林嵐，李靖

東南大學(xué)醫(yī)學(xué)院生物工程系，江蘇 南京 210009

植物與微生物的關(guān)系多種多樣，植物相關(guān)的微生物包括菌根菌（多為真菌）、根際微生物、病原菌、內(nèi)生菌等等。植物內(nèi)生菌是生活在健康植物活體內(nèi)、不會(huì)導(dǎo)致宿主出現(xiàn)病害癥狀的微生物[1]，內(nèi)生菌類群涵蓋細(xì)菌、放線菌以及真菌。在不同的宿主植物體內(nèi)存在不同種類的內(nèi)生菌，它們對(duì)宿主的選擇存在一定專一性。其共同特征是能定殖在健康植物細(xì)胞間隙或細(xì)胞內(nèi), 并與宿主植物建立和諧的共生關(guān)系。

紅豆杉Taxus又名紫杉，是公認(rèn)的瀕臨滅絕的天然珍稀植物[2]。作為抗癌藥物紫杉醇的重要生源，紅豆杉一直倍受藥學(xué)家、天然產(chǎn)物化學(xué)家的重視。自20世紀(jì)90年代Strobel等[3]從短葉紅豆杉中分離得到一株產(chǎn)紫杉醇的內(nèi)生真菌以來，紅豆杉內(nèi)生菌分離與研究成為一個(gè)熱點(diǎn)，許多內(nèi)生真菌相繼被分離得到。

目前紅豆杉內(nèi)生菌的研究方面，內(nèi)生細(xì)菌的報(bào)道遠(yuǎn)少于內(nèi)生真菌，放線菌的報(bào)道更少，迄今僅見于意大利學(xué)者Quaroni S.研究團(tuán)隊(duì)[4-5]和中國(guó)學(xué)者Wu et al[6]的研究文章?；诖?，本文著手從藥用植物紅豆杉嫩枝與葉中分離內(nèi)生的原核微生物（細(xì)菌、放線菌），并圍繞一株內(nèi)生放線菌En-1展開研究，優(yōu)化其培養(yǎng)條件，并對(duì)其次生代謝產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)和抗菌活性進(jìn)行篩選，為發(fā)現(xiàn)結(jié)構(gòu)新穎和活性獨(dú)特的內(nèi)生菌代謝產(chǎn)物奠定良好基礎(chǔ)，而且為研究?jī)?nèi)生菌是否影響植物藥用成分（如紫杉醇及其前體）的生物合成相關(guān)研究提供新的切入點(diǎn)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)材料

采自中山植物所藥用植物園的中國(guó)紅豆杉Taxus chinensis莖、葉；供試菌大腸桿菌Escherichia coli、金黃色葡萄球菌Staphyloccocus aureus、枯草芽孢桿菌Bacillus subtilis、白色念球菌(又名：白假絲酵母)Canidia albicans、黑曲霉Aspergillus niger均為本實(shí)驗(yàn)室保存的中國(guó)藥典標(biāo)準(zhǔn)菌株，分別代表G-腸道菌、G+球菌、G+桿菌、酵母狀真菌和絲狀真菌。

1.1.2 試劑

卡那霉素、制霉菌素、吐溫-20均購(gòu)自上海生工公司，苯酚購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑公司，NaClO溶液（有效氯含量34.0%～46.0%）、乙醇購(gòu)自南京化學(xué)試劑有限公司。

1.1.3 培養(yǎng)基

高氏一號(hào)合成培養(yǎng)基、PDA培養(yǎng)基和牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基成分及配制參見文獻(xiàn)[7]。

1.2 方法

1.2.1 樣品預(yù)處理、表面消毒和內(nèi)生菌分離

紅豆杉嫩枝和葉用自來水流水沖洗后，在加有3～4滴吐溫-20的水中浸泡20～25 min，再用流水沖凈。然后依次 φ=75%乙醇(1 min)、w=2.0%次氯酸鈉(20 min)、φ=75%乙醇(1 min)處理，乙醇、次氯酸鈉兩種消毒劑處理之間以無菌水清洗3遍，最后無菌水清洗3～4遍，無菌濾紙吸取多余水分。

將上述植物材料表面消毒的末次清洗的無菌水作為對(duì)照，與植物樣本的葉汁（0.1 mL）在同等條件下鋪板，以檢查表面消毒的徹底性；同時(shí)將經(jīng)表面消毒的一批植物材料取幾個(gè)平行樣，以其外表面分別在牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基和高氏1號(hào)合成培養(yǎng)基平板上輕緩滾動(dòng)后移走，目的也是檢查表面消毒是否徹底。

將表面消毒的植物材料用無菌剪刀剪碎, 置于無菌研缽內(nèi)，加10 mL生理鹽水研磨充分并靜置5～10 min，吸取1 mL清亮的葉汁移至另一無菌試管，依次10倍稀釋，得到一系列稀釋液，分別進(jìn)行涂板（0.2 mL/平板）。每個(gè)稀釋度的樣品，做3個(gè)重復(fù)[9]。分離內(nèi)生細(xì)菌，采用含50 μg·mL-1制霉菌素（以抑制真菌生長(zhǎng)）的牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基[10]；分離內(nèi)生放線菌，采用含50 μg·mL-1卡那霉素、50 μg·mL-1制霉菌素、φ=0.25%酚（以抑制真菌和細(xì)菌的生長(zhǎng)）的高氏1號(hào)合成培養(yǎng)基[9-10]。上述抗生素各自配成100 mg·mL-1的貯存液, 并經(jīng)0.22 μm濾膜除菌。在分離到的內(nèi)生菌中，有一株放線菌（命名為En-1）引起特別關(guān)注，其菌落形態(tài)、顯微觀察 (參見1.2.2) 和產(chǎn)土腥素能力提示En-1為鏈霉菌。將該菌株凍存于φ=20%甘油中（-70 ℃）。

1.2.2 內(nèi)生放線菌的顯微觀察

采用插片法制作放線菌 En-1自然生長(zhǎng)情況下的鏡檢片[7]，在光學(xué)顯微鏡下觀察放線菌的菌絲和孢子, 并拍照。

1.2.3 內(nèi)生菌En-1的分子生物學(xué)鑒定

以放線菌通用引物 F-primer (5’-AGAGTT TGATCMTGGCTCAG) 和 R-primer (5’-TACG GYTACCTTGTTACGACTT) PCR擴(kuò)增全長(zhǎng)的16S rRNA 基因(～1.5 kb)。PCR 反應(yīng)體系(50 μL)：1 μL F-primer (20 μmol·L-1)，1 μL R-primer (20 μM)，5 μL 10×酶緩沖液(不含 Mg2+)，4 μL dNTPs (2.5 mmol/L)，3 μL MgCl2(25 mmol·L-1)，0.5 μL Taq 酶(5 U·μL-1)和 1 μL 模板 DNA 及 34.5 μL MiniQ 超純水。PCR 反應(yīng)參數(shù)：94 ℃ 5 min；95 ℃ 40 s，52 ℃30 s，72 ℃ 2 min，27 個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸 5 min。瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)擴(kuò)增的目的條帶。純化的PCR產(chǎn)物由南京金斯特生物科技公司進(jìn)行 16S rDNA測(cè)序。

將獲得的16S rDNA序列通過Blast在GenBank上進(jìn)行相似性序列檢索，將其序列與其高同源性(>99%)的已知菌株16S rDNA序列在Mega 4.0軟件中進(jìn)行分析，用neighbor-joining方法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.2.4 紅豆杉浸出液對(duì)En-1菌生長(zhǎng)的影響

紅豆杉針葉沖凈后，加入裝有適量雙蒸水的500 mL三角瓶中煮沸15～20 min，經(jīng)過濾得到宿主植物浸出液。以添加宿主植物紅豆杉針葉浸出物的培養(yǎng)基作為實(shí)驗(yàn)組，未添加的培養(yǎng)基作為對(duì)照組，分別進(jìn)行內(nèi)生放線菌的震蕩培養(yǎng)。培養(yǎng)1周后，離心法收獲菌體，稱量菌體鮮質(zhì)量、干質(zhì)量（以其生物量為生長(zhǎng)指標(biāo)），比較實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組的生長(zhǎng)量，以考察宿主植物針葉浸出物是否影響內(nèi)生放線菌En-1的體外生長(zhǎng)。

1.2.5 En-1菌發(fā)酵液上清的抗菌活性測(cè)試

將滅菌的瓊脂培養(yǎng)基完全融化倒在培養(yǎng)皿內(nèi)，待其凝固作為下層。然后將融化的營(yíng)養(yǎng)瓊脂冷至約50 ℃混入供試菌，將混有供試菌的培養(yǎng)基約10 mL加到已凝固的下層瓊脂上待凝（上層）。再在上層含菌培養(yǎng)基對(duì)稱放置4個(gè)牛津杯，杯中加入離心收集的、并經(jīng)濾膜(0.22 μm)除菌的En-1菌培養(yǎng)13～14 d的發(fā)酵液上清0.2 mL，置適宜溫度下培養(yǎng)（若供試菌為細(xì)菌，則37 ℃培養(yǎng)18～24 h；若供試菌為真菌，則28 ℃培養(yǎng)28～48 h），觀察抑菌圈大小。

1.2.6 內(nèi)生放線菌的液體培養(yǎng)與粗提取物

內(nèi)生放線菌En-1分別接種于高氏1號(hào)、PDA液體培養(yǎng)基各1 L，每500 mL液體培養(yǎng)基接入8小塊含孢子的瓊脂塊 (4 mm×4 mm)，于28 ℃，140 r/min振蕩培養(yǎng)13～14 d后，收獲培養(yǎng)物。離心，棄沉淀，收集上清。將合并的上清分別用等體積的乙酸乙酯萃取有機(jī)成分，然后在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（EYELAN-1000）蒸去乙酸乙酯，再通過除鹽、除蠟后，得到的樣品即為粗提取物。

“山高皇帝遠(yuǎn)啊，我就給你說，我們這兒擺個(gè)攤兒……政府都要管制你的，他們(購(gòu)物店的人)不管的，人民幣，實(shí)話實(shí)說?！薄?5四川省松潘縣川主寺鎮(zhèn)商店店主。

1.2.7 液體培養(yǎng)基的優(yōu)化以及抗菌活性測(cè)試

采用不同C、N源與pH值的組合#1–9（見表1），除了表中成分外，培養(yǎng)基中其余成分如下：K2HPO4·3H2O 0.5 g·L, NaCl 0.5 g·L, FeSO4·7H2O 0.01 g·L-1, MgSO4·7 H2O 0.5 g·L-1, 每種配方設(shè) 3 個(gè)重復(fù)，分裝于250 mL三角瓶中。搖瓶接種、振蕩培養(yǎng)以及培養(yǎng)物的提取方法, 同1.2.6。將不同培養(yǎng)基中發(fā)酵產(chǎn)物的粗提物各20 mg分別溶于1 mL甲醇: 水（50:50，體積比），經(jīng)0.22 μm濾膜除菌后，取0.2 mL用于牛津杯抗菌測(cè)試, 同體積(0.2 mL)的φ=50%甲醇作為對(duì)照。

表1 內(nèi)生放線菌的發(fā)酵培養(yǎng)基優(yōu)化

1.2.81H-NMR測(cè)試

采用1H-NMR測(cè)試法對(duì)內(nèi)生菌粗提物的結(jié)構(gòu)多樣性進(jìn)行篩查。5～10 mg的粗提物溶于氘代氯仿(1H-CHCl3)或氘代二甲亞砜(1H-DMSO)溶劑，以四甲基硅烷(TMS)作為內(nèi)標(biāo),在Bruker DRX-500核磁共振儀進(jìn)行波譜測(cè)定。

1.2.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

1.2.4 中實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組En-1菌生物量的數(shù)據(jù)處理采用Excel軟件計(jì)算Mean ± SD, 并用SPSS 17.0進(jìn)行差異顯著性分析，P <0.01被認(rèn)為差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 內(nèi)生放線菌的分離純化與顯微觀察

通過設(shè)計(jì)選擇性培養(yǎng)基，分離得到了3株內(nèi)生細(xì)菌和1株放線菌。其中放線菌（命名為En-1）引起關(guān)注，因?yàn)榉啪€菌次生代謝物極具多樣性，迄今發(fā)現(xiàn)的抗生素有2/3來源于放線菌, 而且有關(guān)紅豆杉內(nèi)生放線菌的研究報(bào)道尚少見。放線菌En-1，在高氏1號(hào)合成培養(yǎng)基上生長(zhǎng)良好，幼齡時(shí)為淺灰色、表面干燥的小菌落，在生長(zhǎng)中期，菌落顏色加深并且其上出現(xiàn)白色孢子堆，菌落表面出現(xiàn)皺褶，而培養(yǎng)基因?yàn)镋n-1分泌的色素呈現(xiàn)淺褚色(圖1a)，隨菌齡增長(zhǎng)，色素顏色轉(zhuǎn)深，變成紅褐色。這株放線菌在PDA平板上生長(zhǎng)，呈表面濕潤(rùn)的淡黃色菌落，無色素分泌。但在接種時(shí)，發(fā)現(xiàn)其菌落與PDA培養(yǎng)基結(jié)合致密，不易用接種環(huán)挑取。可能PDA培養(yǎng)基不利于該菌產(chǎn)孢。一般而言，高氏1號(hào)合成培養(yǎng)基是公認(rèn)的放線菌生長(zhǎng)的適宜培養(yǎng)基。

放線菌在經(jīng)過了生長(zhǎng)旺盛期后，進(jìn)入次生代謝（一般13～14 d）。色素為典型的放線菌次生代謝產(chǎn)物，故我們可通過色素的合成和分泌，判斷放線菌是否處于次生代謝階段。高氏1號(hào)合成培養(yǎng)基中碳源是淀粉，適于放線菌產(chǎn)孢。孢子堆積，使放線菌菌落形態(tài)呈現(xiàn)干粉狀。在顯微鏡下觀察，清晰可見波曲狀的孢子鏈以及散落的單個(gè)圓形孢子, 孢子表面光滑（圖1b）。綜合平板培養(yǎng)特征、產(chǎn)生揮發(fā)性的土腥素（賦予其特殊的土腥味）和顯微觀察, 初步鑒定該菌為鏈霉菌屬。

2.2 基于16SrDNA序列的內(nèi)生放線菌En-1鑒定

圖1 內(nèi)生放線菌En-1的平板培養(yǎng)和孢子的顯微觀察Fig. 1 The plating culture of endophytic actinomycete En-1 and microscopic observation of its spores

序列結(jié)果在Genbank上Blast比對(duì)后，構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹如圖2所示?；?6S rDNA序列的系統(tǒng)發(fā)育分析表明，與En-1菌株親緣關(guān)系最近的是Streptomyces pseudogriseolus和 Streptomyces althioticus，可以確定En-1菌株為鏈霉菌Streptomyces sp.。

2.3 宿主植物浸出液促進(jìn)內(nèi)生放線菌En-1生長(zhǎng)

通過添加浸出物（添加組）和未加浸出物（對(duì)照組）的搖瓶培養(yǎng)物生物量之比較，可考察宿主植物浸出液對(duì)內(nèi)生放線菌菌體生長(zhǎng)的影響。如圖3所示，添加組中放線菌鮮質(zhì)量、干質(zhì)量均大于對(duì)照組(P<0.005)，表明宿主組織浸出物對(duì)其該菌的初生代謝（菌體生物量）有極顯著的促進(jìn)作用，提示在自然生境中內(nèi)生菌在宿主植物體內(nèi)定殖有利于其自身生長(zhǎng)增殖。

2.4 內(nèi)生放線菌En-1發(fā)酵產(chǎn)物的抑菌活性

內(nèi)生放線菌En-1在高氏1號(hào)培養(yǎng)基中震蕩培養(yǎng)13 d，得到發(fā)酵液上清，通過瓊脂擴(kuò)散法測(cè)試其抑菌活性。5株供試菌分別為 3株細(xì)菌[大腸桿菌(G-)、金黃色葡萄球菌和枯草桿菌(G+)]、1株酵母狀真菌（白色念球菌）、1株絲狀真菌（黑曲霉）。以上供試菌因其非致病性和標(biāo)準(zhǔn)性，常用作實(shí)驗(yàn)室篩選人或動(dòng)物病原菌的抗生素的敏感菌株。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明(圖4)，在黑曲霉平板上牛津杯放置的周圍出現(xiàn)明顯的抑菌圈，而其它的供試菌平板上沒有出現(xiàn)可見的抑菌圈，說明 En-1菌發(fā)酵液上清對(duì)黑曲霉生長(zhǎng)具有抑制作用。提示 En-1菌能產(chǎn)生抑制絲狀真菌生長(zhǎng)的次生代謝物，因而該菌可作為進(jìn)一步提純抗絲狀真菌化合物的資源菌。

2.5 內(nèi)生放線菌En-1液體培養(yǎng)與粗提取物

該放線菌En-1在高氏1號(hào)合成培養(yǎng)基的搖瓶培養(yǎng)物, 經(jīng)離心、乙酸乙酯萃取，有機(jī)相呈亮黃色，多次萃取，至萃取相無色。該菌在 PDA搖瓶培養(yǎng)物, 經(jīng)同樣處理，萃取相呈灰黃–土黃色，萃取一次即可。提示該菌在高氏1號(hào)比在PDA培養(yǎng)基中產(chǎn)生更具多樣化的次生代謝物。這點(diǎn)也由粗提物的NMR譜圖(圖5)佐證。

圖2 基于16S rDNA序列的內(nèi)生菌株En-1的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig. 2 The phylogenetic tree of endophytic actinomycete strain En-1 based on 16S rDNA sequences

圖3 紅豆杉針葉浸出物對(duì)內(nèi)生放線菌En-1生長(zhǎng)的影響Fig.3 The effects of Taxus needle leaf extracts on the biomass of En-1

圖4 內(nèi)生放線菌En-1發(fā)酵產(chǎn)物的抑菌活性測(cè)試Fig. 4 The inhibitory effects of the En-1 fermentative products against Aspergillus niger

2.6 培養(yǎng)條件的優(yōu)化

在9種不同培養(yǎng)基配方中，#1–3配方均以葡萄糖為碳源，第#1、#3培養(yǎng)基中該菌發(fā)酵產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)多樣性明顯優(yōu)于#2培養(yǎng)基(圖6a, 6c vs圖6b)。#4–6配方均以蔗糖為碳源，第#4、#6培養(yǎng)基中該菌發(fā)酵產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)多樣性(圖 6d, 6f)明顯少于#5培養(yǎng)基(圖 6e)；#5中的發(fā)酵產(chǎn)物(圖 6e)在 δH5.0～5.5有一吸收峰, 可能是-C=C-上的不飽和H所致; #5中發(fā)酵產(chǎn)物在δH8.0左右有多個(gè)小峰, 可能是芳烴上的氫或者-N-H-、-OH基上的活潑氫所致，而且δH3～4間出現(xiàn)多峰。

圖5 內(nèi)生放線菌En-1的乙酸乙酯粗提物的1H-NMR譜Fig. 5 The spectrum of ethyl acetate extracts of the fermentative filtrate of En-1 strain by 1H-NMR analysis in which the specimens were dissolved in 1H-DMSO and TMS was used as internal standard

圖6 內(nèi)生放線菌En-1在不同培養(yǎng)基中發(fā)酵液粗提物的1H-NMR圖譜Fig. 6 The 1H-NMR spectra of crude extracts derived from fermentative products of En-1 in different culture media with altered formulations

#7–9配方均以淀粉為碳源，#8培養(yǎng)基中發(fā)酵產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)多樣性(圖 6h)明顯優(yōu)于#7和#9(圖 6g,6i)。如圖所示，#8中發(fā)酵產(chǎn)物的NMR譜(圖6h)在δH3.5～5.0間有多個(gè)小峰, 按常理推斷是糖基所致,但是 NMR測(cè)試之前樣品以乙酸乙酯萃取, 后續(xù)處理也沒有帶入水相成分, 再之，培養(yǎng)基中碳源物質(zhì)為淀粉（多聚物）, 若淀粉被微生物分解產(chǎn)生少量葡萄糖等單糖成分, 也會(huì)作為速效碳源優(yōu)先于遲效碳源（淀粉）被菌吸收和代謝, 況且收獲發(fā)酵液時(shí)該菌已處于次生代謝期, 因此排除了該處信號(hào)峰來自培養(yǎng)基成分殘留的可能性。文獻(xiàn)[19]認(rèn)為，δH3.5～5.0間的多重峰也可能來自C聯(lián)O上的或C聯(lián)N上的H。#8產(chǎn)物在δH5.0～5.5間的吸收峰可能來自不飽和鍵-C=C-上的H; 在δH6.0～8.0之間，除溶劑 CDCl3造成的吸收峰之外, 還有多個(gè)小峰, 提示苯環(huán)氫的存在; δH大于8.0的低場(chǎng)區(qū)還有很小的峰。總之，#8配方適于該菌次生代謝產(chǎn)物的產(chǎn)生，其產(chǎn)物的化學(xué)結(jié)構(gòu)表現(xiàn)出多樣性。

對(duì)不同培養(yǎng)基配方#1– #9中的En-1菌發(fā)酵液上清進(jìn)行牛津杯抗菌試驗(yàn)。結(jié)果表明（圖7），來自#7、#8、#9配方的放線菌En-1產(chǎn)物具有抑制黑曲霉的活性，以#8配方中產(chǎn)物的抑菌圈直徑最大；而其它培養(yǎng)基配方中 En-1菌次生代謝物則無抑菌圈出現(xiàn)。

圖7 En-1菌在不同培養(yǎng)基中發(fā)酵產(chǎn)物的抗菌活性測(cè)試Fig.7 The anti-microbial effects of the En-1 fermentative products derived from different culture media

基于以上結(jié)構(gòu)篩查和抗菌測(cè)試結(jié)果，#8配方為En-1菌次生代謝物的最佳發(fā)酵培養(yǎng)基。

3 討論

在內(nèi)生菌的分離過程中, 植物樣本的預(yù)處理步驟至關(guān)重要。我們用流水沖洗去掉植物材料表面的塵土，再以添加表面活性劑的水溶液處理材料表面，以便酒精、漂白粉溶液更好移去含蠟質(zhì)的植物樣本（如針葉）上附生菌。本文采用w=2.0%NaClO溶液處理20 min，優(yōu)于HgCl2稀溶液短時(shí)處理的效果。丁小維等[11]用 w=0.1% HgCl2溶液浸泡 8 min來處理紅豆杉的莖，分離得到2株內(nèi)生細(xì)菌，但該文獻(xiàn)未見內(nèi)生放線菌的報(bào)道。我們采用相對(duì)溫和的NaClO代替HgCl2作為主要消毒劑，避免HgCl2對(duì)植物組織的毒性，而且能達(dá)到預(yù)期消毒效果。我們采取的表面消毒程序經(jīng)兩種不同方法（末次清洗的水樣涂板、植物樣本滾動(dòng)的平板培養(yǎng)對(duì)照實(shí)驗(yàn)）的驗(yàn)證，是徹底的、有效的。通過選擇分離培養(yǎng)方法得到4株原核微生物，其中1株放線菌經(jīng)鑒定為鏈霉菌Streptomyces sp.。

通過1H-NMR技術(shù)測(cè)定產(chǎn)物的化學(xué)結(jié)構(gòu)，可知放線菌隨培養(yǎng)條件變化，其次生代謝產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)也發(fā)生改變。雖然波譜分析的仍是混合物，但能給出重要結(jié)構(gòu)信息：通過各成分所含H的不同化學(xué)位移(δ)，推斷放線菌次生代謝物的結(jié)構(gòu)多樣性；提示我們?cè)诤Y選新化合物時(shí)，有目的進(jìn)行發(fā)酵條件的優(yōu)化。一般而言，菌體增長(zhǎng)快的時(shí)期（生物量快速積累時(shí)期）絕非該菌次生代謝物合成旺盛的時(shí)期，初生代謝和次生代謝的不同步是我們?cè)谶M(jìn)行次生代謝物研究時(shí)必需考慮的重要因素[12-13]。可通過改變培養(yǎng)條件，使微生物從初生代謝轉(zhuǎn)入次生代謝，產(chǎn)生多樣化的次生代謝物；也可通過一些前體飼喂或誘導(dǎo)子處理，提高人們所需要的次生代謝物的產(chǎn)量；還可通過基因工程方法改造微生物次生代謝途徑中關(guān)鍵酶，使微生物過量合成和/或積累某種次生代謝物[14]。

內(nèi)生菌次生代謝產(chǎn)物的化學(xué)結(jié)構(gòu)多樣性蘊(yùn)藏著生物活性的多樣性，在制藥業(yè)、農(nóng)業(yè)上具有重要的應(yīng)用潛力。放線菌作為藥用化合物的重要來源，倍受學(xué)者和研發(fā)人員的重視[15]。從傳統(tǒng)來源比如土壤放線菌中篩到的新藥物的速度正在減緩[16-17]，重復(fù)分離到已知化合物的幾率在不斷上升，因此尋找新的放線菌來源變得極為重要。植物內(nèi)生放線菌因其生長(zhǎng)在植物活體內(nèi)，生態(tài)環(huán)境獨(dú)特，與宿主植物共同進(jìn)化并定殖于宿主組織細(xì)胞間隙或細(xì)胞內(nèi)的放線菌必然有獨(dú)特的策略來競(jìng)爭(zhēng)和生存，通常它們會(huì)分泌化學(xué)物質(zhì)或信號(hào)分子來獲取營(yíng)養(yǎng)（但對(duì)宿主植物不會(huì)產(chǎn)生有害影響，二者和平共處）、或者通過誘導(dǎo)宿主產(chǎn)生新的代謝產(chǎn)物來抵御逆境，爭(zhēng)取生存資源，這使得內(nèi)生放線菌成為結(jié)構(gòu)新穎和療效獨(dú)特的藥物先導(dǎo)化合物的重要資源之一。

在這一資源庫(kù)中往往會(huì)發(fā)現(xiàn)一些全新的應(yīng)用價(jià)值很高的抗菌化合物。Strobel研究小組近年曾在澳大利亞北部土著部落附近的藥用植物蛇藤Kennedia nigriscans中分離到一株新的鏈霉菌 Streptomyces NRRL 30562，該菌能產(chǎn)生新穎的多肽抗生素munumbicins A、B、C和D，這些抗生素具有廣譜抗菌以及抗瘧原蟲活性[19]。同一研究小組隨后從澳大利亞北部的有葉蕨類植物Grevillea pteridifolia中分離到一株新的內(nèi)生鏈霉菌Streptomyces sp. NRRL 30566, 它能產(chǎn)生一種具有廣譜抑菌活性的新型抗菌素kakadumycins, 特別針對(duì)G+細(xì)菌抑菌能力強(qiáng)，因此對(duì)治療耐藥性 G+菌引起的感染癥有重要價(jià)值[20]。這些都彰顯了利用植物內(nèi)生放線菌篩選藥用抗菌活性物質(zhì)的巨大潛力[6,21]。

本文報(bào)道的內(nèi)生鏈霉菌En-1能產(chǎn)生抑真菌活性的次生代謝物，具有較大的應(yīng)用潛力。因?yàn)镋n-1生活在植物體內(nèi)、不對(duì)植物產(chǎn)生危害作用, 其產(chǎn)物經(jīng)過與植物（高等生物）漫長(zhǎng)的共進(jìn)化過程，證明是對(duì)高等真核生物是無毒的，即宿主植物作為內(nèi)生菌代謝產(chǎn)物的天然毒性選擇系統(tǒng)，推斷后者對(duì)于高等真核細(xì)胞的生物安全性。有研究認(rèn)為[18], 以內(nèi)生菌為資源庫(kù)，獲得對(duì)人類細(xì)胞低毒藥劑的幾率將大大增加。En-1菌分泌抗絲狀真菌的代謝物，對(duì)于宿主植物而言是有益的，為該裸子植物（紅豆杉）提供抵御真菌感染的物質(zhì)基礎(chǔ)。今后需要進(jìn)一步對(duì)該菌抗菌活性物質(zhì)的化學(xué)結(jié)構(gòu)進(jìn)行研究以及探明其抑菌機(jī)理，特別是活體內(nèi)(in vivo)抑菌機(jī)制。

4 結(jié)論

通過選擇性分離方法從表面消毒的中國(guó)紅豆杉嫩枝、葉中分離得到內(nèi)生鏈霉菌En-1。實(shí)驗(yàn)表明宿主紅豆杉葉浸出物能促進(jìn) En-1菌的體外生長(zhǎng)，而且該菌次生代謝物對(duì)5株標(biāo)準(zhǔn)供試菌中的黑曲霉具有抑制活性。En-1菌株發(fā)酵培養(yǎng)基優(yōu)化實(shí)驗(yàn)并結(jié)合波譜法測(cè)定產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)多樣性，結(jié)果顯示，8# 配方(淀粉 25 g·L-1, KNO31 g·L-1, K2HPO4·3H2O 0.5 g·L-1, NaCl 0.5 g·L-1, FeSO4·7H2O 0.01 g·L-1,MgSO4·7H2O 0.5 g·L-1)為其產(chǎn)生次生代謝物的最佳培養(yǎng)基。

[1] STROBEL G, DAISY B. Bioprospecting for microbial endophytes and their natural products[J]. Microbiology and Molecular Biology Reviews, 2003, 67 (4): 491-502.

[2] 張炯炯．紅豆杉植物資源的開發(fā)利用[J]．生物學(xué)雜志，2000, 17(4):30-31.ZHANG Jiongjiong. The exploitation and utilization of Taxus plant resources [J]. Journal of Biology, 2000, 17(4):30-31.

[3] STIERLE A, STROBEL G, STIERLE D. Taxol and taxane production by Taxomyces andreanae, an endophytic fungus of Pacific yew[J].Science ,1993, 260(5105): 214-216.

[4] CARUSO M, COLOMBO A L, FEDELI L, et al. Isolation of endophytic fungi and actinomycetes taxane producers [J]. Annals of Microbiology, 2000, 50: 3-13.

[5] CARUSO M, COLOMBO A L, CRESPI-PERELLINO N, et al.Studies on a strain of Kitasatospora sp. paclitaxel producer [J]. Annals of Microbiology, 2000, 50: 89-102.

[6] WU Yingying, LU Chunhua, QIAN Xiaoming, et al. Diversities within genotypes, bioactivity and biosynthetic genes of endophytic actinomycetes isolated from three pharmaceutical plants [J]. Current Microbiology, 2009, 59(4): 475-482.

[7] 沈萍,陳向東.微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)[M].4版.北京：高等教育出版社, 2008.SHEN Ping, CHEN Xiangdong. Experiment of Microbiology [M]. 4th ed. Beijing: High Education Press, 2008.

[8] WANG Y, ZHANG Z, Ruan J. Phylogenetic analysis reveals new relationships among members of the genera Microtetraspora and Microbispora [J]. International Journal of Systemic Bacteriology,1996, 46(3): 658-663.

[9] GYANESHWAR P, JAMES EK, MATHAN N, et al. Endophytic colonization of rice by a diazotrophic strain of Serratia marcescens [J].Journal of Bacteriology, 2001, 183(8): 2634-2645.

[10] WANG Y, ZHANG Z S, RUAN J S, et al. Investigation of actinomycete diversity in the tropical rainforests of Singapore[J].Journal of Industrial Microbiology and Biotechnology, 1999,23(3):178-187.

[11] 丁小維, 劉開輝, 鄧百萬, 等. 中國(guó)紅豆杉內(nèi)生細(xì)菌的分離鑒定及活性研究[J]. 微生物學(xué)通報(bào), 2008, 35(10): 1577-1580.DING Xiaowei, LIU Kaihui, DENG Baiwan, et al. The isolation and identification of endophytic bacteria from Taxus chinensis and the studies of their activity[J]. Microbiology Bulletin, 2008, 35(10):1577-1580.

[12] 劉志恒, 姜成林. 放線菌現(xiàn)代生物學(xué)與生物技術(shù)[M]. 北京: 科學(xué)出版社, 2004.LIU Zhiheng, JIANG Chenglin. The Modern Biology and Biotechnology of Actinomycetes [M]. Beijing: Science Press, 2004.

[13] 劉志恒. 放線菌: 微生物藥物的重要資源[J]. 微生物學(xué)通報(bào), 2005,32(6): 143-145.LIU Zhiheng. Actinomycetes: important source of drug[J].Microbiology Bulletin, 2005, 32(6): 143-145.

[14] 周軍, 唐雅君, 張惠展. 放線菌次生代謝途徑的設(shè)計(jì)[J]. 生物工程進(jìn)展, 1999, 19(5): 40-45.ZHOU Jun, TANG Yajun, ZHANG Huizhan. The design of actinomycete secondary metabolic pathways [J]. Progress in Biotechnology, 1999, 19(5): 40-45.

[15] 黃麟, 許嚴(yán)偉, 匡巖巍, 等. 土壤放線菌Streptomyces sp.2215代謝物的分離鑒定及抗腫瘤活性研究[J]. 天然產(chǎn)物研究與開發(fā), 2009,21(2): 235-238.HUANG Lin, XU Yanwei, KUANG Yanwei, et al. Purification and identification of antitumor secondary metabolites from soil Streptomyces sp. 2215[J]. Natural Product Research and Development,2009, 21(2): 235-238.

[16] WANG J, SOISSON SM, YOUNG K, et al. Platensimycin is a selective FabF inhibitor with potent antibiotic properties[J]. Nature, 2006,441(7091): 358-361.

[17] CLARDY J, FISCHBACHM A, WALSH C T. New antibiotics from bacterial natural products[J]. Nature Biotechnology, 2006, 24(12):1541-1550.

[18] 李強(qiáng)，劉軍，周東坡, 等. 植物內(nèi)生菌的開發(fā)與研究進(jìn)展[J]. 生物技術(shù)通報(bào), 2006, 3: 33-37.LI Qiang, LIU Jun, ZHOU Dongpo, et al. Advance on exploitation and research of endophyte [J]. Biotechnology Bulletin, 2006, 3: 33-37.

[19] CASTILLO U F, STROBEL G A, FORD E J, et al. Munumbicins,wide-spectrum antibiotics produced by Streptomyces NRRL 30562,endophytic on Kennedia nigriscans[J]. Microbiology, 2002, 148(9):2675-2685.

[20] CASTILLO U F, JAMES K H, GARY A S, et al. Kakadumycins, novel antibiotics from Streptomyces sp. NRRL 30566, an endophyte of Grevillea pteridifolia [J]. FEMS Microbiology Letters, 2003, 224(2):183-190.

[21] EL-SHATOURY S, ABDULLA H, EL-KARAALY O, et al.Bioactivities of endophytic actinomycetes from selected medicinal plants in the world heritage site of Saint Katherine, Egypt [J].International Journal of Botany, 2006, 2(3): 307-312.