吳功強(qiáng)，趙妍敏，黃 河，來曉瑜

(1.浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第一醫(yī)院骨髓移植中心、血液研究所，浙江杭州310003;2.義烏市中心醫(yī)院血液科，浙江義烏322000)

異基因造血干細(xì)胞移植(allo-HSCT)是目前惡性血液病治愈的唯一有效途徑，但存在移植后移植物抗宿主病(GVHD)、復(fù)發(fā)和免疫重建等移植相關(guān)問題，尤其是如何在防止GVHD的同時(shí)誘導(dǎo)足夠強(qiáng)的移植物抗白血病(GVL)作用，是目前臨床移植工作者最大的難題［1-2］。許多的動物實(shí)驗(yàn)和臨床觀察均提示allo-HSCT后，由于KIR-配體不相合導(dǎo)致供者NK細(xì)胞活化，活化的NK細(xì)胞具有促進(jìn)移植物的植入、阻止T細(xì)胞介導(dǎo)的GVHD、攻擊宿主白血病細(xì)胞發(fā)揮GVL效應(yīng)［3-4］。因此，如何人工改造或修飾KIR活性，使供者的KIR抑制性受體抑制而激活NK細(xì)胞，對改善移植療效具有重要的意義。本研究在建立人NK細(xì)胞的體外培養(yǎng)體系的基礎(chǔ)上，研究單克隆抗體封閉抑制性受體KIR2DL1和KIR2DL2/KIR2DL3后對人NK細(xì)胞功能的影響。

1 材料和方法

1.1 細(xì)胞株 人慢性粒細(xì)胞白血病細(xì)胞株K-562細(xì)胞和急性早幼粒白血病細(xì)胞株NB4細(xì)胞均為本實(shí)驗(yàn)室所提供，人Burkitt淋巴瘤Raji細(xì)胞株由浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第一醫(yī)院血液病研究所提供。

1.2 試劑 RPMI 1640培養(yǎng)基和胎牛血清購于GIBCO公司，重組人白介素-2(rhIL-2)及rhIL-15購于Biolegend公司，非放射性細(xì)胞毒測定試劑盒購于Promega公司，T淋巴細(xì)胞尼龍毛柱為浙江大學(xué)免疫所贈送，絲裂霉素購于Sigma公司，TGF-β1因子ELISA檢測試劑盒購自上海朗頓公司，rhGM-CSF、rhIL-4及 LPS均為浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第一心血管病研究所贈送，KIR2DL1的封閉抗體抗 CD158a單抗及KIR2DL2/KIR2DL3抗體為抗 CD158b單抗購于BD公司，人AB血清購于天津?yàn)笊锕?，F(xiàn)ITC-CD3、PE-CD56購于 Invitrogen公司，X-VIVO 15培養(yǎng)液購于Lonza公司，Rosettesep NK提取試劑盒購自Stem cell公司。

1.3 人NK細(xì)胞分選和培養(yǎng)及鑒定 采用Rosettesep NK提取試劑盒分選人NK細(xì)胞，在含10%人AB血清的X-VIVO 15培養(yǎng)基中加入分選獲得的NK細(xì)胞、200 u/ml的rhIL-2及20 ng/ml的rhIL-15，每隔2～3 d半量換液。將分選所得的NK細(xì)胞加入FITC標(biāo)記的抗CD3和PE標(biāo)記的CD56抗體，在室溫下避光孵育15 min，流式細(xì)胞儀檢測 CD3-CD56+的細(xì)胞比例。同型對照采用分選前的單個(gè)核細(xì)胞。

1.4 樹突狀細(xì)胞(DC)的培養(yǎng) 取新鮮分離的健康成人外周血，收集單個(gè)核細(xì)胞，然后懸浮于無血清RPMI-1640培養(yǎng)基中，將細(xì)胞轉(zhuǎn)移至6孔培養(yǎng)板，貼壁培養(yǎng)2 h。將上清吸掉，然后用37℃預(yù)溫的無血清RPMI-1640培養(yǎng)基洗棄懸浮細(xì)胞，共3遍。在貼壁細(xì)胞中加入rhGM-CSF(20 ng/ml)、rhIL-4(2 ng/ml)、15% 胎牛血清的完全培養(yǎng)基RPMI 1640，隔天半量換液，第5天收集懸浮細(xì)胞作為未成熟DC，加100 ng/ml的LPS繼續(xù)培養(yǎng)2 d收集的細(xì)胞作為成熟DC。

1.5 抗體修飾對NK細(xì)胞殺傷腫瘤細(xì)胞及DC的功能實(shí)驗(yàn) 殺傷實(shí)驗(yàn)采用乳酸脫氫酶釋放法(LDH)，具體步驟參照非放射性細(xì)胞毒測定試劑盒說明書進(jìn)行。

1.6 混合淋巴細(xì)胞反應(yīng)(mixed leukocyte reaction MLR) 取健康志愿成人外周血，收集單個(gè)核細(xì)胞。正常人單個(gè)核細(xì)胞經(jīng)絲裂霉素處理作為刺激細(xì)胞;取同種異體單個(gè)核細(xì)胞，經(jīng)尼龍毛柱純化得到的T淋巴細(xì)胞作為反應(yīng)細(xì)胞，刺激細(xì)胞與反應(yīng)細(xì)胞比例為1∶5。同時(shí)取與反應(yīng)T細(xì)胞同一個(gè)體的外周血，采用Rosettesep NK提取試劑盒分選人NK細(xì)胞，與混合抗體CD158a+b(0、5、10、20 μg/ml)分別共同孵育60 min;然后，加入到混合淋巴細(xì)胞反應(yīng)體系，與T細(xì)胞的比例為1∶5，種入96孔板(用于T淋巴細(xì)胞增殖反應(yīng)的測定)及6孔培養(yǎng)板中(用于測定細(xì)胞因子水平);在培養(yǎng)箱中培養(yǎng)72 h后，在6孔培養(yǎng)板收集培養(yǎng)液上清，-80℃凍存?zhèn)溆?。用CCK-8方法測定，具體步驟參照試劑盒說明書進(jìn)行。

1.7 ELISA定量測定TGF-β1的蛋白質(zhì)表達(dá)水平 在上述混合淋巴細(xì)胞培養(yǎng)3 d后收集上清液，具體按照ELISA試劑盒操作說明書測定。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示，多組均數(shù)之間的比較采用單因素方差分析，兩兩之間的比較采用q檢驗(yàn)。以P＜0.05為差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 人NK細(xì)胞分離鑒定結(jié)果 人NK細(xì)胞分選前，外周血單個(gè)核細(xì)胞中CD3-CD56+細(xì)胞比例占10.30%，分選后提高到86.47%(圖1)。

圖1 人NK細(xì)胞分選前后的比較Fig.1 Percentage of NK cells before/after isolation

2.2 KIR2DL1抗體修飾對NK細(xì)胞殺傷能力的影響 如表1所示，以CD158a單抗封閉KIR2DL1后，NK細(xì)胞對NB4細(xì)胞的殺傷能力增強(qiáng)(8.38% ±5.23%vs 26.51% ±1.48%)，隨抗體濃度的增加而提高，各組間比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05);對Raji細(xì)胞的殺傷活性提高較小，僅 0 μg/ml組與 20 μg/ml組間比較(3.88% ±1.11%vs 13.01% ±6.56%)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，而其余各組間比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05);對K-562細(xì)胞的殺傷作用，則基本沒有變化(P＞0.05)。效靶比均為10∶1。

表1 單抗封閉KIR2DL1后NK細(xì)胞對白血病細(xì)胞的殺傷作用Table 1 Cytotoxicity of NK cell to different leukemia cells after KIR2DL1 blockade(±s，%)

表1 單抗封閉KIR2DL1后NK細(xì)胞對白血病細(xì)胞的殺傷作用Table 1 Cytotoxicity of NK cell to different leukemia cells after KIR2DL1 blockade(±s，%)

NB4細(xì)胞各組間比較，*P＜0.05;Raji細(xì)胞各組間比較，#P＜0.05.

白血病細(xì)胞株抗KIR2DL1抗體/(μg·ml-1 10 20 F值)0 5 29.64 Raji 3.88±1.11# 8.01±2.57 10.65±7.15 13.01±6.56# 4.68 K-562 50.51±5.73 52.18±6.05 48.51±6.41 49.6 NB4 8.38±5.23* 16.01±2.46* 21.01±3.54* 26.51±1.48*8±7.36 0.346

2.3 KIR2DL2/2DL3抗體修飾對NK細(xì)胞殺傷能力的影響 如表2示，以抗體CD158b封閉KIR2DL2/2DL3后，NK細(xì)胞對NB4細(xì)胞的殺傷能力增強(qiáng)(8.72% ±4.27%vs 25.68% ±2.32%)，并隨抗體濃度的增加而提高，各組間差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05);對Raji細(xì)胞的殺傷活性提高較小，僅0 μg/ml組與20 μg/ml組比較(3.05% ±1.67% vs 12.51% ±4.51%)，差異有顯著性(P＜0.05)，而其余各組間比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＞0.05)。對K-562細(xì)胞的作用，則基本沒有變化(P＞0.05)。效靶比均為 10∶1。

表2 單抗封閉KIR2DL2/2DL3后NK細(xì)胞對白血病細(xì)胞的殺傷作用Table 2 Cytotoxicity of NK cell to different leukemia cells after KIR2DL2/2DL3 blockade(±s，%)

表2 單抗封閉KIR2DL2/2DL3后NK細(xì)胞對白血病細(xì)胞的殺傷作用Table 2 Cytotoxicity of NK cell to different leukemia cells after KIR2DL2/2DL3 blockade(±s，%)

NB4細(xì)胞各組間比較，*P＜0.05;Raji細(xì)胞各組間比較，#P＜0.05.

白血病細(xì)胞株抗KIR2DL2/2DL3抗體/(μg·ml-1)F 0 5 10 20值36.34 Raji 3.05±1.67# 7.35±3.47 10.01±6.43 12.51±4.51# 8.13 K-562 49.01±7.26 51.38±4.52 49.22±5.82 46.3 NB4 8.72±4.27* 15.51±2.17* 19.85±2.34* 25.68±2.32*5±5.20 0.75

2.4 KIR2DL1與KIR2DL2/2DL3抗體聯(lián)用對NK細(xì)胞殺傷能力的影響 如表3所示，10 μg/ml抗 CD158a單抗及 10 μg/ml CD158b 單抗封閉KIR后，NK細(xì)胞對NB4細(xì)胞的殺傷能力明顯增強(qiáng)(8.57% ±3.57%vs 23.18% ±3.56%)，2個(gè)抗體具有協(xié)同作用;而對Raji細(xì)胞的作用，雖然兩個(gè)抗體聯(lián)用殺傷能力有所提高(3.74% ±2.35%vs 10.34% ±5.83%)，但沒有達(dá)到統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05);對K-562細(xì)胞的作用，則基本沒有變化，無論是單一抗體還是聯(lián)用，殺傷活性均無明顯改變(P＞0.05)。效靶比均為10∶1。

2.5 NK細(xì)胞對DC的影響 如圖2所示，在效靶比為10∶1的情況下，NK細(xì)胞經(jīng)抗體封閉后，對 DC的殺傷活性明顯提高(2.20% ±1.10%vs 37.59% ±5.06%)，隨封閉抗體濃度的增加而增高，各組間比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。

表3 單抗封閉KIR2DL1和KIR2DL2/2DL3后NK細(xì)胞對白血病細(xì)胞殺傷作用Table 3 Cytotoxicity of NK cell to different leukemia cells after KIR2DL1 and KIR2DL2/2DL3 blockade

圖2 NK細(xì)胞對DC的殺傷作用Fig.2 Cytotoxicity of NK cell to DC

2.6 混合淋巴細(xì)胞反應(yīng)

2.6.1 T細(xì)胞的增殖活性 如圖3所示，抗CD158a與CD158b單抗封閉KIR后，反應(yīng)細(xì)胞的增殖指數(shù)降低(77.85% ±8.31%vs 43.05%±5.95%)。各組與0 μg/ml組比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。NK細(xì)胞與反應(yīng)細(xì)胞比例為1∶5。

圖3 混合淋巴細(xì)胞反應(yīng)Fig.3 Mixed lymphocyte reaction

2.6.2 TGF-β1的表達(dá)水平 如圖4所示，抗CD158a與CD158b單抗封閉KIR后，TGF-β1含量有所提高，隨封閉抗體濃度的提高，各組與0μg/ml組比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。

圖4 混合淋巴細(xì)胞反應(yīng)中TGF-β1含量Fig.4 The levels of TGF-β1 in mixedlymphocyte reaction

3 討論

殺傷細(xì)胞免疫球蛋白樣受體(killer cell immnoglobulin—like receptor，KIR)主要分布在NK細(xì)胞表面，KIR的配體主要為HLA-I類抗原，包括HLA-A、B和C，其中主要為HLA-C類抗原。KIR可分為抑制型和活化型兩大類。由于抑制型KIR與配體的親和性較強(qiáng)，因此在正常情況下，KIR與自身靶細(xì)胞的HLA-I類分子相合，抑制NK細(xì)胞的活化，從而使自身正常細(xì)胞避免自身免疫。而在造血干細(xì)胞移植中，當(dāng)供受者之間存在KIR-配體不相合時(shí)，則KIR的信號傳遞活化NK細(xì)胞功能，溶解靶細(xì)胞，即“丟失自我(missing self)假說［6］。

既往一些臨床研究以及我們在非親緣移植中發(fā)現(xiàn)［3-4，6］，供受者之間 KIR-配體不相合時(shí)產(chǎn)生的活化NK細(xì)胞，具有促植入作用、發(fā)揮GVL效應(yīng)以及減輕GVHD的作用。因此，供者NK細(xì)胞的活化具有十分重要的地位。在動物實(shí)驗(yàn)中證實(shí)，用單克隆抗體封閉抑制性KIR而導(dǎo)致NK細(xì)胞活化，具有促進(jìn)NK細(xì)胞的抗腫瘤效應(yīng)。Tajima等［7］采用 Ly49A阻斷劑可明顯增強(qiáng)Ly49A+NK細(xì)胞對表達(dá)H-2Dd的腫瘤細(xì)胞的殺傷作用。胥昀等［8］研究發(fā)現(xiàn)，以抗體修飾抑制性Ly49受體有助于活化NK細(xì)胞，提高抗腫瘤能力。但是，至今尚未見體外人KIR功能修飾后NK細(xì)胞殺傷活性改變的研究報(bào)道。

CD158分子是KIRs家族成員，其主要成員有CD158a和 CD158b。CD158a分子主要為KIR2DL1，CD158b分子主要為 KIR2DL2/KIR2DL3。這些KIR成員通過結(jié)合靶細(xì)胞的HLA-C位點(diǎn)而抑制NK細(xì)胞的殺傷活性，是NK細(xì)胞表面重要的抑制性受體。我們認(rèn)為通過封閉CD158a及CD158b分子可使KIR抑制性受體無法進(jìn)行抑制性信號的傳遞，從而激活NK細(xì)胞的殺傷活性。

本研究作為KIR功能修飾研究的體外部分，以人的NK細(xì)胞作為研究對象，研究抗體封閉抑制性受體KIR后，NK細(xì)胞殺傷活性的改變。本研究中采用的腫瘤細(xì)胞株為K-562、Raji及NB4細(xì)胞，其中 K-562細(xì)胞表面不表達(dá)HLA-ABC 分子［9］;Raji及 NB4 細(xì)胞表面表達(dá)HLA-ABC分子，而且HLA-C位點(diǎn)均為雜合型。K-562及NB4細(xì)胞均為髓系細(xì)胞株，而Raji為淋系細(xì)胞株。實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示抗體修飾KIR后，NK細(xì)胞對NB4細(xì)胞的殺傷活性明顯增強(qiáng)。對Raji細(xì)胞影響很小。既往臨床研究以及我們在非親緣造血干細(xì)胞移植中表明，在淋系白血病移植中，供受者KIR-配體不相合并不能減少復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)。而在非淋系白血病患者中卻能明顯減少復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)，有研究表明，部分淋系白血病細(xì)胞表面缺乏或降低表達(dá)一些NK細(xì)胞表面活化受體的配體，如淋巴細(xì)胞表面缺乏黏附分子——白細(xì)胞功能相關(guān)抗原-1(leukocyte function antigen-1，LFA-1)、MICA/B和或自然殺傷細(xì)胞活化性配體UL16結(jié)合蛋白(UL16-binding proteins，ULBPs)1-3分子，導(dǎo)致這些淋巴細(xì)胞對NK細(xì)胞的殺傷作用不敏感［10］。本研究發(fā)現(xiàn)，Raji細(xì)胞耐受NK細(xì)胞的殺傷，是否Raji細(xì)胞表面降低或缺乏表達(dá)上述的一些分子的表達(dá)?我們下一步將檢測Raji細(xì)胞及其他淋系細(xì)胞表面的分子表達(dá)，從而來進(jìn)一步論證淋系白血病耐受NK細(xì)胞的殺傷的機(jī)制。人NK細(xì)胞對K-562具有很強(qiáng)的殺傷能力(達(dá)50%左右)，但抗體修飾KIR后，NK細(xì)胞的對K-562殺傷活性并沒有多大改變，這與其表面不表達(dá)HLAABC分子有關(guān)。

我們發(fā)現(xiàn)正常NK細(xì)胞對成熟的DC殺傷活性較低，基本處于耐受狀態(tài)(NK細(xì)胞與DC的KIR-配體相合)，但以抗體封閉KIR抑制性受體后，NK細(xì)胞對DC的殺傷活性明顯提高。原因在于成熟的DC表面高表達(dá)MHC-I分子［11］，因而活化前NK細(xì)胞幾乎不能殺傷成熟的DC，但經(jīng)抗體封閉KIR后導(dǎo)致KIR-配體不相合，活化NK細(xì)胞，從而對DC殺傷活性明顯提高。這說明人為造成KIR-配體不相合所導(dǎo)致的NK細(xì)胞的活化主要是通過殺傷成熟DC，從而減少了DC將抗原遞呈給T細(xì)胞，也減少了T細(xì)胞的活化。

在混合淋巴細(xì)胞反應(yīng)體系中，NK細(xì)胞經(jīng)不同抗體濃度封閉后，T細(xì)胞的增殖活性明顯降低。我們檢測反應(yīng)體系中的TGF-β1表達(dá)水平，在經(jīng)抗體封閉后，該因子的含量明顯提高，可見TGF-β1與T細(xì)胞的增殖受抑相關(guān)。有研究表明在急性GVHD和急性移植物排斥的發(fā)生過程中，除了細(xì)胞以外，細(xì)胞因子也起重要作用［12-13］。Tamber 等［12］發(fā)現(xiàn)，TGF-β1 基因型高表達(dá)者其GVHD發(fā)生率較低，對GVHD有保護(hù)作用。小鼠的異基因BMT實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，激活的供者NK細(xì)胞抑制GVHD的部分原因可能是通過促進(jìn) TGF-β1 產(chǎn)生而致［14］。TGF-β1 是一個(gè)很強(qiáng)的免疫抑制因子，通過影響淋巴細(xì)胞的增殖分化及調(diào)節(jié)其他細(xì)胞因子的產(chǎn)生來發(fā)揮其免疫抑制作用［15-16］。因而，我們可以預(yù)測經(jīng)抗體封閉活化后的NK細(xì)胞能通過分泌TGF-β1，進(jìn)而抑制T細(xì)胞的增殖、活化，這可能也是阻止T細(xì)胞介導(dǎo)的aGVHD發(fā)生的機(jī)制之一。

本實(shí)驗(yàn)從體外角度證實(shí)了對人NK細(xì)胞上的抑制性受體進(jìn)行抗體修飾后可以增強(qiáng)NK細(xì)胞抗腫瘤的能力，并減少T細(xì)胞的活化;推測，這可以減少GVHD的發(fā)生。下一步我們將開展體內(nèi)研究，運(yùn)用小鼠單克隆抗體封閉Ly49受體，在小鼠GVHD模型和白血病骨髓移植模型中研究對NK細(xì)胞的活化作用及對骨髓移植后GVHD和GVL的影響，以及KIR單克隆抗體運(yùn)用于臨床的前期研究。

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