趙 毅，蔡 真 綜述

(浙江大學醫(yī)學院附屬第一醫(yī)院骨髓移植中心，浙江杭州310003)

隨著現代醫(yī)學的發(fā)展，器官移植越來越多地成為了治療惡性疾病的手段，為患者獲得新生提供了機會。可是，隨著器官移植手術的廣泛開展，移植后主要并發(fā)癥之一，移植排異極大影響了移植效果，增加了患者死亡率，阻礙了移植醫(yī)學的發(fā)展。由于器官移植是人為引入外來器官，因此不可避免帶來異己抗原的識別問題。其中，Toll樣受體(Toll-like receptors，TLRs)是微生物入侵后預警免疫系統(tǒng)必需的天然免疫受體，可對病原相關的分子模式(pathogenassociated molecular pattern，PAMP)進行識別，其與炎癥和自身免疫性疾病的發(fā)生密切相關，在天然免疫防御中起重要作用，此外，新近的研究表明，TLRs還參與同種異型器官移植過程中的排斥反應。本文對TLR4在器官移植排異發(fā)生過程中所起的具體作用做一綜述。

1 TLR4在內毒素誘導的信號轉導中起主導作用

TLR家族到目前為止共發(fā)現有13類受體，其中對由 Medzhitov等人在1997年發(fā)現的TLR4分子的研究最為深入和全面。TLR4廣泛表達在各種細胞表面，其既包括非特異性免疫細胞，如巨噬細胞、樹突細胞、中性粒細胞和肥大細胞，又包括介導特異性免疫反應的T淋巴細胞和B淋巴細胞。此外，TLR4在人皮膚角質細胞、氣道上皮細胞、胚腎細胞和某些小腸上皮細胞等非淋巴細胞表面也可檢測到。

隨著對TLR4的分子結構、識別受體、內毒素(LPS)誘導的信號傳導途徑及基因缺陷型動物模型等研究的深入，TLR4在機體免疫系統(tǒng)中的重要性也日益顯現。TLR4作為識別細菌共有成分的形態(tài)識別受體(pattern recognition receptors，PRRs)，在LPS誘導的信號轉導中起主導作用，TLR4是識別LPS的主要受體，還能被一些內源性配體如熱休克蛋白(heat shock proteins，HSP)、纖維連接蛋白 A結構域(fibronectin A domain)等活化。在 TLR4 的基因上，即使僅出現一個堿基的突變，也會導致宿主對革蘭陰性菌的反應能力嚴重喪失。TLR4基因缺失患者對LPS呈免疫耐受狀態(tài)。LPS作為革蘭氏陰性菌外膜成分，先與血清中脂多糖結合蛋白(lipopolysaccharide binding protein，LBP)結合后再與CD14形成復合物，此復合物中的 LPS解聚后與 TLR4結合，導致TLR4的聚合而活化，在MD-2的輔助下，活化的TLR4通過其胞漿區(qū)Toll/IL-1受體同源區(qū)(Toll/IL-1 receptor homologous region，TIR)，與胞漿內接頭蛋白MyD88(myeloid differentiation protein，髓樣分化蛋白)的C-端TIR結合形成復合物，再通過MyD88的N-端死亡結構域(death domain，DD)結合 IL-1受體相關激酶(IL-1 receptor associated kinase，IRAK)，二者作用導致IRAK的自身磷酸化，從而激活腫瘤壞死因子受體相關因子-6(TNF-αreceptor associated factor 6，TRAF-6)，活化的IRAK與TRAF6結合后，可使TAK1(即TGF-β活化的激酶)活化，從而通過IκB激酶級聯(lián)反應，最后導致轉錄因子AP-1(activating protein-1)家族的成員Jun和fos活化。而NF-кB和AP-1的活化均可導致炎癥因子如TNF-α、IL-1、IL-6和NO等的大量表達，介導炎癥反應。其信號轉導可以介導B7家族成員表達活化，進而通過抗原遞呈細胞(antigen presenting cells，APC)使 T細胞增殖及分化。這條途徑即MyD88依賴信號傳導途徑。此外，LPS/TLR4信號的傳導還可以通過另外一條通路MyD88非依賴信號傳導途徑(TRIF依賴途徑):TRIF(TIR domaincontainingadaptor molecule-1，TICAM-1)全稱為TLR樣受體相關的干擾素活化子，也稱含有TIR的接頭分子。TRIF相關的接頭分子(TRIF-related adaptor molecule，TRAM)在TLR4的信號傳遞途徑中起到輔助TRIF傳導信號的作用。激活核糖體失活蛋白(ribosome-inactivating protein，RIP)從而激活 IкB激酶(IKK)。干擾素調節(jié)因子 3(interferon regulation factor 3，IRF3)是轉錄因子，是TRIF依賴途徑的最終效應分子，可引起細胞內的終活化子NF-κB分子的激活，引發(fā)機體一系列的反應。在此信號通路中，如果TLR發(fā)生變異，則信號傳導受阻，機體不能產生免疫應答。

2 T細胞的活化決定器官移植排斥的發(fā)生

遺傳基因不同的個體之間的器官移植，由于供、受體移植抗原的不同，既可引起宿主的排斥反應，又可引起供體來源的移植物抗宿主病(graft-versus-host disease，GVHD)。在這個過程中，異種T細胞活化是移植反應中的關鍵環(huán)節(jié)，它的活化需要2個信號，第一信號是抗原遞呈細胞向T淋巴細胞遞呈處理過的抗原肽復合物，第二信號是來自APC的CD80、CD86和CD40等共刺激分子的共刺激信號。近來研究認為，在T細胞反應的早期，當T細胞識別APCs遞呈的抗原時，APCs是否能夠表達足夠的CD86、CD80和CD40等共刺激分子決定了T細胞是否產生免疫應答，或是未被活化導致凋亡或無能。T淋巴細胞只有在第一、第二信號共同刺激下才能被激活和發(fā)生增殖，從而啟動由淋巴細胞、細胞因子和補體等多因素參與的移植免疫排斥反應。

目前，移植免疫的研究主要集中在T細胞和B細胞等特異性免疫領域，雖然取得了顯著的成就，但仍未能完全解決移植中的一些關鍵問題。根據文獻報道和我們的臨床經驗，在HLA位點相合的造血干細胞移植中，II-IV急性GVHD發(fā)病率高達30%以上，而且隨HLA不合程度增加，GVHD發(fā)病率及嚴重程度明顯增高。即使早期應用霉酚酸酯(mycophenolatemofetil，MMF)、環(huán) 孢 素 A(eyclosporine A，CsA)等多種免疫抑制劑，仍有很多移植術后的患者發(fā)生難以控制的GVHD。Rachel等對 23 個以上的臨床研究進行總結，發(fā)現器官移植后受者體內新生的抗HLA抗體與急性和慢性排斥的增加有關聯(lián)，其可降低腎臟、心臟、肺、肝和角膜移植后移植物的存活率。而HLAⅠ和Ⅱ型抗體似乎均為損害移植物的抗體，大多數研究均提示供體的特異性抗體與移植物排斥有關。檢測移植后體內HLA抗體可以預測患者異基因排斥的發(fā)生情況，幫助鑒別移植物的無能是免疫性還是非免疫性因素所致。

異基因造血干細胞移植后宿主發(fā)生GVHD，主要是移植物中的成熟T細胞被宿主的異型組織相容性抗原(包括主要與次要相容性抗原)所激活，增殖分化為效應T細胞。這些激活的效應細胞對宿主的組織和器官發(fā)動免疫攻擊，從而導致GVHD的發(fā)生。所以，為了降低宿主GVHD的嚴重程度，移植前需要對供受者的主要組織相容性抗原進行配型，從而增加移植的成功率。此外，尋找影響移植后GVHD發(fā)生的其他因素也成為了關注的重點。

3 TLR4在器官移植排斥中的重要作用

人TLR4基因有Asp299Gly和Thy399Ile兩個單核苷酸多態(tài)性(single nucleotide polymorphisms，SNP)位點，其與TLR介導的免疫反應減弱有關。在TLR4突變體移植受者中，接受肺移植后發(fā)生急性排斥反應的概率小，發(fā)病率為44%，而正常TLR4基因表型的移植受者發(fā)病率為 71%。在腎移植中，TLR4 突變體受者的急性移植排斥發(fā)病率為7.4%，野生型受者發(fā)病率為26.1%，明顯高于前者。此外，有學者證實發(fā)生Asp299Gly變異的個體，易受到革蘭氏陰性細胞感染的威脅。也有研究者發(fā)現，TLR4突變的腎移植受者，其發(fā)生急性排斥的風險要比TLR4正常人群小，而且不易發(fā)展為動脈粥樣硬化。在對心臟移植術后患者進行研究后顯示，TLR4表達水平高的受者心臟發(fā)生慢性排斥反應的風險要明顯小于TLR4低表達患者，這說明TLR4參與了心臟移植過程的調控。在MHC不匹配的小鼠間進行同種異型心臟移植研究發(fā)現，除了TLR3以外，所有TLRs信號途徑都以MyD88作為共同的信號連接蛋白。MyD88缺陷小鼠盡管活化T細胞的功能受損，而發(fā)生慢性移植排斥反應的受者其單核細胞TLR4的表達上調，IL-12和TNF-α的分泌增加，依然可以引發(fā)移植排斥反應，說明抗原特異性的免疫反應仍然是決定排斥或耐受的關鍵，也說明免疫調節(jié)是一個很復雜的過程。

TLR4參與移植排斥的可能機制是:抗原遞呈細胞表面的 TLR4與配體結合后，通過MyD88依賴性或非依賴信號途徑激活NF-κB，誘導機體釋放相關免疫因子，促進了樹突狀細胞、單核細胞等APC成熟，并上調MHC-Ⅱ及CD80、CD86等共刺激分子的表達，提供了T細胞活化必須的第二信號，APC移行至淋巴結，并通過抗原組織相容性復合物(MHC)的遞呈作用刺激特異性T細胞，激活初始型T細胞，使其增殖分化為效應細胞，產生炎癥細胞因子，引發(fā)一系列反應，最后對宿主組織或移植物產生破壞。進一步研究發(fā)現，TLR激活的APCs分泌能誘導TH1分化的重要細胞因子IL-12，促進CD4+T細胞向TH1或TH2型細胞分化，不同的異種抗原通過結合不同的TLRs，引發(fā)不同的免疫反應，而效應性T細胞向不同的方向分化決定了免疫反應的差異。如低劑量LPS易誘發(fā)Th2免疫反應，而高劑量LPS則誘發(fā)Th1免疫反應。大多數的學者認為，TLR信號主要引起Th1免疫反應。TH1型細胞主要分泌細胞因子IFN-γ、IL-2等，并主要參與細胞免疫，增加移植物的排斥;TH2型細胞主要分泌細胞因子IL-4、IL-10。一般認為T細胞Thl亞群向Th2亞群漂移，可以改變移植物局部的免疫反應，抑制細胞介導的排斥反應。由此可見，TLRs在誘導獲得性免疫和對移植物排斥反應的過程中起著重要橋梁作用。

Goldstein等在小鼠皮膚移植模型實驗中發(fā)現，TLR依賴的信號傳導途徑能夠誘導DC細胞成熟，誘導CD8+T細胞的活化，從而激發(fā)異基因免疫反應。這表明天然免疫系統(tǒng)在異基因移植抗原識別中也起著重要作用。由此可見，TLRs不僅在機體固有免疫應答中發(fā)揮重要作用，同時也是連接固有免疫與適應性免疫的橋梁。

為了防治GVHD和移植排斥，臨床使用多種免疫抑制劑，大多主要作用于T淋巴細胞，取得了較好的療效，但同時也提高了感染和移植后腫瘤復發(fā)的風險。雖然供受者之間的HLA位點不相合是GVHD的重要危險因素，但是細菌感染也是GVHD的主要病因之一。革蘭氏陰性菌及其內毒素成分LPS，在小鼠骨髓移植模型中已經被發(fā)現與GVHD發(fā)生有關。接受LPS耐受供者骨髓的小鼠GVHD嚴重情況明顯低于接受LPS敏感供者的小鼠。當細菌通過腸黏膜后，在供者T細胞分泌的炎性因子的作用下，LPS激活巨噬細胞分泌TNF-α等效應分子。而且在小鼠移植模型中，內毒素血癥和巨噬細胞活化與GVHD的發(fā)病機制密切相關。Elmaagacli等發(fā)現，在造血干細胞移植中，TLR4基因的突變與嚴重GVHD的發(fā)病率相關。TLR4基因的突變可以調控造血干細胞移植患者的免疫反應能力。Lorenz等通過對237名造血干細胞移植患者的TLR基因多態(tài)性分析后認為，TLR4基因的突變可以減少急性GVHD的發(fā)生，但是這種突變增加了革蘭氏陰性菌感染的幾率。以上眾多研究表明，TLR4在非特異性免疫中可廣泛識別配體，既可針對入侵的病原體，也可識別改變的自身成分，充分顯示了TLR4在識別危險信號并誘發(fā)機體免疫反應中的重要性。

Nomura等還發(fā)現，TLR4 表達的變化會影響機體對內毒素的耐受性。用不同劑量LPS二次重復刺激小鼠腹腔巨噬細胞，發(fā)現炎癥因子的分泌與LPS的劑量和LPS處理后的時間呈依賴性減少;再者，TLR4的表達在1 h內開始呈持續(xù)性梯度下降，并保持24 h，而炎癥因子的分泌與TLR4下調呈正相關，這可能是內毒素耐受程度與TLR4的下調程度呈正相關的機制。Manicassamy等發(fā)現，MyD88 是介導TLR4信號轉導通路中的重要環(huán)節(jié)，而MyD88功能缺失則導致TLR信號的表達缺陷。MyD88缺陷引起移植物排斥減弱的機制是DC成熟受阻，從而導致T細胞增殖的障礙及Th1免疫反應減弱，但同時檢測IL-4、同種IgG1時卻發(fā)現并未影響到Th2免疫反應。由上可見，TLR4依賴的內毒素信號傳導通路中的某些環(huán)節(jié)發(fā)生改變將不同程度的產生對LPS的耐受性。這一特點將對我們在控制急性GVHD中細胞因子“瀑布樣效應”起到一定的啟示作用。

4 展望

TLR4信號傳導途徑與機體器官移植后的免疫排斥反應有密不可分的聯(lián)系。研究TLR4信號途徑如何通過調控APC成熟、活化T細胞、引發(fā)免疫攻擊等具體機制以及探討TLR4對誘導移植免疫耐受的重要影響等，將幫助我們在以后的臨床治療中針對個體制定策略，預防和治療同種器官移植后患者免疫排斥反應。同時也可能為將來針對TLR4相關免疫抑制靶點研發(fā)出高效免疫抑制藥物，為減輕移植排斥提供新的治療手段。

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