周元良，柳國(guó)霞，劉 飛，霍貴成

(乳品科學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，東北農(nóng)業(yè)大學(xué)，黑龍江哈爾濱 150030)

氧氣對(duì)干酪乳桿菌生長(zhǎng)和活力的影響

周元良，柳國(guó)霞，劉 飛，霍貴成*

(乳品科學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，東北農(nóng)業(yè)大學(xué)，黑龍江哈爾濱 150030)

以靜置培養(yǎng)為對(duì)照，通過(guò)振蕩培養(yǎng)制造有氧環(huán)境，對(duì)干酪乳桿菌的生長(zhǎng)曲線、菌體活力進(jìn)行分析。研究發(fā)現(xiàn)在有氧條件下菌體生長(zhǎng)受到抑制，菌體密度小于靜置發(fā)酵，在4℃保存時(shí)的活力迅速下降，另外，有氧生長(zhǎng)菌體對(duì)熱、膽汁等條件的耐受性較差，在50℃處理4h導(dǎo)致菌體迅速死亡，在含有膽汁的培養(yǎng)基中，菌體生長(zhǎng)幾乎停滯。通過(guò)透射電鏡觀察發(fā)現(xiàn)有氧條件下菌體細(xì)胞壁發(fā)生破裂，菌體細(xì)胞質(zhì)成分溶出，導(dǎo)致菌體死亡。因此，氧氣對(duì)干酪乳桿菌的生長(zhǎng)具有抑制作用，造成細(xì)胞損傷，導(dǎo)致菌體活力降低。

干酪乳桿菌，氧氣，菌體活力

干酪乳桿菌(Lactobacillus casei)屬于兼性厭氧乳酸菌，通常情況下進(jìn)行無(wú)氧發(fā)酵，可作為乳制品發(fā)酵劑將乳糖等碳源代謝成乳酸［1］。在人體腸道微生態(tài)系統(tǒng)中，L.casei具有抗誘變、降低血清膽固醇等功能［2］，是一種重要的益生菌［3］。然而，在L.casei發(fā)酵過(guò)程中及含有L.casei的食品貨架期內(nèi)都會(huì)使菌體接觸一定的氧氣，這是造成菌體活力下降的因素之一［4－5］。對(duì)乳球菌的研究表明，延長(zhǎng)乳球菌與空氣接觸的時(shí)間會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞死亡和DNA降解［7］;含有其他益生菌的食品在貨架期內(nèi)菌體也會(huì)由于包裝內(nèi)含有氧氣導(dǎo)致菌體活力迅速下降［8］。氧氣對(duì)乳酸菌的致死作用主要是由于分子氧形成的活性氧物質(zhì)，如過(guò)氧化氫、羥自由基等，造成細(xì)胞蛋白質(zhì)、類(lèi)脂、核酸的損傷，從而使菌體死亡并導(dǎo)致下降［6］。在有氧條件下，NADH氧化酶和NADH過(guò)氧化物酶對(duì)L.casei的生長(zhǎng)起關(guān)鍵作用。L.casei細(xì)胞內(nèi)已發(fā)現(xiàn)這類(lèi)酶及其輔酶FAD的存在［9］。由此可見(jiàn)，L.casei可以耐受一定量的氧氣，但是這種耐受限度較低，過(guò)量的氧氣接觸會(huì)造成菌體不可恢復(fù)的損傷［7］。有關(guān)L.casei與氧氣的相關(guān)研究鮮有報(bào)道。因此，本研究針對(duì)L.casei在有氧條件下的生長(zhǎng)情況進(jìn)行研究，探討氧氣對(duì)L.casei生長(zhǎng)的影響，為其在工業(yè)中的應(yīng)用提供有價(jià)值的參考信息。

1 材料與方法

1.1 材料與設(shè)備

干酪乳桿菌L.caseiATCC393，培養(yǎng)條件∶50mL液體培養(yǎng)基分裝于500mL三角瓶中，接種過(guò)夜培養(yǎng)的新鮮菌液，接種量1%，培養(yǎng)溫度37℃，其中有氧培養(yǎng)為在搖床中震蕩培養(yǎng)，轉(zhuǎn)速200r/min［1］，厭氧培養(yǎng)為培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng);MRS培養(yǎng)基(1L) 蛋白胨5g，牛肉膏5g，酵母粉5g，胰蛋白胨10g，葡萄糖20g，吐溫80 1.1g，磷酸氫二鉀2g，檸檬酸氫二氨2g，乙酸鈉5g，硫酸鎂0.58g，硫酸錳0.25g，蒸餾水950mL，固體培養(yǎng)基加1.7%瓊脂粉，121℃滅菌15min;胰蛋白胨、酵母粉 OXOID公司;蛋白胨、牛肉膏、牛膽汁

北京奧博星公司;硫酸鎂、硫酸鋅、葡萄糖 天津市天力化學(xué)試劑有限公司;乙酸鈉 天津市博迪化工有限公司;檸檬酸氫二氨、磷酸氫二鉀 天津市科密歐試劑公司;瓊脂粉 Solarbio公司;NADH、FAD美國(guó)Sigma公司;以上試劑均為分析純級(jí)。

生化培養(yǎng)箱SPX－150B 上海佳勝實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司;超凈工作臺(tái)CJ－2D 天津泰斯特;分析天平PL2002 瑞士METTLER TOLEDO;恒溫?fù)u床HWY－100B 上海智誠(chéng);紫外－可見(jiàn)分光光度計(jì)DU－800美國(guó)BECKMAN;壓力蒸汽滅菌器HVE－50 日本HIRAYAMA;透射電鏡H－7650 日本HITACHI;離心機(jī)GL－20G－Ⅱ。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 生長(zhǎng)曲線測(cè)定 兩種培養(yǎng)條件下的菌液自4h開(kāi)始至24h，每隔2h取樣測(cè)定菌體OD600和pH。10h以后菌體需經(jīng)適當(dāng)稀釋后進(jìn)行OD600測(cè)定。

1.2.2 活菌計(jì)數(shù) 兩種培養(yǎng)條件下的菌液采用平板菌落計(jì)數(shù)法測(cè)定活菌數(shù)［10］。每個(gè)稀釋度做三個(gè)平行，于37℃培養(yǎng)48h后取出，靜置于4℃冰箱中。取樣時(shí)間分別為12h，24h，5d，10d和15d。

1.2.3 菌體耐熱性測(cè)定 將兩種培養(yǎng)條件下的48h培養(yǎng)物置于50℃水浴中放置4h，用1.2.2中的平板菌落計(jì)數(shù)法計(jì)活菌數(shù)。

1.2.4 菌體耐膽汁活力 將兩種培養(yǎng)條件下的48h培養(yǎng)物接種1%于含有0.3%牛膽汁的滅菌MRS培養(yǎng)基中并按1.2.2方法進(jìn)行活菌計(jì)數(shù)，于37℃培養(yǎng)3h后再計(jì)數(shù)，比較二者菌體生長(zhǎng)受抑制程度［11］。

1.2.5 菌體NADH氧化酶系活力測(cè)定 將10mL的24h培養(yǎng)物，10000×g，4℃離心10min，收集的菌體用PBS緩沖液(pH6.0)洗三次，并重懸于PBS緩沖液中并超聲破碎(功率150W，工作時(shí)間3s，間隔時(shí)間5s，總時(shí)間30min)，1000×g，4℃離心10min，收集上清液。反應(yīng)體系含有 100μmol/L NADH，20μmol/L FAD，50mmol/L PBS緩沖液(pH6.0)，10μL酶提取液，25℃保溫，每3min測(cè)定A340，做出曲線并計(jì)算斜率，根據(jù)斜率大小比較NADH氧化酶系活力［12］。

1.2.6 透射電鏡觀察 樣品制備∶48h菌體培養(yǎng)液置于1.5mL EP管中，4℃，5000×g離心10min，棄上清液，菌體用 2.5%戊二醛固定，于 4℃放置過(guò)夜。0.1mol/L PBS緩沖液洗滌三次后用四氧化鋨固定2.5h。再用0.1mol/L PBS清洗三次后依次用50%、70%、80%、90%、100%乙醇、1∶1的乙醇－丙酮和100%丙酮脫水。脫水后用梯度濃度的丙酮與包埋劑浸透過(guò)夜，次日包埋，聚合3d，再經(jīng)修塊、切片和染色后進(jìn)行電鏡觀察［13］。電鏡條件∶100kV，放大倍數(shù)∶6×104倍。

1.2.7 統(tǒng)計(jì)分析 采用SPSS13.0和EXCEL對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果與討論

2.1 不同培養(yǎng)方式下L.casei的生長(zhǎng)曲線

分別測(cè)定了靜置培養(yǎng)(NO)和搖床培養(yǎng)(O)兩種條件下L.casei的生長(zhǎng)曲線，見(jiàn)圖1。

由圖1所示，在兩種條件下菌體產(chǎn)酸量和變化趨勢(shì)均一致，表明氧氣對(duì)L.casei的發(fā)酵產(chǎn)酸影響較小。但是從菌體密度來(lái)看，10h前二者變化相近，12h開(kāi)始后搖床培養(yǎng)條件下菌體生長(zhǎng)明顯受到抑制(P＜0.05)，菌體密度增長(zhǎng)變慢，最終菌體密度也低于靜置培養(yǎng)條件下的菌體?？梢钥闯鲅鯕鈱?duì)菌體的抑制主要作用在對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期。這是由于處在對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的菌體代謝旺盛，對(duì)外界環(huán)境因素如酸、熱、氧化等抵抗力較差［14］，而氧氣的存在以及超氧化物的生成使菌體受到脅迫，生長(zhǎng)被抑制［6］，使菌體生長(zhǎng)的對(duì)數(shù)期減短，菌體較早進(jìn)入穩(wěn)定期，從而導(dǎo)致最終菌體密度較低。

圖1 兩種培養(yǎng)條件下L.casei生長(zhǎng)曲線

2.2 活菌計(jì)數(shù)

兩種條件下培養(yǎng)物中活菌數(shù)變化情況如圖2所示。兩種條件下24h前活菌數(shù)相當(dāng)，且在4℃條件下放置后，二者菌體活力均迅速下降，搖床培養(yǎng)的活菌數(shù)對(duì)數(shù)值在10d即下降到0，而同一時(shí)期靜置培養(yǎng)的菌體活力還保持在104以上。這表明在培養(yǎng)過(guò)程中其菌體細(xì)胞可能受到損傷，從而導(dǎo)致在冷藏條件下菌體無(wú)法適應(yīng)外界條件而大量死亡。而且在這一過(guò)程中可能生成的活性氧物質(zhì)也會(huì)造成菌體死亡。這說(shuō)明有氧條件下培養(yǎng)物中生成的超氧化物在菌體保存過(guò)程中對(duì)菌體進(jìn)一步刺激，導(dǎo)致菌體大量死亡［7］。

圖2 兩種培養(yǎng)條件下L.casei活力變化情況

2.3 菌體耐熱性

由圖3可以看出，搖床培養(yǎng)條件下熱處理后的菌體活力下降明顯(P＜0.05)，其活菌數(shù)對(duì)數(shù)值下降7.1，表明其培養(yǎng)物中活細(xì)胞對(duì)外界熱處理?xiàng)l件敏感，菌體死亡率增加。而靜置條件下熱處理后菌體活力下降幅度不明顯(P＞0.05)，僅為1.77，表明該菌體對(duì)外界熱處理具有一定的抵抗力。搖床培養(yǎng)條件下菌體熱抵抗力差與其菌體活力差有關(guān)。乳酸菌最高耐受生長(zhǎng)溫度是53℃［15］，搖床培養(yǎng)條件下菌體活力在50℃迅速下降表明菌體發(fā)生了不利于耐受高溫的變化。這一變化主要是由于菌體活力降低以及菌體細(xì)胞的氧化損傷。

2.4 菌體耐膽汁活力

兩種培養(yǎng)條件下菌體對(duì)膽汁的耐受性有明顯差異(P＜0.05)，如圖4所示。靜置培養(yǎng)條件下菌體在生長(zhǎng)3h后活菌數(shù)對(duì)數(shù)值增加0.6，而同期搖床培養(yǎng)的菌體活力只上升0.1個(gè)對(duì)數(shù)值。這表明在含有0.3%膽汁的培養(yǎng)基中，搖床培養(yǎng)的菌體生長(zhǎng)受到明顯抑制(P＜0.05)，生長(zhǎng)幾乎停滯。菌體對(duì)膽汁的耐受性程度也與其菌體活力有關(guān)，正是由于在有氧條件下其菌體活力下降，所以導(dǎo)致L.casei在膽汁培養(yǎng)基中生長(zhǎng)受抑制。

圖3 兩種培養(yǎng)條件下L.casei菌體的耐熱性

圖4 兩種培養(yǎng)條件下L.casei菌體的耐膽汁活性

2.5 NADH氧化酶系活力

由兩種條件下細(xì)胞NADH氧化酶系活力可看出，L.casei菌體細(xì)胞NADH氧化酶系活力很低，同時(shí)，搖床培養(yǎng)菌體的酶活力是靜置培養(yǎng)條件下酶活力的2.8倍。這表明過(guò)多的氧氣會(huì)刺激菌體通過(guò)自身代謝途徑的改變來(lái)降低氧氣對(duì)細(xì)胞的毒性作用。因此，通常情況下，在接觸少量的氧氣時(shí)，L.casei生長(zhǎng)不會(huì)受到抑制。但是當(dāng)大量的氧氣在其整個(gè)生長(zhǎng)過(guò)程中出現(xiàn)時(shí)，其N(xiāo)ADH氧化酶系不足以消除氧氣帶來(lái)的氧化損傷，菌體生長(zhǎng)及活力均出現(xiàn)下降趨勢(shì)［9］。

圖5 兩種培養(yǎng)條件下L.casei NADH氧化酶系活力

2.6 細(xì)胞電鏡觀察

兩種條件下細(xì)胞的電鏡觀察結(jié)果如圖6所示。由圖6可以看出，在靜置培養(yǎng)條件下，L.casei具有完整的細(xì)胞壁，而在搖床培養(yǎng)條件下部分菌體細(xì)胞壁發(fā)生破裂，導(dǎo)致胞內(nèi)物質(zhì)溶出。這種變化會(huì)直接造成菌體死亡和菌體活力下降。另外，靜置培養(yǎng)菌體細(xì)胞壁較厚，表面粗糙，搖床培養(yǎng)得到的菌體細(xì)胞壁較薄，且表面光滑。這些變化都是在其生長(zhǎng)過(guò)程中與氧氣接觸造成。一方面，菌體接觸的氧氣或者生成的超氧化物對(duì)細(xì)胞壁產(chǎn)生了刺激作用，導(dǎo)致其變薄和光滑，部分細(xì)胞由于所受刺激超過(guò)細(xì)胞壁承受限度，使細(xì)胞壁發(fā)生破裂，導(dǎo)致菌體自溶。這些因素都會(huì)導(dǎo)致菌體活力迅速下降，不利于菌體的保存。

3 結(jié)論

圖6 兩種培養(yǎng)條件下L.casei細(xì)胞的透射電鏡照片

在有氧條件下，兼性厭氧菌L.casei的生長(zhǎng)會(huì)由于氧氣的存在而受到抑制，這種抑制表現(xiàn)在菌體生長(zhǎng)減慢和菌體活力下降，包括菌體的耐熱、耐冷藏、耐膽汁活力的下降。造成這種抑制作用的主要原因是菌體在有氧生長(zhǎng)過(guò)程中培養(yǎng)物中產(chǎn)生的超氧化物對(duì)菌體造成的破壞作用［6－7］。因此，氧氣在L.casei生長(zhǎng)過(guò)程中出現(xiàn)是不利的。雖然少量的氧氣可以通過(guò)NADH氧化酶/過(guò)氧化酶體系代謝［9］，但這類(lèi)酶在L.casei細(xì)胞內(nèi)活性較低，當(dāng)過(guò)量的氧氣接觸菌體依然會(huì)對(duì)菌體造成損害。大多數(shù)應(yīng)用L.casei的發(fā)酵劑、益生菌食品等在生產(chǎn)加工以及產(chǎn)品儲(chǔ)存過(guò)程中都會(huì)不可避免接觸一些氧氣［4］，進(jìn)而使發(fā)酵劑或產(chǎn)品中菌體活力下降，導(dǎo)致發(fā)酵性能下降和食品使用價(jià)值降低。

［1］Pappy J R，Kesavan M N，Athira S N，et al.L(+)－Lactic acid production using Lactobacillus Caseiin solid－state fermentation［J］.Biotechnology Letters，2005，27:1685－1688.

［2］Nagendra P S.Functional cultures and health benefits［J］. International Dairy Journal，2007，17(11):1262－1277.

［3］Inmaculada N，Juan R，Gaspar P，et al.Diacetyl and acetoin production from whey permeate using engineered Lactobacillus casei［J］.Journal of Industrial Microbiology and Biotechnology，2009，36:1233－1237.

［4］Akshat T，Kaila K.The Role of Oxygen in the viability of probiotic bacteria with reference to L.acidophilus and Bifidobacterium spp ［J］ .Current Issues in Intestinal Microbiology，2004(5):1－8.

［5］Donkor，Nilmini，Stolic，et al.Survival and activity of selected probiotic organisms in set－type yoghurt during cold storage［J］. International Dairy Journal，2007，7(6):657－665.

［6］付良，劉飛，霍貴成.一株能夠利用血紅素進(jìn)行有氧呼吸的乳酸乳球菌［J］.微生物學(xué)報(bào)，2008，48(9):1256－1259.

［7］Maarten G，Pascale S，Christian C，et al.Stress responses in lactic acid bacteria［J］.Antonie van Leeuwenhoek，2002，82: 187－216.

［8］Craig M，Minh N，Michael R，et al.The influence of packaging materials on the dissolved oxygen content of probiotic yoghurt［J］.Packaging Technology and Science，2008，15(3):133－138.

［9］Mitsuo S，Kazuo K.Aerobic growth of and activities of NADH oxidase and NADH peroxidase in Lactic Acid Bacteria［J］. Journal of Fermentation and Bioenoineer，1996，82(3):210－216.

［10］Liong，Shah.Acid and bile tolerance and cholesterol removal ability of Lactobacilli Strains［J］.Journal of Dairy Science，2005，88:55－66.

［11］Fellix L D F，Michile K，Willem，et al.Cofactor engineering:a novel approach to metabolic engineering in Lactococcus lactis by controlled expression ofNADH oxidase［J］.Journalof Bacteriology，1998，180(15):3804－3808.

［12］Carmen K，Jorg O T，Sybille H，et al.Multi－step assembly pathway of the cbb3－type cytochrome c oxidase complex［J］. Journal of Molecular Biology，2006，355:989－1004.

［13］Michelle C，Lynn M，Trevor B.Electron microscopic analysis of dairy microbes inactivated by ultrasound［J］.Ultrasonics Sonochemistry，2010，15:960－964.

［14］劉懷龍，孟祥晨.酸適應(yīng)乳酸菌的篩選及其酸適應(yīng)條件的研究［J］.山東大學(xué)學(xué)報(bào)，2008，43(7):51－55.

［15］張剛.乳酸細(xì)菌－基礎(chǔ)、技術(shù)和應(yīng)用［M］.北京:化學(xué)工業(yè)出版社，2007:99.

Influence of oxygen to the growth and survival of Lactobacillus casei

ZHOU Yuan－liang，LIU Guo－xia，LIU Fei，HUO Gui－cheng*
(Key laboratory of Dairy Science，Ministry of Education，Northeast Agricultural University，Harbin 150030，China)

The growth curve and survival of L.casei under aerobic and anaerobic conditions were obtained by culturing with and without shaking respectively.The growing of L.casei inhibited by oxygen，which had a decreased growth yield compared with standing fermentation and a survival of reduced rapidly when stored at 4℃.Aerobic cultured L.casei had a bad tolerance in MRS media contain 0.3%bile，which also made a dominant cells death by treating with 50℃ for 4 hours.The cell walls rupturing and cytoplasm of aerobic cells dissolution were observed by transmission electron microscope，which induced the death of cells.Accordingly，influence of oxygen to L.casei was inhibiting growth，breaking cell walls and leading to poor survival.

Lactobacillus casei;oxygen;survival of cells

TS201.3

A

1002－0306(2011)11－0209－04

2010－11－26 *通訊聯(lián)系人

周元良(1986－)，男，碩士研究生，研究方向:食品科學(xué)。

教育部長(zhǎng)江學(xué)者和創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)發(fā)展計(jì)劃(IRTO959)。