黃 河，劉麗珍

(浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第一醫(yī)院骨髓移植中心，浙江杭州310003)

異基因造血干細(xì)胞移植(allo-hematopoietic stem cell transplantation，allo-HSCT)是目前治愈血液系統(tǒng)惡性腫瘤的有效手段之一，近年來(lái)隨著allo-HSCT技術(shù)的的發(fā)展，移植成功率與長(zhǎng)期生存率都有了很大的提高，但移植物抗宿主病(GVHD)和移植后腫瘤復(fù)發(fā)是影響患者存活率的主要障礙［1］。移植物抗白血病效應(yīng)(GVL)是allo-HSCT治愈血液系統(tǒng)惡性腫瘤的主要機(jī)制。GVHD與GVL效應(yīng)的機(jī)制目前尚未完全明確，但兩者均為由供者T細(xì)胞介導(dǎo)的免疫反應(yīng)。如供者T細(xì)胞廣泛性地作用于受者組織細(xì)胞，則發(fā)生GVHD;如供者T細(xì)胞只針對(duì)異常細(xì)胞(白血病細(xì)胞或其他腫瘤細(xì)胞)則發(fā)揮GVL效應(yīng)［2］。臨床上GVHD與GVL常相伴發(fā)生，但兩者并不完全平行。如何有效控制GVHD的同時(shí)充分發(fā)揮 GVL效應(yīng)，提高allo-HSCT患者的生存率，是造血干細(xì)胞移植領(lǐng)域的熱點(diǎn)與難點(diǎn)問(wèn)題。

1 供者淋巴細(xì)胞輸注

供者淋巴細(xì)胞輸注(donor lymphocyte infusion，DLI)可以消除供者體內(nèi)殘留的白血病細(xì)胞，預(yù)防甚至逆轉(zhuǎn)allo-HSCT后復(fù)發(fā)，是移植后增強(qiáng)GVL效應(yīng)的重要治療方法。而GVHD是DLI主要的并發(fā)癥，適宜的輸注時(shí)機(jī)、輸注量與輸注成分的調(diào)控是避免或減輕GVHD的關(guān)鍵［3］。臨床上采取分次逐級(jí)增量DLI方法，與單次大劑量輸注相比，其發(fā)揮GVL作用所需時(shí)間延長(zhǎng)。一般輸入細(xì)胞數(shù)從106/kg數(shù)量級(jí)開(kāi)始，逐級(jí)增量至發(fā)揮GVL作用，多在DLI后3～7周起效，6個(gè)月以上達(dá)分子水平緩解。逐級(jí)增量DLI并不影響GVL的效應(yīng)強(qiáng)度，但可明顯減少GVHD的發(fā)生概率。改變輸注成分，如調(diào)節(jié)淋巴細(xì)胞中Thl與Th2細(xì)胞亞群比例有利于GVHD與GVL的分離。有研究發(fā)現(xiàn)，移植后輸注Th2細(xì)胞能誘導(dǎo)劑量依賴GVL效應(yīng)，而不增加嚴(yán)重急性GVHD的發(fā)生。增加移植物中Th2細(xì)胞比例，減弱Thl細(xì)胞分泌IFN-γ等細(xì)胞因子，可以減少GVHD的發(fā)生，同時(shí)保留Th2細(xì)胞抗原呈遞功能及調(diào)節(jié)細(xì)胞毒性T細(xì)胞(CTL)的能力，發(fā)揮 GVL 作用［4］。

輸入淋巴細(xì)胞的調(diào)控可以通過(guò)轉(zhuǎn)入“自殺基因”來(lái)實(shí)現(xiàn)。通過(guò)轉(zhuǎn)基因技術(shù)給輸注的供者T細(xì)胞預(yù)先轉(zhuǎn)入一段“自殺基因”片段，如單純皰疹病毒-胸苷激酶(HSV-TK)，轉(zhuǎn)染的T細(xì)胞可被更昔洛韋特異性殺傷，當(dāng)發(fā)生GVHD時(shí)應(yīng)用更昔洛韋清除帶HSV-TK基因的T細(xì)胞，可緩解疾病的臨床癥狀。一項(xiàng)Ⅰ/Ⅱ期臨床試驗(yàn)，在28例接受HLA半相合移植的患者中，不使用GVHD預(yù)防藥物，于移植后第28天開(kāi)始輸注供者帶HSV-TK基因的T細(xì)胞，結(jié)果僅10例患者發(fā)生急性GVHD，這些患者經(jīng)使用更昔洛韋治療后均獲得緩解。研究者認(rèn)為，帶HSVTK基因的T細(xì)胞輸注在半相合移植中可促進(jìn)免疫重建，控制 GVHD的發(fā)生［5］。

2 調(diào)節(jié)性T細(xì)胞

CD4+CD25+調(diào)節(jié)性 T細(xì)胞(regulatory Tcells，Treg)是CD4+T細(xì)胞的一個(gè)亞群，在維持機(jī)體自身免疫耐受，誘導(dǎo)移植耐受等方面發(fā)揮重要作用。Treg細(xì)胞分為天然性和誘導(dǎo)性兩大類:前者在胸腺中經(jīng)歷陰性選擇發(fā)育成熟，在外周通過(guò)細(xì)胞間接觸或分泌細(xì)胞因子的方式控制自身免疫反應(yīng)的發(fā)生;后者由外周CD4+T細(xì)胞受抗原刺激活化產(chǎn)生，主要通過(guò)分泌抑制性細(xì)胞因子控制免疫應(yīng)答［6］。Treg細(xì)胞可能通過(guò)以下機(jī)制抑制T細(xì)胞的活化增殖，進(jìn)行免疫負(fù)調(diào)控:①抑制抗原遞呈細(xì)胞(APC)的抗原呈遞功能;②與靶細(xì)胞直接接觸抑制;③分泌抑制性細(xì)胞因子，如TGF-β、IL-10等;④競(jìng)爭(zhēng)性抑制靶細(xì)胞增殖。Treg免疫標(biāo)志包括表型為CD4+CD25+Foxp3+，同時(shí)表達(dá) CTLA-4與 CD45R等。

動(dòng)物實(shí)驗(yàn)與臨床試驗(yàn)顯示:Treg細(xì)胞可降低GVHD的發(fā)生，而不影響 GVL的效應(yīng)，在allo-HSCT中有一定的應(yīng)用前景。Edinger等［7］在MHC完全不相合的小鼠移植模型研究中發(fā)現(xiàn)，按1∶1回輸供者Treg細(xì)胞和供者同種T細(xì)胞，Treg可抑制供者效應(yīng)性T細(xì)胞的早期擴(kuò)增和遷移至靶器官的數(shù)量，有效地降低GVHD的發(fā)生率和嚴(yán)重度，但不影響T細(xì)胞的活化，而且對(duì)T細(xì)胞體內(nèi)外GVL效應(yīng)都無(wú)顯著影響。Trenado等［8］也發(fā)現(xiàn)，Treg細(xì)胞主要抑制 GVHD相關(guān)的效應(yīng)T細(xì)胞增殖，但并不影響造血和免疫重建，并可部分保留 GVL效應(yīng)。最近，Dilanni等［9］報(bào)道了28例高危血液惡性腫瘤患者行半相合HSCT后，過(guò)繼性輸注Treg，未給予任何免疫抑制劑即可有效地預(yù)防GVHD的發(fā)生，促進(jìn)免疫重建，而且未削弱GVL的效應(yīng)。

天然性Treg細(xì)胞只占外周總T細(xì)胞的5%～10%，如何獲得足夠數(shù)量的Treg成為過(guò)繼性輸注的一大障礙。最近，Hippen［10］等報(bào)道了采用雷帕霉素/TGF-β體外大量誘導(dǎo)并擴(kuò)增Treg細(xì)胞的方法，發(fā)現(xiàn)體外培養(yǎng)擴(kuò)增的Treg細(xì)胞在異基因移植小鼠中發(fā)揮抑制GVHD的作用。此研究為臨床大規(guī)模Treg細(xì)胞的應(yīng)用提供了方法。另外，近年研究發(fā)現(xiàn)，一些藥物如地西他濱、阿扎胞苷、雷帕霉素等可以誘導(dǎo)Fox P3的表達(dá)，提高了受者體內(nèi)Treg細(xì)胞的比例［11］，從而預(yù)防 GVHD的發(fā)生，實(shí)現(xiàn)與 GVL效應(yīng)的分離。

3 NK細(xì)胞

自然殺傷細(xì)胞(natural killer cells，NK細(xì)胞)是淋巴細(xì)胞譜系中不同于T、B淋巴細(xì)胞的一類大顆粒淋巴細(xì)胞，其代表性表型為CD3-CD56+CD16+。NK細(xì)胞具有直接殺傷靶細(xì)胞的效應(yīng)，無(wú)需預(yù)先致敏。NK細(xì)胞功能的發(fā)揮主要依賴于其識(shí)別靶細(xì)胞的受體。NK細(xì)胞可同時(shí)表達(dá)活化型受體(KAR)和抑制受體(KIR)，其殺傷功能取決于表面抑制性受體與活化受體所傳遞信號(hào)的綜合。正常情況下，NK細(xì)胞KIR識(shí)別自身組織表達(dá)的MHC-I類分子，產(chǎn)生殺傷抑制信號(hào)，阻斷殺傷信號(hào)的傳遞，表現(xiàn)為自身組織細(xì)胞不被破壞。當(dāng)靶細(xì)胞表面MHC-I類分子表達(dá)降低、丟失或發(fā)生變異(如細(xì)胞發(fā)生惡性轉(zhuǎn)化、病毒感染等)時(shí)，NK細(xì)胞活化并啟動(dòng)殺傷作用，此即NK細(xì)胞的丟失自我(missing self)識(shí)別模式［12］。

NK細(xì)胞是參與GVL效應(yīng)的重要成員。一系列臨床研究顯示:在去T的allo-HSCT中，尤其對(duì)于CML及AML、HLA-C/KIR不合的患者復(fù)發(fā)率較低［13］。我們的前期研究也發(fā)現(xiàn)在無(wú)關(guān)供者移植患者中，KIR不相合與低復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)相關(guān)。在髓系患者，KIR不合除了與復(fù)發(fā)的風(fēng)險(xiǎn)減少相關(guān)外，還能改善5年生存率［14］。NK細(xì)胞在GVL中的作用在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中已得到證實(shí)。目前認(rèn)為，NK細(xì)胞發(fā)揮GVL效應(yīng)的機(jī)制是通過(guò)“丟失自我”模式實(shí)現(xiàn)的。移植后供者的NK細(xì)胞KIR受體找不到相應(yīng)的MHC配體，NK細(xì)胞活化占優(yōu)勢(shì)，對(duì)殘存的白血病細(xì)胞發(fā)揮殺傷作用。KIR表位不合是引發(fā)GVL的分子基礎(chǔ)，可以作為供者選擇的考慮因素。

抗原遞呈細(xì)胞(APC)活化后表達(dá)共刺激分子并向T細(xì)胞呈遞抗原，進(jìn)而活化T細(xì)胞是GVHD發(fā)生的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。研究發(fā)現(xiàn)，異源反應(yīng)性NK細(xì)胞可以攻擊和去除宿主APC，從而阻止GVHD的發(fā)生。雖然殺傷受者APC對(duì)GVL效應(yīng)有影響，但異源反應(yīng)活性NK細(xì)胞對(duì)腫瘤細(xì)胞有強(qiáng)大的殺傷功能，故 GVL效應(yīng)被保留［15］。NK細(xì)胞在分離GVHD與GVL效應(yīng)中有一定的前景。本研究組發(fā)現(xiàn)［16］，經(jīng)體外培養(yǎng)的人NK細(xì)胞能殺傷不成熟的DC細(xì)胞。NK細(xì)胞對(duì)成熟的DC殺傷活性較低，但以抗體封閉KIR抑制性受體KIR2DL1和(或)KIR2DL2/KIR2DL3后，NK細(xì)胞對(duì)成熟DC的殺傷活性明顯提高。此研究還發(fā)現(xiàn)，封閉人NK細(xì)胞抑制性受體后，NK細(xì)胞殺傷腫瘤細(xì)胞的作用增強(qiáng)。本研究組對(duì)小鼠NK細(xì)胞抑制性受體的封閉實(shí)驗(yàn)也得出了相似的結(jié)論［17］。NK細(xì)胞表面KIR修飾為GVL與GVHD效應(yīng)的分離提供了新思路。

4 樹(shù)突狀細(xì)胞

樹(shù)突狀細(xì)胞(dendritic cells，DC)是功能最強(qiáng)的抗原遞呈細(xì)胞，在移植免疫中，DC啟動(dòng)免疫排斥還是維持免疫耐受取決于它們的起源以及成熟狀態(tài)，成熟DC啟動(dòng)免疫排斥及GVHD反應(yīng)，未成熟(iDC)及淋巴樣DC誘導(dǎo)免疫耐受。HSCT后供者DC細(xì)胞和受體殘存的DC都可直接激活供體T細(xì)胞，特別是CD8+T細(xì)胞的增殖和分化，引起GVHD。因此，通過(guò)清除或滅活受體DC，調(diào)控供體DC的分化以及活化狀態(tài)可以預(yù)防GVHD，誘導(dǎo)免疫耐受［18］。近年來(lái)研究者發(fā)現(xiàn)，iDC在TGF-β1等誘導(dǎo)下可產(chǎn)生調(diào)節(jié)性DC或稱為耐受型DC，這群DC細(xì)胞高表達(dá)TGF-β1和 IL-10;同時(shí)，其可以減少前炎癥細(xì)胞因子 IL-1β、IL-6、TNF-α 和 IL-12p70等的分泌，有利于抑制GVHD的發(fā)生［19］。

供者DC通過(guò)交叉啟動(dòng)同種異基因反應(yīng)性CD8+T細(xì)胞介導(dǎo)GVL，骨髓移植后用腫瘤細(xì)胞裂解物免疫的供者DC作為疫苗［20］，可以促進(jìn)T細(xì)胞的GVL效應(yīng)。盛麗霞等［21］將多藥耐藥基因MDR1轉(zhuǎn)染DC前體細(xì)胞K562，并采用細(xì)胞因子誘導(dǎo)法將K562/MDR1誘導(dǎo)為攜帶有MDR1基因的 DC細(xì)胞。由于MDR1編碼的Pgp蛋白具有免疫原性，MDR-DC可誘導(dǎo)參與針對(duì)Pgp的特異性CTL應(yīng)答。此研究為白血病多藥耐藥的免疫治療與allo-HSCT后過(guò)繼性輸注增強(qiáng)GVL效應(yīng)提供了新靶點(diǎn)。

5 間充質(zhì)干細(xì)胞

間充質(zhì)干細(xì)胞(mesenchymal stem cells，MSCs)是骨髓中除造血干細(xì)胞以外的一類干細(xì)胞，是骨髓基質(zhì)細(xì)胞的前體細(xì)胞，具有自我更新和多向分化的生物學(xué)特性。MSCs具有獨(dú)特的免疫學(xué)特性，它高表達(dá)MHC I類分子、CD44和CD90，低表達(dá)MHCⅡ類分子及Fas配體，不表達(dá) B7-1、B7-2、CD40、CD40L 和 Fas凋亡受體。研究表明，MSCs具有低免疫源性并發(fā)揮免疫調(diào)控作用［22］。MSCs可通過(guò)細(xì)胞與細(xì)胞直接接觸來(lái)抑制T淋巴細(xì)胞的增殖。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)已證實(shí)，MSCs對(duì)GVHD具有預(yù)防和治療作用。多個(gè)臨床研究中心已開(kāi)展 MSCs用于預(yù)防和治療GVHD的Ⅱ期臨床研究。Fang等［23］對(duì)6例激素耐藥的GVHD患者輸注半相合供者或無(wú)關(guān)供體脂肪來(lái)源的MSCs，5例患者GVHD完全緩解，其中4例存活超過(guò)40個(gè)月。Baron等［24］對(duì)20例接受HLA不相合無(wú)關(guān)供者減劑量移植的患者，將第三方來(lái)源的MSCs與供者外周血造血干細(xì)胞共輸注，結(jié)果表明MSCs共輸注能降低GVHD相關(guān)死亡率，且并不減弱GVL效應(yīng)。

6 次要組織相容性抗原

次要組織相容性抗原(minor histocompatibility antigens，mHags)是相對(duì)于主要組織相容性抗原而命名的，mHags由非MHC基因編碼，在移植排斥反應(yīng)中的作用較弱。在異基因造血干細(xì)胞移植中，供受體之間存在等位基因單核苷酸多態(tài)性(SNP)。某些SNP致使編碼同源蛋白的氨基酸不同，蛋白經(jīng)加工處理成多肽，與MHC結(jié)合表達(dá)于受者抗原遞呈細(xì)胞表面，被供者T細(xì)胞作為外源物質(zhì)所識(shí)別，這些多肽即mHags。mHags具有較強(qiáng)的免疫原性，局限表達(dá)于造血細(xì)胞起源細(xì)胞(如HA-1、HA-2)，或單一造血細(xì)胞系的mHags分子(如HB-1)，在體內(nèi)可誘導(dǎo)產(chǎn)生特異性細(xì)胞毒性T細(xì)胞，對(duì)白血病或淋巴瘤細(xì)胞發(fā)揮細(xì)胞毒作用，對(duì)非造血細(xì)胞無(wú)細(xì)胞毒作用，從而增強(qiáng)GVL效應(yīng)，不增加GVHD風(fēng)險(xiǎn)，實(shí)現(xiàn) GVL效應(yīng)與 GVHD的分離［25］。利用mHags的特性，臨床應(yīng)用包括:輸注mHags特異性T細(xì)胞進(jìn)行過(guò)繼性免疫治療，mHags特異性T細(xì)胞受體(TCR)基因轉(zhuǎn)導(dǎo)以及mHags疫苗的開(kāi)發(fā)［26］。

7 腫瘤疫苗

腫瘤特異性抗原或腫瘤相關(guān)抗原可以作為腫瘤疫苗，刺激供者T細(xì)胞產(chǎn)生特異性的細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞，通過(guò)特異性的免疫應(yīng)答殺傷白血病細(xì)胞，發(fā)揮GVL作用，而不引起GVHD。目前發(fā)現(xiàn)的腫瘤特異性抗原有 P21、ras、bcr/abl、PML/RARα;腫瘤相關(guān)性抗原有蛋白酶3和WT-1(wilms瘤基因)［27］。研究表明，白血病細(xì)胞高表達(dá)WT-1等非多態(tài)性腫瘤相關(guān)抗原。正常供者WT-1特異性CD8+細(xì)胞毒性T細(xì)胞(CTL)比例很低，體外擴(kuò)增的CTL可溶解人白血病細(xì)胞，抑制白血病克隆形成，抑制人白血病細(xì)胞植入NOD/SCID小鼠，對(duì)正常造血干細(xì)胞未見(jiàn)細(xì)胞毒作用。Bornhauser等［28］給14例患者預(yù)防性地輸注由CML相關(guān)抗原肽段PR1、WT-1和ABL免疫產(chǎn)生的CTL，隨訪1年沒(méi)有發(fā)現(xiàn)GVHD或疾病的復(fù)發(fā)。

另外，細(xì)胞因子如白細(xì)胞介素、干擾素和腫瘤壞死因子等在GVHD發(fā)病及GVL的作用中也起到很重要的作用。國(guó)內(nèi)外其他研究和我們的研究［29-30］都表明，細(xì)胞因子及細(xì)胞因子受體基因多態(tài)性同GVHD和/或移植預(yù)后顯著相關(guān)。細(xì)胞因子基因多態(tài)性直接影響個(gè)體體內(nèi)細(xì)胞因子的水平，而移植受者個(gè)體間的不同細(xì)胞因子水平將影響GVHD的發(fā)生與移植效果。動(dòng)物研究表明，IL-11、IL-12、IL-18及角質(zhì)細(xì)胞生長(zhǎng)因子(KGF)能選擇性地抑制T細(xì)胞介導(dǎo)的GVHD，同時(shí)保留GVL作用。細(xì)胞因子如IL-12、KGF等也可能作為GVHD與GVL的分離靶點(diǎn)。

總之，隨著近年來(lái)對(duì)移植免疫機(jī)制研究的深入，GVHD與GVL的分離策略不斷取得了新的進(jìn)展，目前采取一系列臨床手段進(jìn)行干預(yù)且取得了一定效果，但更多的手段仍處在體外實(shí)驗(yàn)及在動(dòng)物模型階段。采取何種方法用于臨床治療能最大程度地減少GVHD的發(fā)生，同時(shí)加強(qiáng)GVL效應(yīng)，仍需進(jìn)一步的研究。

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