孫 倩，陳復(fù)生，丁長(zhǎng)河，劉伯業(yè)

(河南工業(yè)大學(xué)糧油食品學(xué)院，河南鄭州 450052)

堿性蛋白酶及其在大豆肽制備中的應(yīng)用

孫 倩，陳復(fù)生*，丁長(zhǎng)河，劉伯業(yè)

(河南工業(yè)大學(xué)糧油食品學(xué)院，河南鄭州 450052)

堿性蛋白酶是一類重要的工業(yè)用酶，廣泛應(yīng)用于食品、醫(yī)藥、洗滌劑和皮革等領(lǐng)域。目前食品工業(yè)用酶主要來源于微生物，且實(shí)際生產(chǎn)中堿性蛋白酶的效果較好。從堿性蛋白酶的產(chǎn)生菌株、結(jié)構(gòu)和性質(zhì)、應(yīng)用研究現(xiàn)狀及其在大豆肽制備中的應(yīng)用等方面進(jìn)行了概述。

堿性蛋白酶，芽孢桿菌，大豆肽

堿性蛋白酶是在堿性條件下水解蛋白質(zhì)肽鍵的酶類，是一類非常重要的工業(yè)用酶，最早發(fā)現(xiàn)于豬胰臟。堿性蛋白酶廣泛存在于動(dòng)、植物及微生物中。微生物蛋白酶均為胞外酶，不僅具有動(dòng)植物蛋白酶所具有的全部特性，還有下游技術(shù)處理相對(duì)簡(jiǎn)單、價(jià)格低廉、來源廣、菌體易于培養(yǎng)、產(chǎn)量高、高產(chǎn)菌株選育簡(jiǎn)單、快速、易于實(shí)現(xiàn)工業(yè)化生產(chǎn)等諸多優(yōu)點(diǎn)［1］。1945年瑞士Dr.Jaag等在地衣芽孢桿菌中發(fā)現(xiàn)了微生物堿性蛋白酶［2］。1971年Horikoshi首先報(bào)導(dǎo)了嗜堿性微生物產(chǎn)堿性蛋白酶的研究［3］。近年來，微生物堿性蛋白酶一直為人們所關(guān)注，也是目前研究最為廣泛的酶制劑之一。

1 堿性蛋白酶的產(chǎn)生菌種

食品工業(yè)用酶主要來源于微生物，微生物來源的蛋白酶按作用pH可分為三類，即堿性蛋白酶，中性蛋白酶及酸性蛋白酶，它們的作用最適pH分別為堿性，中性及酸性。這三類酶的活性中心有著明顯的不同∶酸性蛋白酶含有兩個(gè)羧基，能為DAN(重氮乙酸正亮氨酸甲酯)失活，不受鰲合劑、巰基試劑或絲氨酸蛋白酶抑制劑的影響;中性蛋白酶的活性中心含金屬離子，常常是 Zn2+，可受到金屬螯合劑EDTA的可逆抑制;堿性蛋白酶的活性中心為絲氨酸，能被二異丙基氟磷酸及苯甲基磺酸氯所抑制。用于實(shí)際生產(chǎn)中堿性蛋白酶水解效果較好。多數(shù)微生物堿性蛋白酶在pH7～11范圍內(nèi)有活性。在以酪蛋白為底物時(shí)最適pH以9.5±0.5為多，這種酶除水解肽鍵外，還具有水解酯鍵、酰胺鍵和轉(zhuǎn)酯及轉(zhuǎn)肽能力。堿性蛋白酶可水解植物、動(dòng)物蛋白，Alcalase酶可作用于未端疏水氨基酸，使用這種酶可去除蛋白質(zhì)水解時(shí)產(chǎn)生的苦味。來源于Bamyloliguefaciers的堿性蛋白酶可用于制備低變異源性的嬰兒食品，還可用于制備果汁、飲料及治療用人工配制的高蛋白膳食。

利用微生物生產(chǎn)蛋白酶有以下優(yōu)點(diǎn)∶微生物生長(zhǎng)快，適于大量快速培養(yǎng);培養(yǎng)基成本低;可選用作為工業(yè)生產(chǎn)蛋白酶的微生物種類很多，同時(shí)又可用遺傳操作手段將其改良;微生物生產(chǎn)的蛋白酶大多數(shù)是胞外酶，易于提取。由于這些優(yōu)點(diǎn)，微生物成為生產(chǎn)堿性蛋白酶的首選材料和重要來源。產(chǎn)堿性蛋白酶的微生物在自然界分布廣泛，主要分離此類微生物的環(huán)境有深海、鹽堿湖、沙地等堿性環(huán)境。堿性蛋白酶主要產(chǎn)生菌為地衣芽孢桿菌、枯草芽孢桿菌、短小芽孢桿菌、米曲霉、棲土曲霉、灰色鏈霉菌、鐮刀菌等(表1)。目前，商業(yè)中應(yīng)用的堿性蛋白酶主要來源于芽孢桿菌(表2)，如丹麥酶制劑生產(chǎn)商N(yùn)ovoNordisk使用的生產(chǎn)菌株就包括地衣芽孢桿菌［Bacillus licheniformis］，緩慢芽孢桿菌［Bacillus lentus］，其它的堿性蛋白酶商業(yè)生產(chǎn)菌株還包括嗜堿性芽孢桿菌［Bacillus alcalophilus(Gist－Brocades，荷蘭)］和枯草桿菌［Bacillus subtilis(Solvay Enzymes，德國(guó))］等。一些革蘭氏陰性菌及真菌等也產(chǎn)生堿性蛋白酶。國(guó)內(nèi)主要有地衣芽孢桿菌2709、地衣芽孢桿菌C1213以及短小芽孢桿菌289和209［4］。

表1 常見產(chǎn)堿性蛋白酶微生物

表2 常見工業(yè)生產(chǎn)用堿性蛋白酶產(chǎn)生細(xì)菌菌株［5］

2 堿性蛋白酶的結(jié)構(gòu)和性質(zhì)

Keay按不同pH對(duì)蛋白酶作用于酪素的活性曲線，酯酶對(duì)蛋白酶活力的比值，免疫學(xué)分析中有無交叉反應(yīng)，以及蛋白酶的氨基酸組成和序列差異，將其分為兩種類型∶A型為Carlsberg型蛋白酶，B型為Novo型蛋白酶［6］。

蛋白酶是催化蛋白質(zhì)水解成α－氨基酸的酶，不同蛋白酶有不同的活性中心基團(tuán)，如絲氨酸、半胱氨酸、天門冬氨酸、Zn2+、Mn2+、Fe2+、Cu2+等。大多數(shù)微生物堿性蛋白酶的活性中心含有絲氨酸，屬于絲氨酸蛋白酶，其最適作用pH為9～11。遇到作用于絲氨酸的試劑二異丙基氟磷酸(DFP)時(shí)失活，是堿性蛋白酶的重要特征。堿性蛋白酶對(duì)金屬螯合劑EDTA、重金屬和巰基試劑不敏感，但需要有金屬離子Mn2+、Mg2+、Zn2+、Co2+、Fe2+等的啟動(dòng)。Ca2+對(duì)堿性蛋白酶有穩(wěn)定作用［7］。堿性蛋白酶對(duì)底物有高度專一性［8］，只能水解蛋白質(zhì)肽鏈，而不能水解淀粉、脂肪等其它物質(zhì)，但是有可能水解多種蛋白質(zhì)堿性蛋白酶作用位點(diǎn)，要求在水解點(diǎn)羧基側(cè)具有芳香族或疏水性氨基酸，它比中性蛋白酶水解能力更大而且還具有一定的酯酶活力。

堿性蛋白酶具有信號(hào)肽。信號(hào)肽的存在是區(qū)分胞質(zhì)蛋白和輸出蛋白的唯一顯著特征。研究發(fā)現(xiàn)，在解淀粉芽孢桿菌(B.amyloliquefaciens)、枯草芽孢桿菌 (B.subtilis)、嗜 熱 脂 肪 芽 孢 桿 菌(B.stearothermophilus)中分泌的中性蛋白酶與在解淀粉芽孢桿菌(B.amyloliqufaciens)、枯草芽孢桿菌(B.subtilis)、地衣芽孢桿菌(B.1icheniformis)中分泌的堿性蛋白酶信號(hào)肽段有同源程度很高的保守序列［9］。雷虹［10］等通過設(shè)計(jì)合適的引物，利用PCR技術(shù)從地衣芽孢桿菌2709菌株的染色體DNA中擴(kuò)增了2709堿性蛋白酶的編碼序列，分析發(fā)現(xiàn)地衣芽孢桿菌2709與NCIB6816的堿性蛋白酶的編碼序列只有3%堿基組成差異，與已發(fā)表的兩種 Substilisin Carlsberg型氨基酸序列長(zhǎng)度一致，同源性為98%～99%。洪揚(yáng)［11］等研究顯示，2709的堿性蛋白酶信號(hào)肽與導(dǎo)肽無論氨基酸序列還是 DNA序列均與NCIB6816完全一致?？梢?，不同菌株產(chǎn)生的堿性蛋白酶其翻譯加工切除信號(hào)肽和導(dǎo)肽的過程及調(diào)控機(jī)制基本一致。

3 堿性蛋白酶的研究與應(yīng)用現(xiàn)狀

3.1 國(guó)外研究與應(yīng)用現(xiàn)狀

蛋白酶是工業(yè)用酶中占據(jù)比例最大的酶類，大約占全世界每年總銷售量的60%左右［12］。當(dāng)前國(guó)外堿性蛋白酶高產(chǎn)菌株的選育主要是用基因工程技術(shù)和蛋白質(zhì)工程手段進(jìn)行工業(yè)微生物菌種的定向選育，目的性強(qiáng)，而且對(duì)酶結(jié)構(gòu)的研究也比較深入。Pinar［13］等研究了 pH 對(duì)地衣芽孢桿菌(Bacillus licheniformis)生產(chǎn)堿性蛋白酶的影響。Murat［14］等通過固定化Teredinobacter turnirae細(xì)胞生產(chǎn)堿性蛋白酶。Laxman［15］等優(yōu)化了Conidiobolus coronatus生產(chǎn)堿性蛋白酶的發(fā)酵條件，并研究了其擴(kuò)大培養(yǎng)。Joo［16］等采用Bacillus clausiiI－52經(jīng)液態(tài)發(fā)酵生產(chǎn)堿性蛋白酶并將其應(yīng)用于洗滌劑工業(yè)。Ravichandradeng［17］等采用地衣芽孢桿菌(Bacillus licheniformis)NCIM－2042經(jīng)液態(tài)發(fā)酵生產(chǎn)堿性蛋白酶，研究了發(fā)酵罐擴(kuò)大培養(yǎng)過程中通氣和攪拌對(duì)堿性蛋白酶產(chǎn)率的影響。

Anissa Haddar［18］等從Bacillus mojavensisA21中提取了兩種堿性蛋白酶(BM1 and BM2)，通過SDSPAGE得到其分子量分別為29000u和15500u。兩種酶最適pH分別為8.0～10.0和10.0。以酪蛋白作為底物，60℃條件下該酶活性最高。這兩種酶對(duì)氧化劑和高pH都具有穩(wěn)定性，可應(yīng)用于洗滌劑行業(yè)。Qin Yao［19］等利用不同微生物菌種曲霉(Aspergillus sp.)、芽孢桿菌(Bacillus sp.)和酵母菌(yeast)分別在30℃條件下發(fā)酵黑豆，并分析測(cè)定了發(fā)酵過程中產(chǎn)生的抗氧化成分。研究表明發(fā)酵生產(chǎn)可提高黑豆生產(chǎn)中抗氧化物活性和自由基清除活性。Bassem Jaousdi［20］等從一株鏈霉菌菌株中提取和純化了一種熱穩(wěn)定性堿性蛋白酶，該酶對(duì)有機(jī)溶劑具有高穩(wěn)定性，其最適 pH為 11.5，最適溫度為 75℃。Aihua Deng［21］等分離得到一株高酶活的堿性蛋白酶產(chǎn)生菌株芽孢桿菌B001(Bacillus sp.B001)，該菌株對(duì)表面活性劑具有高穩(wěn)定性，最適反應(yīng)pH為10.0，最適溫度為60℃。隨著研究的深入，極端堿性蛋白酶和高活力堿性蛋白酶工程菌的構(gòu)建已經(jīng)成為國(guó)外堿性蛋白酶的研究熱點(diǎn)。

3.2 國(guó)內(nèi)研究與應(yīng)用現(xiàn)狀

我國(guó)堿性蛋白酶研究較國(guó)外晚，對(duì)其研究技術(shù)主要有傳統(tǒng)的誘變技術(shù)、基因工程、蛋白質(zhì)工程等。目前我國(guó)洗滌行業(yè)中加酶洗滌劑占90%以上，且占有率有上升趨勢(shì)，堿性蛋白酶的研究發(fā)展很快。張晶［22］等從富含蛋白質(zhì)的土壤中篩選分離得到5株產(chǎn)堿性蛋白酶的菌株，經(jīng)測(cè)定，25℃下各菌株酶活均超過200U/mL，最高達(dá)280U/mL。雷曉燕［23］等通過酪蛋白水解圈篩選模型篩選得到一株產(chǎn)堿性蛋白酶活力較強(qiáng)的細(xì)菌B1，并對(duì)其產(chǎn)酶條件進(jìn)行了優(yōu)化。李祖明等［24］采用短小芽孢桿菌(Bacillus pumilus)經(jīng)紫外誘變育種和固態(tài)發(fā)酵生產(chǎn)堿性蛋白酶，酶產(chǎn)率可達(dá)15300U/g。孫同毅［25］等從土壤中分離出一株產(chǎn)堿性蛋白酶的嗜堿性芽孢桿菌并對(duì)其進(jìn)行了表型分類和16S rDNA序列分析，確定了該菌株的分類學(xué)和系統(tǒng)發(fā)育學(xué)地位。成堃［26］等從土壤中分離出若干株產(chǎn)堿性蛋白酶的菌株，并對(duì)其進(jìn)行了16S rRNA分子鑒定以及酶學(xué)性質(zhì)的初步研究。褚忠志［27］等將短小芽孢桿菌Zkud20224液體的發(fā)酵液離心去菌體，用硫酸銨鹽析得粗酶，透析除鹽后進(jìn)行Sephadex G275柱層析得到電泳純堿性蛋白酶，用該法提純的堿性蛋白酶比活力從粗酶液的 155.5U/mg提高到了954U/mg，回收率為27.6%。該酶水解酪蛋白的最適反應(yīng)溫度為50℃，最適作用pH為10，且該酶具有較高的熱穩(wěn)定性和耐堿性。

李祖明［28］等采用5L發(fā)酵罐研究短小芽孢桿菌2080產(chǎn)堿性蛋白酶的擴(kuò)大培養(yǎng)。結(jié)果表明，在較優(yōu)的擴(kuò)大培養(yǎng)條件下，即空氣流量2.5L/min、空氣壓力0.08MPa和攪拌速度500r/min，短小芽孢桿菌2080堿性蛋白酶的產(chǎn)率較搖瓶水平提高了28%，達(dá)到5.17×106U/mL，而發(fā)酵時(shí)間縮短為42h。孫同毅［29］等采用復(fù)合誘變(紫外照射、NTG、離子注入)方法，結(jié)合平板初篩與搖瓶復(fù)篩育高活力堿性蛋白酶產(chǎn)生菌株，獲得了一株高產(chǎn)突變株HAPN－169，其酶活力為3.5×104U/mL，經(jīng)中試發(fā)酵后酶活達(dá)4.2×104U/mL。肖靜［30］等從土壤中篩選獲得1株蛋白酶熱穩(wěn)定性較好的產(chǎn)堿性蛋白酶芽孢桿菌，該蛋白酶發(fā)酵16h達(dá)到產(chǎn)酶高峰。

李亞玲［31］等對(duì)一株產(chǎn)堿性蛋白酶假絲酵母菌的發(fā)酵條件進(jìn)行了優(yōu)化，研究各種碳源、氮源及無機(jī)鹽對(duì)產(chǎn)酶的影響，并應(yīng)用正交實(shí)驗(yàn)優(yōu)化發(fā)酵培養(yǎng)基組成。那治國(guó)［32］等對(duì)3株地衣芽孢桿菌產(chǎn)堿性蛋白酶的去酰胺能力和肽鍵水解能力進(jìn)行了比較，確定了1株去酰胺能力強(qiáng)而肽鍵水解能力弱的菌株，經(jīng)過紫外誘變，篩選獲得1株產(chǎn)堿性蛋白酶的去酰胺能力有顯著提高的菌株 SDZ－61，去酰胺對(duì)達(dá)到了27.96%，比誘變前提高了56.6%，而肽鍵水解度基本沒變。

4 堿性蛋白酶在大豆肽制備中的應(yīng)用

國(guó)內(nèi)外對(duì)大豆肽的制備研究主要集中在利用純酶制劑進(jìn)行直接酶解，但是由于商品酶制劑成本高昂，直接酶解法生產(chǎn)大豆肽代價(jià)巨大，限制了其在發(fā)展中國(guó)家的工業(yè)化生產(chǎn)。近年來，微生物發(fā)酵法因其原料成本低廉、工藝過程簡(jiǎn)便、條件溫和、發(fā)酵效率高、多肽質(zhì)量好等特點(diǎn)日益受到關(guān)注。微生物發(fā)酵法是利用發(fā)酵菌株所產(chǎn)生的蛋白酶，作用于大豆蛋白并將其水解為肽。選擇合適的微生物在以豆粕為主的液體培養(yǎng)基上良好生長(zhǎng)，微生物在生長(zhǎng)代謝過程中大量分泌胞外蛋白酶和羧肽酶，在發(fā)酵過程中可以將大豆蛋白水解并脫除苦味根源的肽鏈末端疏水性氨基酸。

大豆肽的制備工藝中所用的微生物菌株主要集中在產(chǎn)蛋白酶的枯草桿菌1.398、放線菌166、棲土曲霉3.942和黑曲霉3350等。這些菌株具有很強(qiáng)的蛋白酶、脂肪酶、淀粉酶等活性，尤其蛋白酶有內(nèi)切酶，酶解能力強(qiáng)，從內(nèi)部水解大豆蛋白的肽鏈，易形成低分子易被吸收的大豆肽［33］。國(guó)外文獻(xiàn)中報(bào)導(dǎo)了利用枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilisGR－101(KCCM 10673P))和添加曲霉菌 oryzae GB－107(KCTC 10258BP)來發(fā)酵生產(chǎn)大豆肽。美國(guó)在74年成立Adle－Nissen領(lǐng)導(dǎo)專門研究水解蛋白課題機(jī)構(gòu)，取得研究成果，Deltown Speciaties公司建成了年產(chǎn)5000t食用蛋白肽的工廠。日本也于80年代開始開展該方面的研究，日本不二制油公司致力于大豆肽的研究，從酶菌選育、水解工藝確定、水解產(chǎn)物脫苦技術(shù)及產(chǎn)品分離純化等均取得較大進(jìn)展，生產(chǎn)出3種大豆肽;日本Kodera Tomohiro等不添加任何脫苦吸附劑或遮蓋劑，直接利用一種內(nèi)切酶的作用，來切除疏水性末端氨基酸以除去苦味。雪印和森永等乳業(yè)公司均已成功地將大豆肽應(yīng)用于食品工業(yè)。

我國(guó)近年來在此領(lǐng)域也開展了較多研究。黑龍江省的三樂源集團(tuán)研制了“大豆蛋白活性肽”，武漢天天好生物制品有限公司在使用復(fù)合肽多級(jí)定向酶系統(tǒng)技術(shù)生產(chǎn)大豆肽方面處于國(guó)內(nèi)領(lǐng)先水平，同時(shí)掌握了大豆蛋白肽的性能指針測(cè)定、檢測(cè)方法以及功能評(píng)價(jià)等技術(shù)。2005年，由山東都慶股份有限公司、中國(guó)食品發(fā)酵工業(yè)研究院組建的注冊(cè)資本5000萬元的中食都慶(菏澤)生物技術(shù)有限公司，共同投資建設(shè)了5000t大豆多功能肽生產(chǎn)線。

我國(guó)許多高校等科研機(jī)構(gòu)和人員也進(jìn)行了這方面的研究開發(fā)。萬琦［34］等篩選到一株能在發(fā)酵過程中產(chǎn)蛋白酶和外肽酶的枯草芽孢桿菌，利用所產(chǎn)蛋白酶的作用將大豆蛋白水解成短肽，利用所產(chǎn)羧肽酶的作用將短肽末端的疏水性氨基酸切除，實(shí)現(xiàn)了酶解和脫苦一步完成的大豆肽發(fā)酵生產(chǎn)。劉喚明［35］等用高產(chǎn)蛋白酶的枯草芽孢桿菌進(jìn)行發(fā)酵法生產(chǎn)大豆肽的研究，優(yōu)化了發(fā)酵法制備大豆多肽的生產(chǎn)工藝。劉明［36］等以透明圈法、酶活力方法為指標(biāo)從12株枯草芽孢桿菌中篩選出4株產(chǎn)酶高、活力強(qiáng)的菌株，并用總抗氧化性為指標(biāo)進(jìn)行復(fù)篩得到適宜發(fā)酵生產(chǎn)大豆抗氧化活性肽的菌種。余勃［37］等利用30L發(fā)酵罐發(fā)酵豆粕，對(duì)微生物法生產(chǎn)大豆多肽的工藝進(jìn)行了研究。酶活分析表明發(fā)酵菌株Bacillus subtilisSHZ3能同時(shí)分泌蛋白酶和羧肽酶，分別水解大豆蛋白和肽鏈末端的疏水性氨基酸，使大豆蛋白的水解和多肽的脫苦在發(fā)酵過程中一步完成，生產(chǎn)出不苦的大豆多肽。陳宏軍［38］通過發(fā)酵實(shí)驗(yàn)對(duì)3株芽孢桿菌進(jìn)行篩選，得到一株發(fā)酵豆粕粉效率較高的地衣芽孢桿菌，確定了其發(fā)酵條件。經(jīng)過優(yōu)化后，發(fā)酵液的水解度達(dá)到15.9%，比優(yōu)化前提高了1.92倍，豆粕蛋白水解度也有明顯提高。陳名洪［39］等以脫脂豆粕為原料，具有產(chǎn)蛋白酶能力的菌株CHD21為生產(chǎn)菌株進(jìn)行發(fā)酵。菌株所產(chǎn)蛋白酶作用于豆粕粉中的大豆蛋白將其水解為大豆多肽。實(shí)驗(yàn)以水解度作為指標(biāo)，對(duì)菌株發(fā)酵降解豆粕的條件進(jìn)行了優(yōu)化。

5 展望

目前，我國(guó)微生物堿性蛋白酶的研究已經(jīng)達(dá)到分子水平，高產(chǎn)菌種的選育由傳統(tǒng)單純的使用誘變手段逐步過渡到應(yīng)用基因工程技術(shù)。隨著基因工程的快速發(fā)展，越來越多的高溫蛋白酶基因被克隆，堿性蛋白酶結(jié)構(gòu)和功能的關(guān)系更加清楚，對(duì)酶進(jìn)行的相關(guān)改造將有利于堿性蛋白酶在更多行業(yè)發(fā)揮重要作用。相信隨著生物技術(shù)基礎(chǔ)研究的深入和應(yīng)用技術(shù)手段的完善，堿性蛋白酶的研究和應(yīng)用范圍必將進(jìn)一步深入和擴(kuò)大，具有極大的發(fā)展前景。

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Alkaline protease and its application in soybean peptide preparation

SUN Qian，CHEN Fu－sheng*，DING Chang－h(huán)e，LIU Bo－ye
(School of Food Science and Technology，Henan University of Technology，Zhengzhou 450052，China)

Alkaline protease，which is an important kind of industrial enzyme，has been widely applied in food industry，medical treatment，detergent industry，leather producing and other fields.Nowadays，the enzymes for food industry mainly come from microorganism，and the effect of alkaline protease is much better.This article summarizes the producing strains，structure and properties，current use and research status of alkaline protease.Its application in soybean peptide preparation has also been mentioned.

alkaline protease;bacillus;soybean peptide

TS201.2+5

A

1002－0306(2011)11－0487－05

2010－12－02 *通訊聯(lián)系人

孫倩(1986－)，女，碩士研究生，研究方向:食品資源開發(fā)與利用。

國(guó)家自然基金項(xiàng)目(20976037);河南工業(yè)大學(xué)博士基金項(xiàng)目(2010BS014);2010年河南省高新技術(shù)產(chǎn)業(yè)化專項(xiàng)基金。