黃 河，劉麗珍

(浙江大學醫(yī)學院附屬第一醫(yī)院骨髓移植中心，浙江杭州310003)

異基因造血干細胞移植(allo-hematopoietic stem cell transplantation，allo-HSCT)是目前治愈血液系統(tǒng)惡性腫瘤的有效手段之一，近年來隨著allo-HSCT技術(shù)的的發(fā)展，移植成功率與長期生存率都有了很大的提高，但移植物抗宿主病(GVHD)和移植后腫瘤復發(fā)是影響患者存活率的主要障礙。移植物抗白血病效應(GVL)是allo-HSCT治愈血液系統(tǒng)惡性腫瘤的主要機制。GVHD與GVL效應的機制目前尚未完全明確，但兩者均為由供者T細胞介導的免疫反應。如供者T細胞廣泛性地作用于受者組織細胞，則發(fā)生GVHD;如供者T細胞只針對異常細胞(白血病細胞或其他腫瘤細胞)則發(fā)揮GVL效應。臨床上GVHD與GVL常相伴發(fā)生，但兩者并不完全平行。如何有效控制GVHD的同時充分發(fā)揮 GVL效應，提高allo-HSCT患者的生存率，是造血干細胞移植領(lǐng)域的熱點與難點問題。

1 供者淋巴細胞輸注

供者淋巴細胞輸注(donor lymphocyte infusion，DLI)可以消除供者體內(nèi)殘留的白血病細胞，預防甚至逆轉(zhuǎn)allo-HSCT后復發(fā)，是移植后增強GVL效應的重要治療方法。而GVHD是DLI主要的并發(fā)癥，適宜的輸注時機、輸注量與輸注成分的調(diào)控是避免或減輕GVHD的關(guān)鍵。臨床上采取分次逐級增量DLI方法，與單次大劑量輸注相比，其發(fā)揮GVL作用所需時間延長。一般輸入細胞數(shù)從10/kg數(shù)量級開始，逐級增量至發(fā)揮GVL作用，多在DLI后3～7周起效，6個月以上達分子水平緩解。逐級增量DLI并不影響GVL的效應強度，但可明顯減少GVHD的發(fā)生概率。改變輸注成分，如調(diào)節(jié)淋巴細胞中Thl與Th2細胞亞群比例有利于GVHD與GVL的分離。有研究發(fā)現(xiàn)，移植后輸注Th2細胞能誘導劑量依賴GVL效應，而不增加嚴重急性GVHD的發(fā)生。增加移植物中Th2細胞比例，減弱Thl細胞分泌IFN-γ等細胞因子，可以減少GVHD的發(fā)生，同時保留Th2細胞抗原呈遞功能及調(diào)節(jié)細胞毒性T細胞(CTL)的能力，發(fā)揮 GVL 作用。

輸入淋巴細胞的調(diào)控可以通過轉(zhuǎn)入“自殺基因”來實現(xiàn)。通過轉(zhuǎn)基因技術(shù)給輸注的供者T細胞預先轉(zhuǎn)入一段“自殺基因”片段，如單純皰疹病毒-胸苷激酶(HSV-TK)，轉(zhuǎn)染的T細胞可被更昔洛韋特異性殺傷，當發(fā)生GVHD時應用更昔洛韋清除帶HSV-TK基因的T細胞，可緩解疾病的臨床癥狀。一項Ⅰ/Ⅱ期臨床試驗，在28例接受HLA半相合移植的患者中，不使用GVHD預防藥物，于移植后第28天開始輸注供者帶HSV-TK基因的T細胞，結(jié)果僅10例患者發(fā)生急性GVHD，這些患者經(jīng)使用更昔洛韋治療后均獲得緩解。研究者認為，帶HSVTK基因的T細胞輸注在半相合移植中可促進免疫重建，控制 GVHD的發(fā)生。

2 調(diào)節(jié)性T細胞

CD4CD25調(diào)節(jié)性 T細胞(regulatory Tcells，Treg)是CD4T細胞的一個亞群，在維持機體自身免疫耐受，誘導移植耐受等方面發(fā)揮重要作用。Treg細胞分為天然性和誘導性兩大類:前者在胸腺中經(jīng)歷陰性選擇發(fā)育成熟，在外周通過細胞間接觸或分泌細胞因子的方式控制自身免疫反應的發(fā)生;后者由外周CD4T細胞受抗原刺激活化產(chǎn)生，主要通過分泌抑制性細胞因子控制免疫應答。Treg細胞可能通過以下機制抑制T細胞的活化增殖，進行免疫負調(diào)控:①抑制抗原遞呈細胞(APC)的抗原呈遞功能;②與靶細胞直接接觸抑制;③分泌抑制性細胞因子，如TGF-β、IL-10等;④競爭性抑制靶細胞增殖。Treg免疫標志包括表型為CD4CD25Foxp3，同時表達 CTLA-4與 CD45R等。

動物實驗與臨床試驗顯示:Treg細胞可降低GVHD的發(fā)生，而不影響 GVL的效應，在allo-HSCT中有一定的應用前景。Edinger等在MHC完全不相合的小鼠移植模型研究中發(fā)現(xiàn)，按1∶1回輸供者Treg細胞和供者同種T細胞，Treg可抑制供者效應性T細胞的早期擴增和遷移至靶器官的數(shù)量，有效地降低GVHD的發(fā)生率和嚴重度，但不影響T細胞的活化，而且對T細胞體內(nèi)外GVL效應都無顯著影響。Trenado等也發(fā)現(xiàn)，Treg細胞主要抑制 GVHD相關(guān)的效應T細胞增殖，但并不影響造血和免疫重建，并可部分保留 GVL效應。最近，Dilanni等報道了28例高危血液惡性腫瘤患者行半相合HSCT后，過繼性輸注Treg，未給予任何免疫抑制劑即可有效地預防GVHD的發(fā)生，促進免疫重建，而且未削弱GVL的效應。

天然性Treg細胞只占外周總T細胞的5%～10%，如何獲得足夠數(shù)量的Treg成為過繼性輸注的一大障礙。最近，Hippen等報道了采用雷帕霉素/TGF-β體外大量誘導并擴增Treg細胞的方法，發(fā)現(xiàn)體外培養(yǎng)擴增的Treg細胞在異基因移植小鼠中發(fā)揮抑制GVHD的作用。此研究為臨床大規(guī)模Treg細胞的應用提供了方法。另外，近年研究發(fā)現(xiàn)，一些藥物如地西他濱、阿扎胞苷、雷帕霉素等可以誘導Fox P3的表達，提高了受者體內(nèi)Treg細胞的比例，從而預防 GVHD的發(fā)生，實現(xiàn)與 GVL效應的分離。

3 NK細胞

自然殺傷細胞(natural killer cells，NK細胞)是淋巴細胞譜系中不同于T、B淋巴細胞的一類大顆粒淋巴細胞，其代表性表型為CD3CD56CD16。NK細胞具有直接殺傷靶細胞的效應，無需預先致敏。NK細胞功能的發(fā)揮主要依賴于其識別靶細胞的受體。NK細胞可同時表達活化型受體(KAR)和抑制受體(KIR)，其殺傷功能取決于表面抑制性受體與活化受體所傳遞信號的綜合。正常情況下，NK細胞KIR識別自身組織表達的MHC-I類分子，產(chǎn)生殺傷抑制信號，阻斷殺傷信號的傳遞，表現(xiàn)為自身組織細胞不被破壞。當靶細胞表面MHC-I類分子表達降低、丟失或發(fā)生變異(如細胞發(fā)生惡性轉(zhuǎn)化、病毒感染等)時，NK細胞活化并啟動殺傷作用，此即NK細胞的丟失自我(missing self)識別模式。

NK細胞是參與GVL效應的重要成員。一系列臨床研究顯示:在去T的allo-HSCT中，尤其對于CML及AML、HLA-C/KIR不合的患者復發(fā)率較低。我們的前期研究也發(fā)現(xiàn)在無關(guān)供者移植患者中，KIR不相合與低復發(fā)風險相關(guān)。在髓系患者，KIR不合除了與復發(fā)的風險減少相關(guān)外，還能改善5年生存率。NK細胞在GVL中的作用在動物實驗中已得到證實。目前認為，NK細胞發(fā)揮GVL效應的機制是通過“丟失自我”模式實現(xiàn)的。移植后供者的NK細胞KIR受體找不到相應的MHC配體，NK細胞活化占優(yōu)勢，對殘存的白血病細胞發(fā)揮殺傷作用。KIR表位不合是引發(fā)GVL的分子基礎(chǔ)，可以作為供者選擇的考慮因素。

抗原遞呈細胞(APC)活化后表達共刺激分子并向T細胞呈遞抗原，進而活化T細胞是GVHD發(fā)生的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。研究發(fā)現(xiàn)，異源反應性NK細胞可以攻擊和去除宿主APC，從而阻止GVHD的發(fā)生。雖然殺傷受者APC對GVL效應有影響，但異源反應活性NK細胞對腫瘤細胞有強大的殺傷功能，故 GVL效應被保留。NK細胞在分離GVHD與GVL效應中有一定的前景。本研究組發(fā)現(xiàn)，經(jīng)體外培養(yǎng)的人NK細胞能殺傷不成熟的DC細胞。NK細胞對成熟的DC殺傷活性較低，但以抗體封閉KIR抑制性受體KIR2DL1和(或)KIR2DL2/KIR2DL3后，NK細胞對成熟DC的殺傷活性明顯提高。此研究還發(fā)現(xiàn)，封閉人NK細胞抑制性受體后，NK細胞殺傷腫瘤細胞的作用增強。本研究組對小鼠NK細胞抑制性受體的封閉實驗也得出了相似的結(jié)論。NK細胞表面KIR修飾為GVL與GVHD效應的分離提供了新思路。

4 樹突狀細胞

樹突狀細胞(dendritic cells，DC)是功能最強的抗原遞呈細胞，在移植免疫中，DC啟動免疫排斥還是維持免疫耐受取決于它們的起源以及成熟狀態(tài)，成熟DC啟動免疫排斥及GVHD反應，未成熟(iDC)及淋巴樣DC誘導免疫耐受。HSCT后供者DC細胞和受體殘存的DC都可直接激活供體T細胞，特別是CD8T細胞的增殖和分化，引起GVHD。因此，通過清除或滅活受體DC，調(diào)控供體DC的分化以及活化狀態(tài)可以預防GVHD，誘導免疫耐受。近年來研究者發(fā)現(xiàn)，iDC在TGF-β1等誘導下可產(chǎn)生調(diào)節(jié)性DC或稱為耐受型DC，這群DC細胞高表達TGF-β1和 IL-10;同時，其可以減少前炎癥細胞因子 IL-1β、IL-6、TNF-α 和 IL-12p70等的分泌，有利于抑制GVHD的發(fā)生。

供者DC通過交叉啟動同種異基因反應性CD8T細胞介導GVL，骨髓移植后用腫瘤細胞裂解物免疫的供者DC作為疫苗，可以促進T細胞的GVL效應。盛麗霞等將多藥耐藥基因MDR1轉(zhuǎn)染DC前體細胞K562，并采用細胞因子誘導法將K562/MDR1誘導為攜帶有MDR1基因的 DC細胞。由于MDR1編碼的Pgp蛋白具有免疫原性，MDR-DC可誘導參與針對Pgp的特異性CTL應答。此研究為白血病多藥耐藥的免疫治療與allo-HSCT后過繼性輸注增強GVL效應提供了新靶點。

5 間充質(zhì)干細胞

間充質(zhì)干細胞(mesenchymal stem cells，MSCs)是骨髓中除造血干細胞以外的一類干細胞，是骨髓基質(zhì)細胞的前體細胞，具有自我更新和多向分化的生物學特性。MSCs具有獨特的免疫學特性，它高表達MHC I類分子、CD44和CD90，低表達MHCⅡ類分子及Fas配體，不表達 B7-1、B7-2、CD40、CD40L 和 Fas凋亡受體。研究表明，MSCs具有低免疫源性并發(fā)揮免疫調(diào)控作用。MSCs可通過細胞與細胞直接接觸來抑制T淋巴細胞的增殖。動物實驗已證實，MSCs對GVHD具有預防和治療作用。多個臨床研究中心已開展 MSCs用于預防和治療GVHD的Ⅱ期臨床研究。Fang等對6例激素耐藥的GVHD患者輸注半相合供者或無關(guān)供體脂肪來源的MSCs，5例患者GVHD完全緩解，其中4例存活超過40個月。Baron等對20例接受HLA不相合無關(guān)供者減劑量移植的患者，將第三方來源的MSCs與供者外周血造血干細胞共輸注，結(jié)果表明MSCs共輸注能降低GVHD相關(guān)死亡率，且并不減弱GVL效應。

6 次要組織相容性抗原

次要組織相容性抗原(minor histocompatibility antigens，mHags)是相對于主要組織相容性抗原而命名的，mHags由非MHC基因編碼，在移植排斥反應中的作用較弱。在異基因造血干細胞移植中，供受體之間存在等位基因單核苷酸多態(tài)性(SNP)。某些SNP致使編碼同源蛋白的氨基酸不同，蛋白經(jīng)加工處理成多肽，與MHC結(jié)合表達于受者抗原遞呈細胞表面，被供者T細胞作為外源物質(zhì)所識別，這些多肽即mHags。mHags具有較強的免疫原性，局限表達于造血細胞起源細胞(如HA-1、HA-2)，或單一造血細胞系的mHags分子(如HB-1)，在體內(nèi)可誘導產(chǎn)生特異性細胞毒性T細胞，對白血病或淋巴瘤細胞發(fā)揮細胞毒作用，對非造血細胞無細胞毒作用，從而增強GVL效應，不增加GVHD風險，實現(xiàn) GVL效應與 GVHD的分離。利用mHags的特性，臨床應用包括:輸注mHags特異性T細胞進行過繼性免疫治療，mHags特異性T細胞受體(TCR)基因轉(zhuǎn)導以及mHags疫苗的開發(fā)。

7 腫瘤疫苗

腫瘤特異性抗原或腫瘤相關(guān)抗原可以作為腫瘤疫苗，刺激供者T細胞產(chǎn)生特異性的細胞毒性T淋巴細胞，通過特異性的免疫應答殺傷白血病細胞，發(fā)揮GVL作用，而不引起GVHD。目前發(fā)現(xiàn)的腫瘤特異性抗原有 P21、ras、bcr/abl、PML/RARα;腫瘤相關(guān)性抗原有蛋白酶3和WT-1(wilms瘤基因)。研究表明，白血病細胞高表達WT-1等非多態(tài)性腫瘤相關(guān)抗原。正常供者WT-1特異性CD8細胞毒性T細胞(CTL)比例很低，體外擴增的CTL可溶解人白血病細胞，抑制白血病克隆形成，抑制人白血病細胞植入NOD/SCID小鼠，對正常造血干細胞未見細胞毒作用。Bornhauser等給14例患者預防性地輸注由CML相關(guān)抗原肽段PR1、WT-1和ABL免疫產(chǎn)生的CTL，隨訪1年沒有發(fā)現(xiàn)GVHD或疾病的復發(fā)。

另外，細胞因子如白細胞介素、干擾素和腫瘤壞死因子等在GVHD發(fā)病及GVL的作用中也起到很重要的作用。國內(nèi)外其他研究和我們的研究都表明，細胞因子及細胞因子受體基因多態(tài)性同GVHD和/或移植預后顯著相關(guān)。細胞因子基因多態(tài)性直接影響個體體內(nèi)細胞因子的水平，而移植受者個體間的不同細胞因子水平將影響GVHD的發(fā)生與移植效果。動物研究表明，IL-11、IL-12、IL-18及角質(zhì)細胞生長因子(KGF)能選擇性地抑制T細胞介導的GVHD，同時保留GVL作用。細胞因子如IL-12、KGF等也可能作為GVHD與GVL的分離靶點。

總之，隨著近年來對移植免疫機制研究的深入，GVHD與GVL的分離策略不斷取得了新的進展，目前采取一系列臨床手段進行干預且取得了一定效果，但更多的手段仍處在體外實驗及在動物模型階段。采取何種方法用于臨床治療能最大程度地減少GVHD的發(fā)生，同時加強GVL效應，仍需進一步的研究。

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