鄭州拓洋實(shí)業(yè)有限公司 蘇筱渲 徐 琳 吳 娜

丁香揮發(fā)油的體外抗氧化作用研究

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丁香為桃金娘科植物丁香（Eugenia caryophyllata Thun.）的干燥花蕾，是藥食兩用植物。丁香中主要含有有機(jī)酸類、苷類、揮發(fā)油類、黃酮類等有效成分，具有廣泛的生理活性。經(jīng)研究丁香揮發(fā)油的主要成分有丁香酚、石竹烯、異丁香酚、檀香醇等具有抗氧化活性成分。近年來，隨著對傳統(tǒng)合成抗氧化劑BHT，BHA，TBHQ等毒性問題的提出，天然抗氧化劑越來越受到食品飼料等行業(yè)的青睞，特別是植物源抗氧化劑，因其具有來源廣泛、提取率高、抗氧化性強(qiáng)、與機(jī)體親和力強(qiáng)和安全性高等優(yōu)點(diǎn)，使天然抗氧化劑的研究逐漸成為熱點(diǎn)。本文，筆者旨在討論丁香揮發(fā)油的抗氧化作用及其機(jī)制，為開發(fā)丁香揮發(fā)油提供參考和依據(jù)。

一、材料與儀器

采用在藥材市場購買的丁香干花蕾。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物為昆明種小鼠，清潔級(jí)，雌雄各半，體重（20±2）g，由河南省疾控中心提供。魯米諾，色譜純，Sigma公司產(chǎn)品；MDA測定試劑盒，南京建成生物工程研究所；其他均為國產(chǎn)分析純試劑。

分析天平（AE240），梅特勒公司；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，中國鞏義予華；化學(xué)發(fā)光儀（PHOTOCHEM），德國耶拿公司；超臨界萃取裝置（1L），中國南通華安公司。

二、實(shí)驗(yàn)方法

1.丁香揮發(fā)油的制備。超臨界萃取裝置CO2流量控制在15kg/h，每次進(jìn)樣量500g，在30MPa，45℃的條件下，萃取120min，所提取揮發(fā)油用乙醚溶解，加無水硫酸鈉干燥，過濾，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器除去乙醚，得淡黃色透明液體。

2.化學(xué)發(fā)光測量條件。采用BPCL型超微弱化學(xué)發(fā)光測量儀(中國科學(xué)院生物物理所)進(jìn)行測定，測試條件：Hi-V800；Kv-1；記錄的波長范圍：180~800nm；溫度：30℃。

3.丁香揮發(fā)油對超氧陰離子的清除作用檢測方法。采用鄰苯三酚一魯米諾化學(xué)發(fā)光體系。試劑配制方法：魯米諾用0.05mol/L的NaOH溶液配成lmmol/L的溶液；鄰苯三酚用lmmol/L HCL配成6.25×10。mol/L溶液；0.05mol/L pH10.2的Na2CO3·NaHCO3緩沖液（含0.1mmol/L EDTA）與1mmol/L魯米諾以2∶1（v∶v）混合成魯米諾和碳酸鹽緩沖液混合物。測定方法：向發(fā)光池中加入樣品溶液（空白對照為無水乙醇，樣品溶液用無水乙醇配制）10μL，6.25×10mol／L鄰苯三酚50μL，魯米諾和碳酸鹽緩沖液混合物940μL啟動(dòng)反應(yīng)，間隔2s記數(shù)發(fā)光強(qiáng)度，測定300s的發(fā)光強(qiáng)度，本底發(fā)光強(qiáng)度為不加鄰苯三酚時(shí)的發(fā)光值。

4.丁香揮發(fā)油對羥基自由基的清除作用檢測方法。采用CuSO4-Phen-Vc-H2O2化學(xué)發(fā)光體系，向發(fā)光池中加入樣品溶液（以無水乙醇為對照）50μL，1.0mmol/L CuSO4溶液50μL，1mmol/L鄰菲啉溶液50μL，和0.05mol/L硼砂溶液700μL（pH9.0），1mmol/L抗壞血酸溶液100μL和0.15%H2O2溶液50μL，立即啟動(dòng)化學(xué)發(fā)光系統(tǒng)，間隔3s記數(shù)，記錄400s內(nèi)化學(xué)發(fā)光動(dòng)力學(xué)曲線，本底不加雙氧水。

5.丁香揮發(fā)油對H2O2的清除作用檢測方法。采用雙氧水-魯米諾化學(xué)發(fā)光體系，向發(fā)光池中加入樣品溶液（以無水乙醇為對照）50μL，0.15mol/L H2O250μL和0.1mmol/L魯米諾-0.05mol/L pH9.4碳酸鹽緩沖液混合液（體積比為1∶17）900μL，啟動(dòng)發(fā)光系統(tǒng)，間隔3s記數(shù)，記錄120s內(nèi)發(fā)光強(qiáng)度，本底不加雙氧水。

6.丁香揮發(fā)油對體外小鼠肝勻漿生成MDA的測定方法。參照黃曉蘭，閻俊，吳曉文，等的研究，制備10%肝組織勻漿液。每支試管加10%小鼠肝勻漿0.2m l，給藥組每管分別加濃度為0.05、0.5、2.0、10.0g/L的揮發(fā)油0.1mL，對照組加等體積生理鹽水，再分別加誘導(dǎo)試液FeSO4（1mmolL）0.1mL、H2O2（1mmolL）0.1mL，37℃溫育1h（對照以等體積無水乙醇代替樣品溶液），置冰水中冷卻，再按MDA試劑盒方法操作，測定A532并計(jì)算MDA含量（nmol/mg.pr）。

7.數(shù)據(jù)處理方法。以抑制O-2·和·OH的發(fā)光強(qiáng)度一半的濃度（IC50）為標(biāo)準(zhǔn)，判斷丁香揮發(fā)油的有效性和效價(jià)；實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)表示為方差分析進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。

三、結(jié)果與討論

1.丁香揮發(fā)油和VC對超氧陰離子自由基的清除作用。本體系中鄰苯三酚在堿性條件下氧化產(chǎn)生超氧陰離子，以魯米諾為發(fā)光劑，超氧陰離子激發(fā)魯米諾，魯米諾由激發(fā)態(tài)返回到基態(tài)時(shí)產(chǎn)生化學(xué)發(fā)光?？寡趸瘎┑募尤肟汕宄蹶庪x子，從而抑制化學(xué)發(fā)光。丁香揮發(fā)油的有效半數(shù)清除濃度（IC50）為175.73mg/L，與260.42mg/L的VC的清除能力相當(dāng)，而且丁香揮發(fā)油對體系中產(chǎn)生的O-2·的抑制率與丁香揮發(fā)油的濃度呈正比例關(guān)系。丁香揮發(fā)油能有效清除超氧陰離子。如表1、圖1所示。

圖1 不同濃度的丁香揮發(fā)油抑制超氧陰離子的化學(xué)發(fā)光動(dòng)力學(xué)曲線

2.丁香揮發(fā)油和VC對·OH的清除作用。本體系中，Cu2+被Vc還原成Cu+，Cu+與H2O2在Fenton反應(yīng)中產(chǎn)生·OH，·OH氧化鄰菲啉（Phen），使Phen激發(fā)，Phen退激時(shí)產(chǎn)生化學(xué)發(fā)光?？寡趸瘎┑募尤肟汕宄H，降低化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度。丁香揮發(fā)油對·OH的清除率隨著濃度的增加而增大，量效關(guān)系非常明顯。丁香揮發(fā)油的IC50為28.39mg/L，與13.81mg/L的VC清除能力相當(dāng)。見表2。羥基自由基是已知的最強(qiáng)的氧化劑，具有極強(qiáng)的反應(yīng)性，壽命極短，在很多緩沖溶液中，只要一產(chǎn)生，就會(huì)同緩沖溶液反應(yīng)。它幾乎可以攻擊所有的鄰近細(xì)胞，同細(xì)胞中的所有成分發(fā)生反應(yīng)，對人體的危害最大。該試驗(yàn)結(jié)果表明丁香揮發(fā)油中含有抗氧化劑，能抑制羥基自由基的氧化。如圖2所示。

表2 丁香揮發(fā)油和VC清除羥基自由基

圖2 不同濃度丁香揮發(fā)油清除羥基自由基化學(xué)發(fā)光動(dòng)力學(xué)曲線

3.丁香揮發(fā)油和VC對H2O2的清除作用。本體系中，H2O2能在有O2和堿性條件下氧化魯米諾產(chǎn)生化學(xué)發(fā)光。加入一定量的抗氧化劑，清除H2O2，可抑制化學(xué)發(fā)光。丁香揮發(fā)油的IC50為0.24mg/L，VC的IC500.36mg/L，丁香揮發(fā)油的清除能力強(qiáng)于VC。見表3。表明丁香揮發(fā)油的加入，使發(fā)光峰值下降；隨濃度的增大，發(fā)光更弱。如圖3所示。

表3 丁香揮發(fā)油和VC清除H2O2

圖3 不同濃度丁香揮發(fā)油清除H202化學(xué)發(fā)光動(dòng)力學(xué)曲線圖

4.丁香揮發(fā)油對體外小鼠肝勻漿生成MDA的影響。與對照組相比較，在實(shí)驗(yàn)濃度范圍內(nèi)對自氧化、Fe2+誘導(dǎo)和H2O2誘導(dǎo)3種體系中的小鼠肝勻漿MDA的生成均有極顯著的抑制效果，并呈劑量—效應(yīng)關(guān)系。10mg/L丁香揮發(fā)油對H2O2誘導(dǎo)的MDA生成抑制率高達(dá)74.12%（表4）。說明丁香揮發(fā)油對小鼠肝組織自發(fā)性脂質(zhì)過氧化和誘導(dǎo)脂質(zhì)過氧化均有較強(qiáng)的抑制作用。

表4 丁香揮發(fā)油對Fe2+和H2O2誘導(dǎo)小鼠肝勻漿生成MDA（n=10，x±s）

四、結(jié)論

自由基學(xué)說認(rèn)為自由基能使細(xì)胞受到損害，很多疾病如老年癡呆癥、帕金森癥、肌萎縮性側(cè)索硬化癥，還有癌癥等的發(fā)生都與自由基有關(guān)。本實(shí)驗(yàn)采用體外產(chǎn)生活性氧自由基系統(tǒng)，通過對活性氧自由基的清除作用證實(shí)丁香揮發(fā)油是一種有效的自由基清除劑，對羥基自由基的清除作用更強(qiáng)。丁香揮發(fā)油可以抑制小鼠肝的脂質(zhì)過氧化，從而維持生物膜的完整性，防止生物膜的氧化損傷。丁香資源豐富，尚未得到有效的利用。近年來，有關(guān)丁香有效成分和藥理作用的研究已經(jīng)引起一定的關(guān)注，本研究的結(jié)果為促進(jìn)丁香資源進(jìn)一步開發(fā)利用提供實(shí)驗(yàn)資料。