MNPs表面抗體特異性吸附需檢測的致病菌，并利用磁場對致病菌進行富集，從而可以實現(xiàn)對致病菌的快速分離[6-8]。另外，生物條形碼檢測(bio-bar codes assay，BCA)可實現(xiàn)對檢測物的間接放大，被廣泛應用于對DNA[9]和蛋白質(zhì)[10-12]的高靈敏檢測。然而，目前的生物條形碼檢測需要對條形碼DNA進行PCR擴增，對擴增后的條形碼進行電泳或者芯片檢測，因此檢測依賴昂貴的設備，限制了該方法在實際中的應用。金納米顆粒(gold nanoparticles，AuNPs)由于易于制備和修飾，具有獨特的理化性質(zhì)和優(yōu)良的生物相容性而成為生物診斷中最熱門的材料，因此被廣泛使用[13-14]。Mirkin等[15]報道了巰基修飾的單鏈DNA標記的AuNPs在DNA的交聯(lián)作用下發(fā)生聚集現(xiàn)象，AuNPs的聚集很容易直接觀察到并且可以用紫外-可見吸收光譜、透射式電鏡等進行表征，這一原理報道以來已被應用于對生物分子的檢測[16-17]。

本研究以大腸桿菌O157:H7為檢測對象，通過制備生物功能化的MNPs和AuNPs，利用條形碼DNA識別互補序列和AuNPs的凝聚變色效應，設計一種新型的對大腸桿菌O157:H7檢測方法。如圖1所示，當大腸桿菌O157:H7存在時，形成MNPs/目標物/AuNPs“三明治”式復合體，利用磁場將其從溶液中分離出來，利用去雜交將AuNPs上標記的條形碼DNA釋放出來，條形碼DNA作為AuNPs之間的橋梁，會引起AuNPs聚集，聚集引起的顏色變化很容易用裸眼觀察到并且可以通過紫外-可見吸收光譜定量分析，從而建立一種簡單、快速、準確、靈敏的基于生物條形碼探針和AuNPs的檢測方法。

圖1 基于生物條形碼探針和AuNPs的大腸桿菌O157:H7檢測方法Fig.1 Detection of E. coli O157:H7 based on bio-bar codes probes and AuNPs.

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

鮮牛奶 伊利集團。

氯金酸(HAuCl4) 上海久岳化工有限責任公司；大腸桿菌O157:H7單克隆抗體和多克隆抗體 寧波良瑞生物技術(shù)公司；牛血清蛋白(BSA) 上海麗珠東風生物技術(shù)有限公司；DNA由上海賽百盛基因技術(shù)有限公司人工合成，烷基硫醇修飾的條形碼D N A捕捉鏈：5'-CATCTACACTCTTCACATCGAGAGTTGCAACTGTCTGAGTA10-(CH2)3-SH-3'，條形碼DNA鏈：5'-ACTCAGACAGTT GCAACTCTCGATGTGAAGAGTGTAGATG-3'， A探針鏈：5'-AGAGTTGCAACTGTCTGAGT-A10-SH-3'，B探針鏈：5'-SH-A10-CATCTACACTCTTCACATCG-3'。其他化學試劑均為分析純；實驗用水為滅菌超純水。

1.2 菌株

大腸桿菌O157:H7、O111、沙門氏菌、枯草芽孢桿菌由本實驗室保存，并通過生化試驗和血清學方法鑒定；大腸桿菌O86(CVCC 3368) 國家獸醫(yī)微生物保藏中心。

1.3 儀器與設備

UV-3000紫外分光光度計、透射電子顯微鏡 日本Hitachi有限公司。

1.4 方法

1.4.1 生物功能化的金納米顆粒制備

通過氯金酸還原檸檬酸三鈉制備AuNPs[18-19]，并通過紫外-可見吸收光譜以及TEM表征。取1mL 10nmol/L AuNPs溶液，用K2CO3調(diào)pH值至9，加入10μg大腸桿菌 O157:H7多克隆抗體。20min后，將多克隆抗體修飾的納米顆粒與烷基硫醇修飾的條形碼DNA捕捉鏈(終濃度為2μmol/L)反應12h，然后在0.1mol/L NaCl溶液、0.01mol/L PBS(pH7.0)中鹽穩(wěn)定。接著，該溶液用1mL 10g/100mL BSA溶液處理20 min以鈍化和穩(wěn)定AuNPs。最終溶液在4℃條件14000r/min離心25min，去掉上清液，重復操作2次。然后將大腸桿菌O157: H7特異性的條形碼DNA鏈(終濃度為3μmol/L)與連接到納米顆粒上的條形碼DNA捕捉鏈雜交并使用相同的離心方法純化。

1.4.2 生物功能化的磁性Fe3O4納米顆粒的制備

1.4.2.1 磁性Fe3O4納米顆粒的合成和表面修飾

按照Chang等[20]方法制備MNPs，并用TEM鑒定粒徑。MNPs表面的修飾是采用3-氨丙基三乙氧基硅烷(A P T E S)，通過硅烷化反應以化學鍵的方式結(jié)合MNPs，獲得表面氨基化的MNPs，具體步驟是取3g制得的MN Ps溶于90 mL蒸餾水中，為了更好的分散MNPs，需將該溶液進一步超聲30min，然后轉(zhuǎn)入到三頸燒瓶中氬氣保護，大約滴加10mL APTES到以上混合溶液中，繼而在120℃攪拌反應3h，反應結(jié)束后，產(chǎn)物通過磁分離，用去離子水洗滌3次，70℃真空干燥過夜得到氨基化修飾的磁性MNPs。

1.4.2.2 磁性Fe3O4納米顆粒表面氨基的活化和抗體偶聯(lián)

稱取經(jīng)氨基修飾過的MNPs 10mg重懸于0.5mL濃度為0.1mol/L PBS(pH7.4)中并超聲5min，然后加入1.5mL的體積分數(shù)8%的戊二醛溶液(該溶液由25%戊二醛與PBS配制而成)，室溫振蕩反應7h(反應避光，以避免戊二醛自身發(fā)生聚合)。磁性分離，用PBS清洗納米顆粒3～5遍，重新懸于5mL PBS溶液中，即生成活化的MNPs。取1mL活化的MNPs，加入大腸桿菌O157:H7單克隆抗體0.5mg，室溫攪拌反應4h，磁性分離，吸取上清至另一試管中；用PBS洗滌3～5遍，以去除未結(jié)合的游離抗體，回收洗滌液，并把它與上述反應后的上清液進行匯合，備測蛋白濃度。向偶聯(lián)后的MNPs加過量1g/100mL BSA溶液，室溫反應2h，以封閉未結(jié)合抗體的游離醛基，即制備出生物功能化的MNPs，以紫外-可見吸收光譜比較抗體與MNPs偶聯(lián)前后在280nm波長處的吸光度測定偶聯(lián)效率。

1.4.3 探針修飾的金納米顆粒的制備

按照Mirkin等[21]所述方法稍加改進。82.5μg巰基修飾的A和B探針鏈分別溶解于100μL去離子水，然后加入到900μL 17nmol/L AuNPs溶液中，使A、B探針的終濃度達到3.70μmol/L，室溫放置16h，加入含0.1mol/L NaCl的0.01mol/L PBS(pH7.0)，在13000r/min轉(zhuǎn)速下離心20min，棄上清液，向油狀沉淀中加入0.1mol/L NaCl溶液、0.01mol/L PBS重懸紅色油狀沉淀，在13000r/min轉(zhuǎn)速下離心20min，移去上層清液，加1mL 0.3mol/L NaCl、0.01mol/L PBS(pH7.0)重懸沉淀，置4℃儲存?zhèn)溆谩?/p>

1.4.4 大腸桿菌O157:H7樣品的制備

將大腸桿菌O157:H7接種到LB液體培養(yǎng)基中，37℃過夜培養(yǎng)進行增菌。接著將增菌液分裝于兩個離心管，在25℃條件5800r/min離心分離10min。用PBS清新3次，加PBS(pH7.4)重新懸浮沉淀。然后測定在600nm波長處的吸光度，估計其菌數(shù)，然后按10倍梯度稀釋，并在山梨醇-麥康凱瓊脂培養(yǎng)基上進行平板菌落計數(shù)確認，重復3次，取平均值確定其菌液菌落數(shù)。

1.4.5 基于生物條形碼探針和金納米顆粒檢測方法的建立

將50μL功能化的MNPs(5mg/mL)加入到200μL不同濃度的大腸桿菌O157:H7溶液中，于37℃振蕩25min；加入磁場固定MNPs，用PB S溶液反復沖洗；加入10nmol/L功能化的AuNPs 50μL，于37℃劇烈振蕩30min，形成MNPs/目標物/AuNPs“三明治”式復合體；加上磁場分離“三明治”式復合體；用1 0 0μL PBS溶液反復沖洗4次，除去未連接的AuNPs；加入5 0μL超純水到”三明治“結(jié)構(gòu)中，6 0℃劇烈振蕩30min，使條形碼DNA去雜交?！比髦巍皬秃衔锉淮判苑蛛x，收集上清液，內(nèi)含條形碼DNA，用探針修飾的AuNPs進行檢測。

取上述條形碼DNA溶液50μL，向其中加入探針(A和B)修飾的AuNPs各100μL，混勻后95℃變性5min，55℃雜交2h后觀察顏色變化和紫外-可見吸收光譜定量分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 生物功能化的金納米顆粒表征

按照實驗方法制備的AuNPs的紫外-可見吸收光譜，其最大吸收波長為520nm(圖2a)，TEM觀察AuNPs平均粒徑為13nm，大小均勻，分散性良好?？贵w修飾到AuNPs表面后，相比未修飾的AuNPs的紫外-可見吸收峰有4nm的紅移(圖2b)。而抗體和條形碼DNA共同修飾的AuNPs的紫外-可見吸收峰在527nm，紅移3nm (圖2c)，按照熒光測定方法[22]測定AuNPs表面連接DNA的數(shù)量大約為100。

圖2 未修飾AuNPs (a)、抗體修飾AuNPs (b)、抗體和DNA雙修飾AuNPs (c)的紫外可見吸收光譜圖Fig.2 UV-visible spectra of un-modified AuNPs (curve a), antibodymodified AuNPs (curve b), and antibody and DNA modified AuNPs (curve c)

2.2 生物功能化磁性Fe3O4納米顆粒表面抗體偶聯(lián)效率測定

按照實驗方法制備的MNPs平均粒徑為(27±4)nm，通過紫外-可見吸收光譜比較抗體與MNPs偶聯(lián)前后在280nm波長處的吸光度測定抗體偶聯(lián)效率為83.85%。

2.3 大腸桿菌O157:H7標準樣品檢測結(jié)果

利用基于生物條形碼探針和AuNPs的方法檢測大腸桿菌O157:H7，當目標微生物大腸桿菌O157:H7存在時(105CFU/mL)，AuNPs標記的條形碼DNA釋放出來，識別帶有互補序列的探針修飾的AuNPs，并使AuNPs相互交聯(lián)，形成網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的超分子聚集體，體系顏色由紅色變?yōu)樽仙蛘咚{色，在525nm波長處吸收顯著降低；相反，當目標微生物不存在時，無條形碼DNA釋放出來，AuNPs不會發(fā)生聚集，體系顏色保持紅色不變，在525nm波長處最大吸收峰無變化(圖3)，所以根據(jù)探針修飾AuNPs聚集顏色的變化可以檢測大腸桿菌O157:H7。

圖3 大腸桿菌O157:H7的檢測結(jié)果Fig.3 Detection of E. coli O157:H7

利用基于生物條形碼探針和AuNPs的方法對不同濃度的大腸桿菌O157:H7進行檢測，不含菌的試樣液為空白對照，觀察體系顏色變化和測定在520nm波長處的吸光度。結(jié)果顯示當菌落數(shù)低于102CFU/mL時，體系的顏色無明顯變化，隨著大腸桿菌O157:H7菌落數(shù)的遞增，體系的聚集現(xiàn)象就越明顯(圖4A)；而吸光度的檢測同樣表明菌落數(shù)低于102CFU/mL時，吸光度基本沒有明顯差異(圖4B)，此后隨著菌落數(shù)的增大，AuNPs的吸光度出現(xiàn)明顯的下降，當菌落數(shù)增加到107CFU/mL時，吸光度已無明顯變化(圖4B)。因此利用光譜法檢測大腸桿菌O157:H7，最低檢測限為102CFU/mL，檢測范圍為102～106CFU/mL。

圖4 不同菌落數(shù)的大腸桿菌O157:H7檢測結(jié)果Fig.4 Detection of E. coli O157:H7 samples with different Log numbers

用大腸桿菌O86、O111、沙門氏菌、枯草芽孢桿菌進行特異性實驗，方法同檢測大腸桿菌O157:H7，只是培養(yǎng)基改為適合被檢測菌生長的培養(yǎng)基，菌落數(shù)為105CFU/mL。AuNPs聚集和吸光度測定結(jié)果(圖5)表明除大腸桿菌O157:H7出現(xiàn)很好的陽性結(jié)果外，其他細菌檢測均呈陰性。因此，基于生物條形碼探針和AuNPs的方法對大腸桿菌O157:H7檢測具有很好的特異性。

圖5 大腸桿菌O157:H7特異性檢測結(jié)果Fig.5 Specificity of detection for E. coli O157:H7

2.4 對人工污染牛奶檢測結(jié)果

為了考察本方法檢測效果，制備了大腸桿菌O157: H7污染牛奶樣本，將不同菌落數(shù)的大腸桿菌O157:H7菌液人工污染到牛奶中，污染菌落數(shù)分別為10、102、103、104、105、106、107CFU/mL。檢測結(jié)果如圖6所示，表明在人工污染牛奶中能檢測到102CFU/mL的細菌，檢測范圍為102～106CFU/mL。

3 結(jié) 論

本研究制備的生物功能化的MNPs具有比表面積大的特點，當顆粒表面被微生物特異性抗體連接后，能夠快速、高效、特異性分離大腸桿菌O157:H7，而生物功能化的AuNPs攜帶有大量的生物條形碼，可對標檢目標物間接放大，利用生物條形碼與互補DNA探針液相雜交，使AuNPs聚集形成網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的超分子聚集體，體系顏色由紅色變?yōu)樽仙蛘咚{色，這種顏色變化很容易用裸眼觀察到并且可以通過紫外-可見吸收光譜進行定量分析，對純樣品和人工污染的牛奶檢測最低限為102CFU/mL，檢測范圍為102～106CFU/mL，該方法不受樣品復雜成分的影響，因此，本實驗建立的基于生物條形碼探針和AuNPs的檢測方法具有簡便、快速、準確、可靠等優(yōu)點，為食源性病原微生物的鑒定和診斷提供了一種新方法。與其他病原微生物檢測技術(shù)相比，該技術(shù)具有非常顯著的特點，首先可以針對不同的病原微生物設計不同長度和序列的條形碼DNA，可同時對食品中的多種病原微生物進行分析；其次檢測范圍廣，只要能夠獲得被檢物的單抗和多抗，就可對其進行檢測，這使得該技術(shù)在檢測一些不適宜用PCR技術(shù)檢測的病原微生物時具有很大的優(yōu)勢；再次是結(jié)果準確、易于判讀，根據(jù)AuNPs的顏色變化，利用裸眼和紫外-可見吸收光譜就可以進行定性定量分析。該技術(shù)也存在一定的缺點，如其特異性取決于檢測系統(tǒng)使用的單克隆抗體的特異性，而目前商品化的單克隆抗體費用相對較高，會影響該技術(shù)在實際檢測中的應用?？傮w而言，利用該方法有望制備出檢測試劑盒產(chǎn)品，在食源性病原微生物檢測中推廣使用，但為了實現(xiàn)這個目標還有很多工作要做。

[1] RILEY L W, REMIS R S, HELGERSON S D, et al. Hemorrhagic colitis associated with a rare Escherichia coli serotype[J]. New Engl J Med, 1983, 308(12): 681-685.

[2] CHENG Yuxiao, LIU Yajun, HUANG Jingjing, et al. Combining biofunctional magnetic nanoparticles and ATP bioluminescence for rapid detection of Escherichia coli[J]. Talanta, 2009, 77(4): 1332-1336.

[3] DEISINGH A K, THOMPSON M. Strategies for the detection of Escherichia coli O157:H7 in foods[J]. J Appl Microbiol, 2004, 96(3): 419-429.

[4] WANG Gehua, CLARK C G, RODGERS F G. Detection in Escherichia coli of the genes encoding the major virulence factors, the genes defining the O157:H7 serotype, and components of the type 2 shiga toxin family by multiplex PCR[J]. J Clin Microbiol, 2002, 40(10): 3613-3619.

[5] NYQUIST-BATTIE C, FREEMAN L, LECKBAND K, et al. Antibody-based detection of Escherichia coli O157:H7 and Salmonella enterica serovar typhimurium grown in low-shear modeled micirogravity [J]. Microgravity Sci Tec, 2008, 20(1): 23-28.

[6] FU Z, ROGELJ S, KIEFT T L. Rapid detection of Escherichia coli O157:H7 by immunomagnetic separation and real-time PCR[J]. Int J Food Microbiol, 2005, 99(1): 47-57.

[7] VARSHNEY M, YANG L J, SU X L, et al. Magnetic nanoparticleantibody conjugates for the separation of Escherichia coli O157:H7 in ground beef[J]. J Food Prot, 2005, 68(9): 1804-1811.

[8] XU Chenjie, SUN Shouheng. Monodisperse magnetic nanoparticles for biomedical applications[J]. Polym Int, 2007, 56(7): 821-826.

[9] NAM J M, STOEVA S I, MIRKIN C A. Bio-bar-code-based DNA detection with PCR-like sensitivity[J]. J Am Chem Soc, 2004, 126(19): 5932-5933.

[10] NAM J M, THAXTON C S, MIRKIN C A. Nanoparticle-based bio-bar codes for the ultrasensitive detection of proteins[J]. Science, 2003, 301: 1884-1886.

[11] KEATING C D. Nanoscience enables ultrasensitive detection of alzheimer's biomarker[J]. Proc Natl Acad Sci USA, 2005, 102(7): 2263-2264.

[12] ZHANG Hongquan, ZHAO Qiang, LI Xingfang, et al. Ultrasensitive assays for proteins[J]. Analyst, 2007, 132(8): 724-737.

[13] PAVLOV V, XIAO Y, SHLYAHOVSKY B, et al. Aptamer-functionalized Au nanoparticles for the amplified optical detection of thrombin[J]. J Am Chem Soc, 2004, 126(38): 11768-11769.

[14] WANG Jianbin, PROFITT J A, PUGIA M J, et al. Au nanoparticle conjugation for impedance and capacitance signal amplification in biosensors[J]. Anal Chem, 2006, 78(6): 1769-1773.

[15] MIRKIN C A, LETSINGER R L, MUCIC R C, et al. A DNA-based method for rationally assembling nanoparticles into macroscopic materials [J]. Nature, 1996, 382: 607-609.

[16] ZHAO Wenan, BROOK M A, LI Yingfu. Design of gold nanoparticlebased colorimetric biosensing assays[J]. Chembiochem, 2008, 9(15): 2363-2371.

[17] SOO P C, HORNG Y T, CHANG K C, et al. A simple gold nanoparticle probes assay for identification of Mycobacterium tuberculosis and Mycobacterium tuberculosis complex from clinical specimens[J]. Mol Cell Probe, 2009, 23(5): 240-246.

[18] FRENS G. Controlled nucleation for regulation of particle-size in monodisperse gold suspensions[J]. Nat (London) Phys Sci, 1973, 241(105): 20-22.

[19] GRABAR K C, FREEMAN R G, HOMMER M B, et al. Preparation and characterization of Au colloid monolayers[J]. Anal Chem, 1995, 67 (4): 735-743.

[20] CHANG T L, TSAI C Y, SUN C C, et al. Ultrasensitive electrical detection of protein using nanogap electrodes and nanoparticle-based DNA amplification[J]. Biosens Bioelectron, 2007, 22(12): 3139-3145.

[21] STORHOFF J J, ELGHANIAN R, MUCIC R C, et al. One-pot colorimetric differentiation of polynucleotides with single base imperfections using gold nanoparticle probes[J]. J Am Chem Soc, 1998, 120(9): 1959-1964.

[22] DEMERS L M, MIRKIN C A, MUCIC R C, et al. A fluorescence-based method for determining the surface coverage and hybridization efficiency of thiol-capped oligonucleotides bound to gold thin films and nanoparticles [J]. Anal Chem 2000, 72(22): 5535-5541.

Detection of Escherichia coli O157:H7 Based on Bio-Bar Codes Probes and Gold Nanoparticles

PU Xiao-ping，YANG Hai-lin，ZHOU Nan-di*
(Key Laboratory of Industrial Biotechnology, Ministry of Education, School of Biotechnology, Jiangnan University, Wuxi 214122, China)

A novel assay was developed for the detection of Escherichia coli O157:H7 (E. coli O157:H7) based on bio-bar DNA and gold nanoparticles (AuNPs). The immune reaction between the target and antibodies modified on biofunctionalized magnetic nanoparticles (MNPs) or AuNPs leads to the formation of a sandwich structure of MNPs/target/AuNPs, followed by dehybridization and release of bio-bar DNA. Due to its ability to hybridize with probe ssDNAs modified on AuNPs, bio-bar DNA could lead to aggregation and color change of AuNPs, which is readily visible with naked eyes, and can be quantified by UV-visible spectroscopy as well. The proposed method had a detection limit of about 102CFU/mL in both pure broth culture and milk with a detection range of 102－106CFU/mL. With the aid of bio-bar DNA and AuNPs, detection of E. coli O157: H7 in food is accurate, fast, and easy-operated, which may provide a new tool for food safety monitoring.

magnetic nanoparticles；gold nanoparticles；bio-bar codes；UV-visible spectroscopy；E. coli O157:H7

R446.5

A

1002-6630(2011)08-0177-05

2010-06-29

國家自然科學基金青年項目(20805020)；教育部科學技術(shù)研究重點項目(109079)；食品科學與技術(shù)國家重點實驗室開放課題(SKLF-KF-200809)

蒲小平(1984—)，男，碩士研究生，研究方向為食品安全及檢測。E-mail：puxiaoping2008@qq.com

*通信作者：周楠迪(1974—)，男，副教授，博士，研究方向為生物分析與檢測。E-mail：zhounandi@jiangnan.edu.cn